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临床癌症研究。作者手稿；PMC 2014年1月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2013年1月1日；19(1): 279–290.
2012年10月22日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1078-0432.CCR-12-1558
预防性维修识别码：项目经理3567921
NIHMSID公司：NIHMS415798标准
PMID：23091115

上皮-间充质转化（EMT）基因特征预测对EGFR和PI3K抑制剂的耐药性，并将Axl确定为克服EGFR抑制剂耐药性的治疗靶点

劳伦·艾弗里特·拜尔斯,1 李霞刁,2 王静（音译）,2 皮埃尔·桑提尼,1 吕克·吉拉德,10 迈克·佩顿,10 李深,2 范友红,1 乌玛·吉里,1 Praveen K.Tumula公司,1 莫妮克·尼尔森,1 Jayanthi Gudikote公司,1 海Tran,1 罗伯特·卡德内尔,1 大卫·J·熊,11 史蒂文·华纳,11 杰森·福克斯,12 史蒂文·坎纳,12 瓦尔沙·甘地,8 南希·克雷特,13 史蒂文·罗森,13 爱德华·S·金,1 罗伊·S·赫伯斯特,1 乔治·布鲁门谢恩（George R.Blumenschein）,1 J.杰克·李,三 斯科特·利普曼,1 Kian Ang（起安）,4 戈登·B·米尔斯,5 Waun K.Hong公司,9 约翰·N·温斯坦,2,5 伊格纳西奥·维斯图巴,6 凯文·库姆斯,2 约翰·D·明纳,10和约翰·海马赫1,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

目的

EMT与转移扩散和EGFR抑制剂耐药性相关。我们使用来自四个平台的基因表达谱，使用非小细胞肺癌细胞株和BATTLE研究中治疗的患者，开发并验证了一个稳健的76-基因EMT特征。

方法

我们使用非小细胞肺癌患者的细胞系和肿瘤进行了综合基因表达、蛋白质组和药物反应分析。利用非小细胞肺癌细胞系和BATTLE（生物标记物整合靶向治疗肺癌）研究中接受治疗的患者的四个微阵列平台的基因表达谱，开发并验证了76基因EMT特征，并确定了与EMT相关的潜在治疗靶点。

结果

与上皮细胞相比，间充质细胞对EGFR和PI3K/Akt途径抑制剂的抵抗力显著增强，与EGFR突变状态无关，但对某些化疗更敏感。间充质细胞也表达了受体酪氨酸激酶Axl水平的增加，并显示出对Axl抑制剂SGI-7079更为敏感的趋势，而SGI-7079+erlotinib联合使用可逆转表达Axl的间充质系和间充质非小细胞肺癌异种移植模型中erlotinin的耐药性。在非小细胞肺癌患者中，EMT特征可以预测接受厄洛替尼治疗的患者8周内的疾病控制，但不能预测其他治疗。

结论

我们开发了一个强大的EMT特征，预测对EGFR和PI3K/Akt抑制剂的耐药性，强调上皮细胞和间充质细胞的不同药物反应模式，并将Axl确定为克服与间充质表型相关的EGFR抑制剂耐药性的潜在治疗靶点

关键词：肺癌、EMT、EGFR抑制、PI3K抑制、Axl

简介

以前的分子剖析研究和最近的突变分析已经证明了非小细胞肺癌（NSCLC）的分子异质性。对于EGFR突变体和EML4-ALK融合亚组，突变状态分别预测对EGFR抑制剂或ALK抑制剂靶向治疗的反应。不幸的是，只有少数患者表达这些标记物，约10-15%的肺腺癌检测到EGFR突变(1-6)和EML4-ALK融合约4%(7). 对于大多数野生型患者表皮生长因子受体，一个亚组似乎受益于EGFR抑制剂治疗，尽管目前还没有有效的标记物来识别这些患者(8-10). 因此，需要验证的预测标记来准确预测EGFR靶向治疗的获益可能性，而不依赖于EGFR突变状态，也不依赖于其他靶向治疗。

