肝损伤中间皮细胞通过间皮-间充质转化产生肝星状细胞和肌成纤维细胞

培养中的间皮-间充质转变。

为了鉴定肝脏MC，我们使用抗GPM6A抗体和磁珠从成人肝脏中分离出MC。这种方法使我们能够分离出1.2–1.4×10⁵来自五只小鼠的MC。隔离的MC以2×10的密度进行电镀⁴24孔板每孔的细胞数，在2–3天内缓慢粘附。电镀的MC形成上皮细胞集落，并在1周内汇合(图2A类). 从电镀后1周起，一些MC失去上皮细胞极性，变成成纤维细胞(图2A类). 两次传代后，上皮细胞和成纤维细胞都没有附着在培养皿上并存活下来。

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图2。

肝MCs的原代培养。使用抗GPM6A抗体和磁珠从正常成人肝脏中纯化MC。(A类)原发性肝MCs的形态学。(B类)MC、上皮细胞、间充质细胞和EMT标记物的QPCR。原代MC在培养中降低MC和上皮细胞标志物的表达，同时增加间充质细胞标志物。五十、 肝细胞；N、 GPM6A（加仑/分）⁻人口*P（P）< 0.05,^†P（P）与孤立MC（第0天）相比，<0.01。

培养的MCs显示两种MC标记物的mRNA表达降低(Gpm6a公司,Pdpn公司,200加元、和重量1)和上皮细胞标记物(Gja1公司,Tjp1型、和Krt8（Krt8）) (图2B类). 与肝MCs中CDH1缺乏表达一致(图1G公司)，mRNA表达水平加拿大存托凭证1在培养的MC中几乎检测不到(图2B类). 培养的MCs增加了学报2,第1a1列、和设计(图2B类)表明从上皮细胞到间充质细胞的表型发生了变化。表达的MC维姆在正常肝脏中(图1G公司)，但该mRNA表达在培养中降低(图2B类). EMT驱动基因包括蜗牛和扭曲在MC中弱表达，但在整个培养期间该表达没有上调(图2B类). 分离的MC继续表达玻璃纤维蛋白1和Tgfb3型(图S2A类). 培养的MCs增加了Egfr公司(图S2A类). MCs下调铂族锡在文化中，他们没有表达血红蛋白(图S2A类). 培养的MCs没有增加阿尔布,抄送31,抄送68、和45加元(图S2A类). 这些数据表明肝MCs在体外自发分化为间充质细胞。由于MCs在正常肝脏中同时表达上皮细胞和间充质细胞标记物，我们将MCs向间质细胞的转化描述为MMT而非EMT。

TGF-β诱导肝细胞MMT。

测试已知的EMT诱导物，如EGF、HGF、AngII、TGF-β、维甲酸（RA）、WNT3A和DKK1（WNT抑制剂）(4,22)，促进肝脏MCs向间充质细胞的转化，我们用这些因子中的每一个处理原代培养的MCs 4天（从第1天到第5天）。TGF-β最显著地抑制MC标记(Gpm6a公司)同时诱导间充质细胞标记物(学报2,第1a1列、和维姆) (图3A类). TGF-β也抑制上皮细胞标记物的表达(Gja1公司和Tjp1），但不是Krt8型(图3A类).

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图3。

体外TGF-β将MCs转化为间充质细胞。原代MC在细胞因子和化学抑制剂存在或不存在的情况下培养。(A类)用指示因子治疗4天（从第1天到第5天）的MC的QPCR。TGF-β诱导间充质细胞标记物表达，同时抑制Gpm6a公司和许多上皮细胞标记物（不是Krt8）. *P（P）< 0.05,^†P（P）与未经治疗的MC相比，<0.01（c，对照组）。(B类)TGF-β和/或抑制剂处理MCs 7d后的QPCRGpm6a公司TGF-β弱抑制上皮细胞标记物的表达，包括Krt8（Krt8）SB431542（SB43:TGF-βR1抑制剂）抑制TGF-？对MC的影响。SIS3（SMAD3抑制剂）抑制TGF-β诱导的MCs中间充质细胞标志物的上调*P（P）< 0.05,^†P（P）与未治疗相比，<0.01。^§P（P）< 0.05,^¶P（P）与TGF-β治疗相比<0.01。(C类和D类)经TGF-β和/或抑制剂处理7天的培养MCs的形态和表型变化。SB431542在TGF-α存在的情况下保持MCs的上皮形态和表型。SIS3通过TGF-β部分阻断MCs的形态和表型变化。

