通过诱导第2相反应防止电泳和氧化应激：诱导物修饰的Keap1传感器半胱氨酸的命运

摘要

本文描述了控制2期基因表达的分子机制，2期基因在保护有氧生活免受电泳物和活性氧中间体施加的无情压力方面发挥着核心作用：这是许多慢性疾病（包括癌症）的主要原因。许多第2相蛋白质是通过转录激活高度诱导的酶，对电泳和氧化损伤具有多功能、长效和催化保护作用。第2相蛋白质不仅包括“经典的”第2相外源代谢酶，如谷胱甘肽转移酶和UDP-葡萄糖醛酸转移酶，它们将外源物质与内源性配体结合，还包括NAD-（P）H:醌还原酶（NQO1）（EC 1.6.99.2）、环氧化物水解酶、血红素加氧酶1、铁蛋白、，γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽还原酶、醛脱氢酶、二氢二醇脱氢酶、白三烯B₄脱氢酶和谷胱甘肽S公司-共轭射流泵（参考文献中审查。1和2).

许多证据支持这样的观点，即诱导第二阶段反应是降低各种疾病风险的有效策略（有关综述，请参阅参考文献。2–4). 例如：(我)第2阶段反应被沉默的小鼠(编号2基因敲除）具有低且不可诱导的2期酶，对致癌物以及氧气和亲电试剂的毒性更敏感，并且与同源野生型小鼠不同，不能受到诱导物的保护(2,5–7). (ii（ii）)靶向破坏小鼠体内的两种2相酶（谷胱甘肽转移酶π和NQO1）增加了多环烃诱发的皮肤肿瘤的发病率(8,9). (三)基于量化小鼠肝癌细胞中NQO1活性的第2阶段诱导剂效力的生物测定，分离出了几种有效的抗癌诱导剂，包括西兰花中的萝卜硫烷，并指导了有效诱导剂的合成（综述见参考文献。2). (iv（四）)某些第2阶段酶的人类多态性更容易受到毒性和致癌作用的影响(10–13). （ν） 由于大量摄入黄曲霉毒素B，对极易发展为原发性肝细胞癌的个体使用2期诱导剂oltipraz₁，黄曲霉毒素2期代谢产物的排泄量显著增加，黄曲霉毒素是致癌物负荷的生物标志物(14).

2期基因的诱导子属于9个结构高度多样化的化学类别(15,16)和仅共享一些常见属性(17): (我)它们都具有化学反应性；(ii（ii）)几乎都是亲电体；(三)大多数是谷胱甘肽转移酶的底物；和(iv（四）)它们都可以通过烷基化、氧化或还原来修饰巯基。对这些特性的识别表明，细胞中含有一级传感器，该传感器配备有高活性半胱氨酸残基，可被诱导物识别和化学修饰，从而启动2期基因的增强转录。我们最近获得证据表明Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）可能是这种调节传感器(18)，这一结论得到了所附论文的有力支持(19)以及其他最近的研究(20,21).

2期基因受5′上游调控序列调控，这些序列被指定为抗氧化反应元件（are）(22,23). Nrf2是核碱性亮氨酸拉链转录因子NF-E2家族的成员，与ARE结合，并加速同源基因的转录(24–26). 在基础条件下，Keap1，一种最近发现的与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质，与Nrf2紧密结合，将该转录因子锚定在细胞质中，并以其为泛素化和蛋白酶体降解的靶点，从而抑制Nrf2诱导第2相基因的能力(27–32). 诱导子破坏Keap1-Nrf2复合体，使Nrf2转位到细胞核，在那里与其他碱性亮氨酸拉链蛋白的异二聚体组合中，它与第2相基因的ARE结合并加速其转录。