上皮-间充质转化（EMT）是在包括非小细胞肺癌在内的几种上皮癌中观察到的一种生物程序。EMT与细胞粘附蛋白如E-钙粘蛋白的丧失以及侵袭、迁移和细胞增殖的增加有关(11-14). 临床前和临床数据表明，EMT标记物可能与EGFR抑制剂的有限反应相关，而上皮表型的保留与反应相关，即使在没有EGFR受体突变的患者中也是如此(15-18). 例如，高E-钙粘蛋白和低波形蛋白/纤维连接蛋白(即上皮表型）与厄洛替尼在野生型细胞系和异种移植物中的敏感性有关表皮生长因子受体(16). 临床上，E-cadherin蛋白表达与厄洛替尼联合化疗后较长的进展时间和较长的总生存期相关，尽管表皮生长因子受体本研究中患者的突变状态未知(15). 识别未经历EMT的肿瘤的能力可能有助于选择最有可能受益于EGFR抑制的患者，尤其是野生型EGFR患者。此外，靶向EMT可能逆转或阻止对EGFR抑制剂的治疗耐药性的获得，如一项研究所示，NSCLC细胞系中上皮表型的恢复恢复了对EGFR抑制物吉非替尼的敏感性(19). 虽然许多标记物与EMT相关，EMT特征在其他癌症类型中也有描述，但在非小细胞肺癌中没有有效的EMT特征。此外，EMT在多大程度上预测非小细胞肺癌对其他靶向药物的反应尚不清楚。

为了更好地描述非小细胞肺癌中的EMT及其与药物反应的关系，我们从几个微阵列平台对基因表达谱进行了综合分析，并结合高通量功能蛋白质组谱。通过在我们的NSCLC细胞系训练集中交叉验证来自两个独立微阵列平台的基因表达数据，我们能够获得一个强大的EMT基因表达特征，该特征能够分类NSCLC细胞系是否经历了EMT。我们还对EMT基因特征和关键致癌途径的高通量蛋白质组分析进行了综合分析，以探讨上皮细胞系和间充质细胞系之间的信号通路差异。最后，我们测试了EMT特征在临床前模型和患者肿瘤样本中预测厄洛替尼和其他药物疗效的能力。

材料和方法

细胞系

NSCLC细胞系由美国国家癌症研究所和德克萨斯大学西南医学中心的John D.Minna和Adi Gazdar建立(20,21)或从ATCC获得）。细胞培养条件的详细信息见补充信息.

细胞系的表达谱分析

从细胞系中分离出总RNA，并按补充信息.

单个最佳EMT标记探针的选择

由于非小细胞肺癌细胞株面板在Affymetrix和Illumina微阵列平台上都进行了分析，因此我们能够为CDH1、VIM、CDH2和FN1基于它们与微阵列平台内和/或跨平台内同一基因的其他探针的强相关性(补充图1). 补充信息中提供了详细信息。

BATTLE肿瘤的基因表达谱分析

对BATTLE临床试验期间收集的肿瘤进行微阵列分析，详见补充信息.

细胞系药物敏感性

对于每种药物，抑制50%生长所需的浓度（IC50)在来源于治疗幼稚患者的NSCLC细胞系中，通过MTS测定测量≥3次，平均值用于分析，如前所述和补充信息(22).

AXL抑制剂SGI-7079的制备与表征

SGI-7079代的详细信息见补充图2和补充信息为了证明SGI-7079对Axl激活的抑制作用，用含有人类Axl基因的1 mg FLAG标记质粒（OriGene Technologies，Rockville，MD）通过电穿孔瞬时转染HEK-293细胞，并允许在标准培养基+10%FBS中培养24小时。在指定的浓度下，用SGI-7079处理细胞10分钟。裂解前5分钟，用含有WI38条件培养基的Gas6刺激细胞。用抗FLAG M2琼脂糖（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）对FLAG标记的Axl进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗PY20-HRP或抗Axl（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）进行蛋白质印迹。p-Axl=酪氨酸磷酸化Axl。

蛋白质反相阵列和Western blot分析

如前所述和补充信息(23).

动物研究

小鼠取自查尔斯河实验室。所有动物研究均按照机构批准的方案进行，并符合NIH关于动物护理和福利保障的指南。这些方法的详细描述包括在补充信息.