为了剖析MCs中TGF-β信号通路，我们在多种抑制剂存在下用TGF-Gpm6a公司和上调学报2和第1a1列由TGF-β引起(图S2B类). SMAD3的一种化学抑制剂（SIS3）也抑制了学报2和第1a1列对表达无影响Gpm6a公司(图S2B类). 已知p38、JNK和ERK-MAP激酶参与非经典TGF-β途径(23). p38抑制剂（SB203580）弱下调学报2由TGF-β诱导(图S2B类). MEK抑制剂（U0126）部分阻断TGF-β对学报2JNK、mTOR或PI3K抑制剂可减少MC的增殖并增加学报2在TGF-β的存在下。这些数据表明，典型的TGF-β途径参与了MC向间充质细胞的转化。

为了分析TGF-β/SMAD3途径，我们在有或无化学抑制剂的情况下，从第2-9天开始用TGF-？治疗MCs。TGF-β长期治疗抑制MC和上皮细胞标记物的表达(Gpm6a公司,Gja1公司,Tjp1型、和Krt8（Krt8）)同时诱导间充质细胞标志物(学报2,第1a1列、和维姆) (图3B类). 在TGF-β的存在下，MC从上皮形态转变为间充质形态(图3C类). SB431542阻断了间充质细胞标记物的增加表达以及MC和上皮细胞标记物在TGF-β存在或不存在时的减少表达(图3B类–D类)表明自分泌TGF-β信号也诱导MC获得间充质表型。虽然在较小程度上，SIS3在TGF-β的存在下逆转了MC向间充质细胞的转化(图3B类). SIS3治疗实际上将MC的形态改变为扁平上皮细胞(图3C类和D类).

Wt1的细胞谱系分析⁺肝脏MC。

在原代MC培养期间，受污染的成纤维细胞可能生长并分化为ACTA2⁺间充质细胞独立于MC的MMT。为了排除这种可能性，我们使用Cre-loxP系统追踪MC血统。我们发现一些MC在成人肝脏表面特异性表达WT1(图S3A类). 重量1^{绿色荧光蛋白Cre}敲除小鼠在MCs中也表现出GFP的特异性表达(图S3B类). 有条件地跟踪WT1⁺MC，我们使用Wt1^{CreERT2公司}敲入和R26mTmG^弗洛克斯（R26T/G^（f）)老鼠(图4A类). Wt1^{CreERT2公司}敲除小鼠表达Cre和ERT2的融合蛋白重量1基因位点(13). 在三苯氧胺（TAM）处理后，CreERT2从R26T/G中删除番茄序列^（f）基因座和不可逆诱导膜标记GFP表达(24). 成人注射TAM后Wt1^CreERT2型;R26吨/加仑^（f）小鼠，14.5%的MCs将番茄在肝脏表面的表达转化为GFP(图4B类). 然而，Wt1^{CreERT2公司};R26吨/加仑^（f）未注射TAM或Wt1的小鼠⁺;R26吨/加仑^（f）注射TAM的小鼠未激活GFP表达(图S3C类)，验证了TAM对GFP表达的严格控制。

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图4。

CCl的条件MC谱系分析₄-诱导的肝纤维化。(A类)注射TAM后，Wt1⁺MCs选择性地将番茄在Wt1中的表达转化为膜标记GFP^{CreERT2公司};R26吨/加仑^（f）小鼠肝脏。(B类)注射TAM后1周肝脏GFP免疫染色。只有MC表示GFP（箭头）。(C类)TAM注射标记MCs后，CCl诱导肝纤维化₄注射1–30次。为了抑制TGF-β信号传导，用CCl处理小鼠₄注射12次，每3d注射STR（TGF-βR2 Fc嵌合物）或IgG对照(D类)对肝脏进行GFP、DES和ACTA2的免疫染色。双箭头表示GFP⁺MC分化为DES⁺活性剂2⁻单次注射CCl后1天的HSC₄箭头和箭头表示DES⁺GFP公司⁺和ACTA2⁺GFP公司⁺肌成纤维细胞。无第一抗体的免疫染色用作阴性对照。(E类)注射CCl后GFP和ACTA2的免疫染色₄30次。GFP公司⁺MC（箭头）从肝表面向内迁移，并在纤维化隔膜中共存ACTA2（箭头）。cv，中央静脉。(F类)注射CCl后GFP和DES的免疫染色₄与STR或对照IgG共处理12次。箭头表示DES⁺GFP公司⁺来源于MCs的肌成纤维细胞。用DAPI对细胞核进行复染。（比例尺，10μm）(G公司)GFP的百分比⁺所有GFP中的肌成纤维细胞⁺对照组（IgG）和治疗组（STR）的细胞包括MC和肌成纤维细胞。结果为三只小鼠的平均值±SD**P（P）< 0.01.