鼠Keap1的624个氨基酸包括25个半胱氨酸，并包含5个结构域(图1). 由于所有半胱氨酸残基都是保守的，因此对诱导至关重要的半胱氨酸的鉴定存在特殊问题。因此，我们采取了这样的策略：首先用21-甲磺酸地塞米松（Dex-mes）进行化学修饰，鉴定出活性最强的半胱氨酸，这是一种与硫醇不可逆反应的诱导剂，其次，检查这些残基的突变是否改变了Keap1抑制Nrf2功能的能力。纯化重组Keap1的四种半胱氨酸[C257、C273、C288和C297，均位于介导区（IVR）域]与Dex-mes反应最为强烈(18)这有力地表明Keap1是诱导剂的分子传感器。我们现在通过进一步分析Keap1的Dex-mes修饰胰蛋白酶肽，并通过引入这些半胱氨酸残基的系统突变，确定Keap1这些活性半胱氨酸巯基在信号诱导中的关键功能作用。

在单独的窗口中打开

图1。

Keap1五个结构域的氨基酸序列：(我)N末端区域（NTR，氨基酸1-60：两个半胱氨酸，蓝色）。(ii（ii）)BTB（广泛复合物，Tramtrack，Bric-a-Brac；氨基酸61-179：三个半胱氨酸，粉红色），一种进化上保守的蛋白质-蛋白质相互作用基序，通常与其他BTB结构域二聚体(33). (三)IVR（氨基酸180–314：八个半胱氨酸，黄色）。(iv（四）)双甘氨酸（DGR，氨基酸315-598：九个半胱氨酸，灰色），包含六个Kelch基序（氨基酸315-359、361-410、412-457、459-504、506-551和553-598）。重复的Kelch基序导致具有多个蛋白结合位点的β-螺旋桨结构(34). Keap1的DGR与Nrf2的Neh2片段（100个N末端氨基酸）紧密结合(24,27)，也是参与将Keap1锚定到肌动蛋白细胞骨架的区域(19). (v（v）)C末端区域（CTR，氨基酸599–624：三个半胱氨酸，绿色）。25个半胱氨酸残基以亮黄色突出显示，39个精氨酸残基为蓝色，17个赖氨酸残余物为红色。标记有地塞米松的胰蛋白酶肽（T-22、T-26、T-28、T-29和T-55）被指定。表1记录了所有57种胰蛋白酶肽（包括19种含有半胱氨酸残基的肽）的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱分析（见支持文本).

实验程序

构造。Keap1的每个Cys-to-Ala突变体都是通过PCR和标准重组技术产生的。通过测序证实了构建物的真实性。如前所述，pcDNA3或pET载体分别用于哺乳动物或细菌细胞表达(18). 本研究中用于基因分型和构建物制备的所有引物和PCR条件列于支持文本，作为支持信息发布在PNAS网站上。

keap1的生产(–/–)和组合keap1(–/–)：：nrf2(–/–)小鼠胚胎成纤维细胞。从13.5天龄的胚胎中分离出成纤维细胞基普1（–/–）和基普1(–/–)::编号2（–/–）小鼠，用于通过标准程序建立稳定系(35). 细胞保存在Iscove改良的Eagle's培养基中，补充10%热灭活FBS，37°C和5%CO₂.

功能报告分析。使用2×10的标准转染方法进行瞬时报告分析⁵ 小木桶(–/–)::编号2（–/–）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（K0N0）置于直径为60mm的培养皿中。每个质粒结构[2μg报告基因pNQO1AREluc、2μg pRLTK规范化载体、8μg pCMVmNrf2和各种数量（参见图4)通过磷酸钙共沉淀法将每个Keap1表达载体的总DNA用pcDNA3]调节为2μg导入K0N0 MEF细胞。两微克pRLTK质粒携带雷尼利亚在HSV-tk启动子/增强子控制下的荧光素酶基因包含在每次转染中，并用于归一化。转染24小时后采集细胞，并根据制造商的说明（Promega）测量荧光素酶活性。从六个独立的转染实验中获得了相对荧光素酶活性，并在每个图中显示为±SEM。