结果

76基因EMT信号将NSCLC细胞系分为不同的上皮和间充质组

使用Affymetrix U133A、U133B和Plus2.0阵列上的54个NSCLC细胞株的训练集，我们基于两个标准选择EMT基因表达特征的基因，旨在提高特征在不同平台上的鲁棒性和潜在适用性。首先，我们确定了其mRNA表达水平与四个假定EMT标记中至少一个的单个最佳探针呈正相关或负相关的基因-卡德林(CDH1型)，波形蛋白(VIM公司)，N-钙粘蛋白(CDH2公司)和/或纤维连接蛋白1(FN1型)（请参见补充信息详细信息）。这些标记物是根据其在肺癌和其他上皮性肿瘤中作为EMT标记物的作用来选择的(15,16,24). 从这组基因中，我们只选择那些mRNA表达在细胞系中遵循双峰分布模式的基因（双峰指数>1.5）(25). 通过将EMT信号限制在细胞系中相对较高或较低水平（而非介于两者之间）表达的基因，我们期望增加信号将患者肿瘤分为不同上皮和间充质组的可能性。

使用这种方法，我们鉴定了76个独特的基因（EMT特征），其表达水平为(1)与已知EMT标记和(2)双峰分布(图1,补充表1). 签名中的大多数基因（63/76）与CDH1型和/或VIM公司相反，只有10/76个特征基因与FN1型和3/76CDH2.CDH2自身不符合非小细胞肺癌细胞双峰分布的标准，因此不包括在最终的76-基因特征中。

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EMT基因表达特征将非小细胞肺癌细胞株分离为不同的上皮样和间质样组，独立于微阵列平台

（A）利用基因（行）之间的皮尔逊相关距离、细胞系（列）之间的欧几里德距离和沃德连锁规则，通过双向层次聚类法对与EMT特征基因相对应的Affymetrix探针进行聚类。NSCLC细胞系在树状图的第一个主要分支处分离为不同的上皮（绿色条）和间充质（红色条）组。的突变状态表皮生长因子受体和KRAS公司由热图上方的颜色条指示（深蓝色=突变，浅蓝色=野生型，白色=未知）。EGFR突变仅见于上皮组。KRAS公司突变在间充质细胞组中更常见，并且表达更高水平的FN1型和FN1型-相关基因。（B）细胞系分类在不同平台上是一致的，但H1395除外，当在Illumina WG v2平台上排列时，H1395从上皮组转换为间充质组。第一主成分分析显示Affymetrix和Illumina平台上的上皮和间充质组分离良好。（C）EMT特征表现为上皮细胞或间充质细胞的细胞系之间存在形态特征差异。（D）在第三个平台（Illumina WGv3）上分析的39个独立非小细胞肺癌细胞株中，EMT特征通过层次聚类和主成分分析将细胞株分为不同的上皮（绿色）和间充质（红色）组。

然后，我们使用层次聚类和主成分分析来分析训练集中EMT签名的表达。基于特征基因表达的NSCLC细胞系聚类将其分为不同的上皮细胞（n=34/54细胞系）和间充质细胞（n=20/54）组(图1A). 间充质组的细胞系表达较高水平的EMT转录因子激活的基因ZEB1/2号机组和/或蜗牛1/2，包括基质金属蛋白酶-2(基质金属蛋白酶2) (26,27),波形蛋白(28-30)、和ZEB1号机组自身（目标蜗牛) (31). 与这些发现一致，间充质细胞系也表达了明显较高水平的TGFB1型，诱导剂蜗牛。AXL公司，一种受体酪氨酸激酶，在接受EMT治疗的乳腺癌和胰腺癌中过度表达(32-34)在间充质非小细胞肺癌细胞中也有较高表达。相比之下，上皮细胞系受ZEB1号机组和蜗牛，例如CDH1型(28,29,31,35)，囊泡蛋白RAB25型(36),粘液1(31)、和克劳丁4(第4类)和7(CLDN7号机组) (37). EGFR家族成员ERBB3号机组和旋转2HGF的调节因子也在上皮细胞中表达较高水平。与聚类结果类似，使用EMT特征的第一主成分分析也将细胞系分为上皮细胞群和间充质细胞群(图1B).

不出所料，所有9个表皮生长因子受体-通过EMT标记将训练集中的突变细胞系分类为上皮细胞。包括携带获得抗性突变T790M的H1975和H820(图1A). 相反，KRAS公司突变在间充质细胞系中更为常见，占该组的60%（n=12/20），而上皮细胞系的18%（n=6/34）（Fischer精确检验p=0.014，95%可信区间0.42-0.76，比值比0.19）(图1A). 间充质细胞系（56%）与上皮细胞（27.6%）相比，STK11（LKB1）的丢失频率更高，间质细胞系中SMARCA4的突变/缺失频率更高（46%与15%），尽管这些没有达到统计显著性，可能是由于样本量小（两者p=0.11）(补充表2). 相反，CDKN2A和CDKN2B在上皮细胞系中丢失更频繁。