将MC标记为GFP之后⁺Wt1中的单元格^{CreERT2公司};R26吨/加仑^（f）我们通过TAM分离了这些MC，并在培养中追踪了它们的表型。电镀后，38.3%的培养MCs在上皮细胞集落中表达GFP(图S4A类). GFP百分比的差异⁺组织中MC（14.5%）与培养中MC（38.3%）的差异可能是由于MC对培养皿的粘附性不同，或者是由于MC分离时肝脏表面的部分消化。在培养中，两种GFP⁺和GFP⁻MC表达PDPN(图S4B类). 部分GFP⁺和GFP⁻MCs开始表达ACTA2，TGF-β治疗诱导所有GFP中ACTA2表达⁺或GFP⁻单元格(图S4C类)，证明MC在体外分化为间充质细胞。为了排除TAM激活HSC中GFP表达的可能性，我们从TAM处理的Wt1中分离出HSC^{CreERT2公司};R26吨/加仑^（f）小鼠，并证实在储存维生素A的HSC中没有GFP表达(图S4D类).

MCs引起CCl中的HSC和肌成纤维细胞₄-诱导性纤维化。

接下来，我们追踪了Wt1的血统⁺纤维化肝脏中的MC。将MC标记为GFP后⁺TAM诱导肝纤维化，注射CCl诱导肝纤维化₄1-30次(图4C类). 单次注射CCl后一天₄、GFP⁺MC开始从肝表面向内迁移并表达DES，但不表达ACTA2(图4D类，双箭头）。单次注射后3天，GFP的22.7%⁺肝内细胞开始表达ACTA2，三次CCl后表达率增至89.5%₄注射(图4D类，箭头），表明CCl导致的肝损伤₄进一步诱导MC衍生的HSC向肌成纤维细胞的转分化。30次注射后，纤维间隔由ACTA2组成⁺间皮和中央静脉之间可见肌成纤维细胞(图4E类). 活性剂2⁺GFP公司⁺在离肝表面150μm深处可以看到肌成纤维细胞，并且没有GFP⁺超过此距离的单元格。尽管ACTA2的2.0%⁺肌成纤维细胞在全肝切片中共表达GFP，在150μm深的表面积内，比例增加到11.5%，表明MC对肌成纤维纤维细胞的贡献仅限于近肝表面。假设TAM标记MC的效率为14.5%，约为ACTA2的79%⁺肌成纤维细胞可能来源于离肝表面150μm深处的MC。GFP⁺纤维隔膜中的细胞共表达DES和I型胶原(图S5A类). 没有GFP⁺CCl前后的肝细胞、胆管细胞或内皮细胞₄治疗。注入矿物油而非CCl₄未诱发MC的MMT(图S5B类). 我们还确认CCl₄治疗未诱导Wt1中GFP的表达^{CreERT2公司};R26吨/加仑^（f）未注射TAM或TAM治疗Wt1的小鼠⁺;R26吨/加仑^（f）老鼠(图S5B类). 总的来说，这些数据表明在CCl期间₄-在诱导纤维化的过程中，MCs从肝脏表面向内迁移，产生HSC，然后产生肌成纤维细胞，并形成连接间皮和中央静脉区域的纤维化隔膜。

验证R26T/G中的结果^（f）小鼠，我们还使用了R26lacZ^（f）报告鼠(25)在纤维生成过程中追踪MC。TAM注射Wt1后^{CreERT2公司};26lacZ兰特^（f）小鼠，我们专门将MC标记为LACZ⁺在肝脏表面(图S6A类和B类). 遵循CCl₄注射后，不仅在MC中检测到LACZ信号，在ACTA2中也检测到⁺或DES⁺MCs下的肌成纤维细胞(图S6C类–F类)验证了我们关于MC分化为ACTA2的结论⁺肝纤维化过程中的肌成纤维细胞。

TGF-β信号传导的拮抗抑制MC的迁移和分化。

鉴于TGF-β被证明与培养的MCs MMT有关，我们测试了TGF-α信号的抑制是否抑制CCl中MCs的MMT₄模型。先前研究表明，可溶性TGF-βR2（STR）可拮抗TGF-α1和TGF-γ3，从而抑制小鼠肝纤维化(26). 如中所述图4C类，我们将MC标记为GFP⁺通过TAM，通过CCl诱导纤维化₄与对照组相比，STR治疗降低了GFP的数量⁺肝脏内的肌成纤维细胞(图4F类). GFP百分比⁺所有GFP中的肌成纤维细胞⁺包括MCs和肌成纤维细胞在内的细胞从41.4%（IgG）显著减少到24.2%（STR）(图4G公司). 这些数据表明，在纤维化中，TGF-β信号通路参与MC向肌成纤维细胞的迁移和分化。