在单独的窗口中打开

图4。

野生型Keap1及其半胱氨酸突变体抑制K0N0小鼠胚胎成纤维细胞中ARE萤光素酶的萤光素酶发光强度。所有细胞均转染ARE-核糖核酸酶（2μg）和Nrf2（8μg）构建物。(一)作为野生型Keap1（黑条）数量的函数的发光抑制以及通过暴露于2μM莱菔硫烷（灰条）的逆转。(b条)野生型（WT）Keap1（2μg）和同等数量的以下突变体对发光的抑制：NTR（C23A和C38A）；CTR（C613A、C622A和C624A）；IVR C226A–C297A（C226A、C241A、C249A、C257A、C273A、C288A和C297A）；IVR C226A–C249A（C226A、C241A和C249A）；和IVR C257A–C297A（C257A、C273A、C288A和C297A）。(c（c）)Keap1单个或多个半胱氨酸突变体的抑制活性，每个表达载体100 ng。突变体的结构被指定为：+代表半胱氨酸，-代表丙氨酸。每个野生型和突变型Keap1的结构显示在条形图下方，表明其阻遏活性。如果C273或C288或两者都突变为丙氨酸，则抑制活性被取消。

非还原2D SDS/第页。HEK293电池（5×10⁵每60-mm培养皿）转染20μg pEFmKeap1。转染后（48 h），将培养基与含有250μM DTT的无血清培养基交换，培养细胞3 h。用PBS（5×）广泛洗涤后，将细胞暴露于诱导剂或载体，并在37°C、5%CO的培养基中培养₂持续6 h，最后用150μl RIPA缓冲液（10 mM Tris·HCl，pH 7.5/1%Nonide P-40/0.1%Nadeoxycholate/0.1%SDS/150 mM NaCl/1 mM EDTA）收集。样品用无DTT的SDS缓冲液煮沸，25μg蛋白质用非还原性圆盘凝胶（直径为2mm的圆盘）SDS/PAGE进行处理。凝胶在室温下用含5%2-巯基乙醇的1×SDS缓冲液喷射并还原1h，只需一次缓冲液更换。将圆盘凝胶插入第二个SDS/PAGE孔中并进行电泳。

免疫印迹。用兔抗mKeap1多克隆抗体检测Keap1(25,28). 为了使细胞数量正常化，用山羊抗拉明B抗体（圣克鲁斯生物技术公司）从相同提取物中检测到核拉明B。为了使转染效率正常化，使用山羊抗GFP抗体（Santa Cruz Biotechnology）检测来自与Keap1相同质粒的Bsd-GFP蛋白。用一级抗体封闭膜，然后用与辣根过氧化物酶（Zymed，Bio-Rad）结合的适当二级抗体进行反应。通过增强化学发光（Amersham Pharmacia）观察免疫复合物。

结果和讨论

Keap1最具活性半胱氨酸残基的鉴定及其对诱导子和Nrf2-结合活性的重要性。进一步验证了Keap1含有感应诱导物的高活性半胱氨酸硫醇(18)，我们用Dex-mes进行了额外的实验，这是一种诱导剂，可使硫醇不可逆地烷基化，并显著增加其质量（374.19个原子质量单位）。将均质重组Keap1（600 pmol）与适度过量的Dex-mes（6 nmol）在25°C和pH 8.0下孵育2 h。过量的Dex-mes通过凝胶过滤去除，变性蛋白用N个-乙基马来酰亚胺将未反应的硫醇烷基化。用反相高效液相色谱法分离胰蛋白酶肽，用基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF）MS分析组分。57个胰蛋白酶肽被指定为T-1至T-57。所有预测的19个含半胱氨酸的胰蛋白酶肽都在组分中回收（作为单肽或作为不完全裂解的二肽或三肽）。它们的质量与计算值在0.5个原子质量单位内一致（见表1，该表在PNAS网站上作为支持信息发布）。含有C257（T-22）、C273（T-25至T-28）、C288（T-28），C297（T-29）和C613（T-55）的肽（参见图1)发现与类固醇共价加成相对应的质量增加。所有其他含半胱氨酸的肽的质量增加了125.05个原子质量单位（对于每个半胱氨酸残基），表明通过N个-乙基马来酰亚胺。因此，与我们之前的发现一致，C257、C273、C288和C297都位于IVR结构域，以及C613，是天然Keap1中活性最强的半胱氨酸残基在体外(18).

Keap1的4种特异性半胱氨酸的可重复标记促使我们研究重组Keap1（其中这些半胱氨酸残基被丙氨酸取代）的性质。突变蛋白（C257A–C297A）在大肠杆菌并通过我们用于纯化野生型Keap1的程序纯化到同质性(18). 野生型和突变型蛋白质在天然和SDS/PAGE上迁移相同（分子量≈65000）。

结合率的比较[^三H] 通过氚掺入和二硫代氨基甲酸盐形成分别测量，Dex-mes和萝卜硫烷对纯化野生型和突变型（C257A–C297A）Keap1的反应速度较慢约50%，证实改性半胱氨酸确实是天然蛋白中反应最快的。

接下来我们研究了Keap1的四个最具活性的半胱氨酸残基是否影响与Nrf2的结合。在还原条件下，Keap1与Nrf2的Neh2（Keap1结合）结构域孵育，导致形成一种可由天然PAGE检测到的复合物(图2一). 在恒定Keap1浓度下，与络合物对应的谱带强度随着Neh2含量的增加而增加，在Keap1与Neh2的比值≈2:1时达到饱和。野生型和突变型Keap1都能与Neh2形成复合物，但基于带密度，突变蛋白对Neh2的亲和力低约50%(图2b条).

在单独的窗口中打开

图2。

野生型和突变型（C257A–C297A）Keap1与Nrf2 Neh2结构域结合的比较。(一)自然凝胶电泳显示Keap1（100 pmol）和Nrf2的Neh2结构域之间的复合物（分别为10、20、40和80 pmol，通道4-7和8-11）。Neh2 1巷；车道2，野生型Keap1；车道3，变异Keap1。车道4-7显示野生型Keap1和Neh2之间的复合物数量逐渐增加；通道8–11显示突变Keap1和Neh2之间的复合物形成量较低。箭头、箭头和星号分别显示Keap1、Neh2和Neh2-Keap1或突变Keap1复合带。(b条)Neh2与野生型Keap1（黑色条）和突变体Keap1（阴影条）之间的复合物带强度的密度定量。

两种不同的证据，即与诱导物的反应速率和与Neh2结构域的结合，表明IVR（C257A–C297A）中四个特定半胱氨酸残基发生突变的突变Keap1不仅与诱导物反应明显较慢，而且与Nrf2的Neh2域的亲和力也平行降低。这有力地证明了Keap1的这些半胱氨酸对Nrf2抑制的重要性。

keap1、nrf2或这两个基因均被破坏的小鼠胚胎成纤维细胞的制备和性质。通过全细胞转染分析进一步了解Keap1及其突变体的调节功能需要消除内源性Keap1和Nrf2干扰的细胞系。因此，我们从野生型胚胎成纤维细胞的原代培养中建立了细胞系，编号2-击倒（N0），基普1-敲除（K0）和K0N0小鼠(36) (图3一). 野生型细胞具有容易检测到的NQO1、谷胱甘肽和硫氧还蛋白还原酶的基础水平，暴露于1.5μM萝卜硫烷后，这些水平升高(图3b条). N0和K0N0细胞的这些成分含量较低，基本上不可减少。此外，在用萝卜硫烷治疗后，已经较低水平的谷胱甘肽进一步减少了>50%，很可能是因为与还原型谷胱甘苷直接结合(37). 与之形成鲜明对比的是，与野生型细胞相比，K0细胞的基础水平要高得多，并且在暴露于萝卜硫烷后基本上没有观察到诱导作用。这些发现证实了Keap1/Nrf2系统对这些第2期反应的基础和诱导表达的关键作用，并与Keap1对Nrf2的抑制作用一致。

在单独的窗口中打开

图3。

小鼠胚胎成纤维细胞系中2期基因产物的基因分型和表达水平keap1型（K0），nrf 2号机组（N0）或两个基因（K0N0）均被破坏。(一)PCR产物的电泳keap1型野生型（236 bp）和突变型（420 bp）等位基因，以及编号2野生型（734bp）和突变型（411bp）等位基因。(b条)NQO1和硫氧还蛋白还原酶的特异性活性以及三种突变型和野生型小鼠胚胎成纤维细胞无细胞提取物中谷胱甘肽的浓度的比较（归一化为野生型对照）。黑条，未经诱导剂处理的细胞；孵化条，细胞暴露于1.5μM萝卜硫烷24小时。