胆道纤维化中MC分化为HSC。

接下来，我们测试了MCs在胆管结扎（BDL）诱导的胆道纤维化中的分化潜能(图5A类). BDL后一周，GFP的4.5%⁺MC开始从肝脏表面迁移(图5B类，双箭头）。GFP公司⁺细胞也位于肝窦，在肝表面附近表达DES(图5B类，箭头）。BDL后三周，GFP⁺DES公司⁺HSC表现出树突过程，这是HSC的一个独特特征(图5C类). GFP⁺HSC表达VIM和GFAP(图5C类). 与CCl相比₄模型，BDL模型在3周内未诱导间皮下纤维化，MC-derived GFP⁺HSC未获得肌纤维母细胞表型；具体来说，他们不表达ACTA2(图5D类). 肝间皮到GFP的平均距离⁺BDL后1周，HSC从12.9±8.6μm（最大24μm）增加至3周时的33.1±19.1μm（最小132μm）。我们证实，在未经TAM治疗的小鼠中，BDL单独不能激活GFP表达(图S7A类).

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图5。

胆道纤维化中MC向HSC的分化。(A类)在Wt1中标记MC后^{CreERT2公司};26吨/克^（f）用TAM注射小鼠，用BDL诱导胆道纤维化。(B类–D类)免疫染色。双箭头表示GFP⁺DES公司⁺MCs，似乎在BDL后1周开始从肝脏表面向内迁移(B类)和GFP⁺DES公司⁺具有树突过程的HSC(C类). 箭头表示GFP⁺表达DES、VIM或GFAP的HSC。(D类)箭头和星号表示ACTA2⁻GFP公司⁺HSC和ACTA2⁺静脉中的平滑肌细胞。用DAPI对细胞核进行复染。[比例尺，10μm(B类和C类)和100微米(D类).]

我们还测试了TGF-β信号在胆道纤维化MCs MMT中的作用。如中所述图S7B类，我们将MC标记为GFP⁺细胞，给小鼠接种BDL，每3天用STR或对照IgG处理一次。与CCI中的观察结果类似₄模型中，STR处理抑制了MC的迁移(图S7C类)以及GFP的百分比⁺所有GFP中的HSC⁺肝脏中的MC和HSC从33.9%（IgG）显著降低到8.0%（STR）(图S7D类).

组织学分析。

用4%（wt/vol）多聚甲醛或70%（vol/vol）乙醇固定组织并制备冰冻切片(8). 免疫染色中使用的抗体列于表S1用荧光染料结合的二级抗体检测一级抗体。用DAPI对切片进行复染。番茄荧光用3%H漂白₂O（运行）₂免疫染色前在甲醇中30min。通过X-gal染色或免疫组织化学检测LACZ的表达(7). X-gal染色后，用抗DESMIN抗体和SuperPicture Polymer检测试剂盒（Invitrogen）对切片进行免疫染色。切片在显微镜下可视化，图像由数码相机（尼康）拍摄。

MC的分离和培养。

在37°C下，用1 mg/mL pronase（Roche）在DMEM/F-12培养基中对整个肝叶进行部分消化20分钟，轻轻摇晃，然后在1700×克将细胞悬浮在含有10%FBS的DMEM中5分钟。洗涤三次后，将细胞与抗Gpm6a抗体以1500倍的稀释度在DMEM中和4°C孵育15分钟。离心后，用抗鼠IgG微球培养细胞，并根据其指示用autoMACS（Miltenyi Biotech）纯化。在含有10%FBS、ITS（Gibco）和50 ng/mL氢化可的松的低葡萄糖DMEM中的胶原蛋白涂层培养皿上培养MC。用10 ng/mL TGF-β1（T1654；Sigma）、20 ng/mL HGF（H1404）、10⁻⁶在存在或不存在以下化学抑制剂的情况下，M AngII（A9525）、1μM RA（R2625）、0.01%乙醇、50 ng/mL EGF（EA140；Chemicon）、100 ng/mL WNT3A（1324；R&D Systems）或100 ng/mL DKK1（5897）：5μM SB431542（04-0010；Stemgent）、10μM SIS3（566405；Calbiochem）、10µM SB203580（559389）、10¦ΜM JNK抑制剂II（420128）、，10μM U0126（9903；细胞信号）、100 nM雷帕霉素（9904）或0.1%二甲基亚砜。

我们感谢Hidekazu Tsukamoto博士的专家建议和指导，感谢Irving Garcia、Raul Lazaro、Kiki Ueno和Bin Xie的技术援助，感谢Bin Zhou和William Pu提供Wt1小鼠。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01AA020753、拨款P50AA011999的试点项目资金、拨款P30DK048522和拨款R24AA12885的支持。