Keap1抑制ARE-和Nrf2依赖基因表达：Keap1半胱氨酸残基的突变。特异性半胱氨酸-丙氨酸突变对Keap1抑制Nrf2能力的影响在里面 活泼地通过小鼠胚胎成纤维细胞的瞬时转染实验检测基普1/编号2双基因敲除动物（K0N0）。用控制数量的三种载体瞬时转染K0N0细胞：(我)Nrf2表达载体（pCMVmNrf2）；(ii（ii）)表达Keap1野生型或突变体的载体；和(三)由NQO1的ARE控制的萤光素酶报告载体（pNQO1AREluc）(38). Keap1半胱氨酸残基突变对荧光素酶活性的影响提供了一种测量这种突变如何影响阻遏物功能的方法。

因为Keap1含有25个半胱氨酸残基，所以对所有可能的半胱氨酸残留物组合进行突变是不切实际的，因此我们在选定的结构域中突变了半胱氨酸。Keap1的BTB和DGR域（参见图1)参与二聚反应(33)和Nrf-2/actin结合(19,27)分别为；因此，我们没有在这些区域突变半胱氨酸残基。Keap1中产生了以下几组半胱氨酸到丙氨酸突变：(我)N端区域（NTR），即C23A和C38A(ii（ii）)C端区域（CTR），即C613A、C622A和C624A(三)IVR中的七种半胱氨酸，以及(iv（四）)这些残基的10种其他突变组合。对照细胞被“模拟”转染所有构建物，包括缺少Keap1 cDNA序列的Keap1表达载体。

在没有Keap1的情况下，转染细胞的荧光素酶报告子显示出高水平的发光(图4一). 与之前的研究一致(27)在恒定量的Nrf2存在下，野生型Keap1表达量的增加以浓度依赖性的方式抑制ARE驱动的报告荧光素酶活性，这种抑制被萝卜硫烷逆转(图4一). N-末端（NTR）或C-末端（CTR）结构域中所有半胱氨酸的突变对Keap1的阻遏物活性没有影响(图4b条). 因此，尽管C613被Dex-mes标记，但它显然对Keap1与Nrf2的结合并不重要。与之形成鲜明对比的是，Keap1突变株缺乏IVR的七个半胱氨酸残基（C226A–C297A）或四个半胱酶（C257A–C297 A），不能抑制荧光素酶报告子的表达(图4b条). 这一发现强烈表明Keap1的半胱氨酸残基对诱导剂反应最为强烈，也是那些影响Nrf2结合和抑制的残基。

接下来，我们对突变策略进行了改进，以关注IVR的上述七个半胱氨酸残基的不同组合的突变效果。C226A–C257A和C297A的突变同样不会干扰阻遏物的活性，C257A的突变也不会单独干扰阻遏物的活性。关键发现(图4c（c）)C273或C288（或两者）的缺失会消除阻遏活性。这两种半胱氨酸都与Dex-mes反应强烈。C273和C288两侧是碱性氨基酸（分别为RC273H和KC288E；参见图1)降低了他们的pK_一值显著增加，从而提高其反应性(39). 这些结果与最近的两项研究令人满意地一致：张和汉宁克(21)表明Nrf2依赖Keap1的泛素化需要C273或C288，而Levonen等人。(20)证明Keap1的活性巯基是亲电脂质氧化产物的靶点，C273或C288突变为丝氨酸使Keap1无法阻止Nrf2核转位。

C273或C288突变如何导致阻遏物功能丧失的问题，通过将表达每个突变的载体的混合物同时转染到报告系统的实验得到了进一步的阐明(图5). 引人注目的发现是，虽然每个Keap1突变体单独缺乏阻遏活性，但转染等量的这两种Keap1突变表达载体的混合物可导致阻遏物活性的实质性恢复。该观察结果支持Keap1作为二聚体的观点，并表明一个单体上同时存在C273和另一个单体内同时存在C288与阻遏活性兼容。

在单独的窗口中打开

图5。

野生型Keap1及其C273A和C288A突变体抑制K0N0小鼠胚胎成纤维细胞中ARE-荧光素酶发光强度。所有细胞均转染ARE-核糖核酸酶（2μg）和Nrf2（8μg）构建物。在不存在Keap1的情况下观察到的发光以100个单位表示。添加100 ng野生型Keap1质粒使发光降低至≈20%。编码C273A或C288A的质粒（100ng）对荧光几乎没有抑制作用，而这些质粒的混合物恢复了抑制活性。每个质粒50 ng的混合物抑制了约40%的系统发光。

第2相酶诱导物与细胞内Keap1结合形成分子间二硫键。我们之前的观察表明，Keap1与化学计量当量的二吡啶二硫醚反应生成了两种当量的吡啶硫酮(18)强烈建议试剂和蛋白质之间最初形成的混合二硫被Keap1的另一个高活性半胱氨酸巯基迅速还原，形成二硫键。为了确定诱导剂处理后Keap1的寡聚状态，我们首先用Keap1载体转染人类胚胎肾（HEK）293细胞，然后在无血清培养基中将细胞暴露于诱导剂中6小时。使用了三种不同类型的诱导剂，即迈克尔反应受体双（2-羟基亚苄基）丙酮、异硫氰酸盐萝卜硫烷和1,2-二巯基-3-硫酮。在暴露期结束时，对无细胞提取物进行2D SDS/PAGE(40)在第一维非还原条件下，在第二维还原条件下（2-巯基乙醇）。然后使用Western blot分析定位Keap1(图6). 在未诱导的细胞中仅检测到与单体Keap1对应的单一免疫反应产物。相反，抗Keap1抗体识别了经诱导剂处理的细胞提取物中的两种产物，对应于Keap1的单体和分子间二硫键二聚体(图6c（c）). 这一观察提供了强有力的独立证据，证明与诱导物的反应导致Keap1亚单位之间形成分子间二聚体。

在单独的窗口中打开

图6。

在HEK 293细胞中，暴露于诱导物会导致Keap1和GFP构建物编码的转染细胞形成Keap1的二硫键二聚体（正常化对照）。(一)无细胞提取物的2D SDS/PAGE的考马斯亮蓝（CBB）染色。(b条)对照细胞（第1和第2通道）和诱导处理细胞（第3和第4通道）的SDS/PAGE免疫印迹显示(顶部)与对照细胞相比，诱导处理细胞中抗Keap1抗体与Keap1的结合减少(中部)GFP的等式表达，以及(底部)根据拉明B的表达判断细胞数量相等(c（c）)对照细胞和暴露于三种不同化学类型的诱导物的细胞的提取物的2D SDS/PAGE的Keap1的免疫印迹。SF，萝卜硫烷；D3T，1,2-二巯基-3-硫酮；2-HBA，双（2-羟基亚苄基）丙酮。

Keap1的比较/Nrf2系统与氧化应激调节的其他基因和半胱氨酸硫醇基团的敏感性。尽管Keap1-Nrf2系统的行为在许多方面是独特的，但它类似于半胱氨酸残基被修饰的其他蛋白质的调节。原核转录因子OxyR和SoxR通过氧化被激活，从而分别形成分子内二硫键以响应过氧化氢和超氧物(41–44). 作为对氧化剂的反应，两个分子内二硫键形成，锌从氧化还原敏感的伴侣Hsp33中释放出来，导致大的构象变化，增加其对蛋白质折叠中间体的亲和力，从而保护它们免受氧化损伤(45,46). 蛋白质功能的调节也可以通过二硫键减少发生，例如控制细胞粘附和迁移的整合素的激活(47).

据我们所知，Keap1-Nrf2系统可能是独特的，因为它依赖于特定半胱氨酸硫醇的化学修饰，然后修饰剂似乎被分子间巯基二硫交换取代，从而形成Keap1的共价二硫二聚体。这个真核系统类似于来自腔色链霉菌(48–50). Keap1-Nrf2和RsrA-SigR都是信号转导通路的重要组成部分，通过上调系统解毒损伤剂、哺乳动物的第2阶段基因产物和硫氧还蛋白操纵子来保护机体免受氧化应激和电泳天竺葵。在基础条件下，Keap1和RsrA分别是转录因子Nrf2和SigR的负调控因子。氧化应激或暴露于诱导物会破坏复合物，使转录因子通过各自的增强子元件激活基因表达。即使在没有任何刺激的情况下，Keap1或RsrA编码基因的缺失也会导致转录因子的结构性激活和受其控制的基因的过度表达。有趣的是，Keap1的IVR在大小和半胱氨酸含量上与RsrA相似。Keap1和RsrA关键半胱氨酸的个别突变使其无法抑制其伴侣转录因子。在这两种情况下，这一发现完全出乎意料，因为野生型阻遏物在还原状态下是活跃的，并且不能通过突变参与的半胱氨酸残基形成二硫键，预计会将阻遏剂锁定在其组成活性形式。

这两个系统呈现出类似的悖论：(我)阻遏物是信号的传感器，因此是导致诱导的信号转导途径中不可或缺的成分，但如果它们不存在（即被敲除），相同的诱导基因，而不是不可诱导的，则构成上调；(ii（ii）)特定的半胱氨酸必须能够形成二硫键以进行阻遏活性，但二硫键的形成会导致阻遏的释放，指出这些半胱氨酸不仅对诱导物传感很重要，而且对两个伙伴（阻遏物/转录因子）分子之间的直接相互作用也很重要。例如，通过二硫键的形成对其进行修饰，可以导致构象变化，从而不允许发生结合。在RsrA中，关键半胱氨酸参与锌配位，锌配位控制RsrA的硫醇-二硫化物反应性，锌在氧化过程中被排出，伴随着二硫键的形成，从而导致主要构象变化，不允许与SigR结合。可以想象，每个单体的C273和C288都参与金属配位，除了这些半胱氨酸与碱性氨基酸残基的接近性外，还可以稳定硫代阴离子上的负电荷，降低其pK_一并解释其异常高的反应性。

总结。这些结果与中所示的模型一致图7在基本（还原）条件下，Keap1以二聚体的形式存在，其中两个单体可能通过其BTB结构域通过疏水相互作用相互结合。中间区域的半胱氨酸C273和C288处于还原状态。在这种构象中，Keap1将Nrf2的一个分子隔离在细胞质的两个DGR结构域之间，并通过靶向蛋白酶体确保其快速转换。暴露于诱导剂后，反应性C273和C288残基形成分子间二硫键，从而共价连接Keap1的两个单体。由此产生的构象分离DGR结构域，释放Nrf2，并允许其易位到细胞核并增强2期基因的表达。

在单独的窗口中打开

图7。

第二阶段反应的调节机制。Nrf2（黑色）通过与Keap1的两个分子相互作用保留在细胞质中，Keap1通过其BTB结构域（粉红色）二聚并通过Kelch或DGR区域（灰色螺旋桨）锚定在肌动蛋白细胞骨架上。第2相反应的诱导子与Keap1中间区域（IVR，黄色）的半胱氨酸巯基相互作用，导致形成二硫键（很可能在一个单体的C273和另一个单体的C288之间）。这导致构象变化，使Keap1无法与Nrf2结合，然后Nrf2易位到细胞核。Nrf2与其他转录因子如小分子Maf等异二聚体结合，与2期基因的ARE调节区结合并增强其转录。

补充材料

鸣谢

笔记

缩写：ARE，抗氧化反应元件；NQO1，烟酰胺醌氧化还原酶1，NAD（P）H：醌受体氧化还原酶1；K0N0、，编号2/基普1双淘汰赛；地塞米松21-甲磺酸；Keap1，Kelch-like ECH-associated protein 1；IVR，Keap1的干预区；C257A、C257被丙氨酸取代；C257A–C297A，C257到C297的所有半胱氨酸残基均被丙氨酸取代。

工具书类