尽管主要亚型是腺癌，但训练集中的NSCLC细胞系包括几种组织学类型。在35个腺癌组织学细胞系中，29个（83%）有上皮特征，只有8个（23%）有间充质特征。也就是说，腺癌更常见的表现为上皮性特征（经二次方检验，p=0.0016）。具有鳞状组织学的四种细胞系均匀分布于上皮和间充质亚群之间，而具有神经内分泌、大细胞或大细胞神经内分泌的细胞系均具有间充质特征。

在备用阵列平台和独立测试集中进行验证

由于本研究的主要目标是开发平台相关签名，因此我们接下来在不同的微阵列平台上测试EMT签名的性能。Illumina WGv2微阵列数据可用于原始训练集中使用的54个NSCLC细胞系中的52个。与Affymetrix平台一样，与76个EMT特征基因相对应的Illumina探针的表达也存在明显差异，这反映在层次聚类和第一主成分分析中(图1 B). 令人惊讶的是，在52个受试细胞系中，有51个细胞在两个平台上被划分为上皮细胞或间充质细胞，只有HCC1359在组间转换(图1 B).

然后在第三个微阵列平台（Illumina WG v3）上分析的一组独立的非小细胞肺癌细胞系中测试EMT特征。对未纳入原始训练集的39个非小细胞肺癌细胞株进行分析。与训练集一样，EMT特征通过层次聚类和主成分分析将这些细胞系分为不同的上皮细胞群和间充质细胞群(图1D). 在这些细胞系中，只有一个含有已知的表皮生长因子受体突变，分类为上皮性（HCC4011）。

集成蛋白质组分析

接下来，我们进行了综合蛋白质组分析，以确定按特征分类为上皮细胞（n=29）或间充质细胞（n=20）的细胞系之间蛋白质表达的主要差异。通过反相蛋白阵列（RPPA）测量了200多个总蛋白和磷酸化蛋白，这是一种高度定量的分析方法，用于测量连续稀释系列中打印的细胞裂解物的蛋白质水平。基于所有蛋白表达的细胞系的无监督分层聚类表明上皮细胞系和间充质细胞系分离（卡方检验p=0.001），反映了上皮细胞和间充质细胞之间蛋白质表达和信号传导的主要差异(图2A). 然后，我们通过t检验对上皮细胞系和间充质细胞系之间每种蛋白的表达进行了监督分析。毫不奇怪，两组间E-钙粘蛋白的差异最为显著（p<0.0001），在被指定为上皮细胞的细胞系中，E-钙黏蛋白的平均水平是间充质细胞的7.42倍(图2B，C). EMT第一主成分也与E-cadherin蛋白表达高度相关（r=-0.90，对应p值<0.0001，95%置信区间[CI]0.83-0.94）(图2B). 同样，根据Illumina平台数据计算的EMT第一主成分也与E-cadherin密切相关（r=0.91，p<0.0001，CI 0.84-0.95）。在39个非小细胞肺癌细胞株的独立测试集中，只有14个细胞株的蛋白质数据可用。然而，尽管数量很少，EMT第一主成分再次与E-钙粘蛋白良好相关（r=0.68，第页=0.007). 相反，E-cadherin蛋白与任何单个CDH1探针的相关性都是高度可变的（r=0.37-0.86），支持使用特征而不是任何单个基因从mRNA表达数据评估EMT的理论基础(补充图3).

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蛋白质表达和EMT特征的综合分析

（A）RPPA分析显示，细胞系根据其整体蛋白质组特征分为上皮组和间充质组。（B）RPPA定量的E-cadherin蛋白水平与训练和测试细胞系集合中的EMT特征第一主成分密切相关。（C）与上皮或间充质特征密切相关的蛋白质的层次聚类显示EGFR途径蛋白和Rab25在上皮细胞系中的表达较高。（D）在mRNA和蛋白质水平上，Axl在一组间充质细胞系中的表达明显较高。

上皮细胞系中表达水平较高的其他蛋白包括EGFR途径中的磷酸化蛋白（例如pEGFR和pHER2以及下游靶点pSrc和pSTAT3、5和6）（p<0.006）和Rab25（p<00001）(图2C). Rab25是一种参与EGFR再循环的贩运蛋白。根据其与CDH1表达的强相关性（r=0.8）和高双峰指数（BI=2.88，占特征基因的前3%），它被选为76个EMT特征基因之一。上皮组Rab25蛋白高1.5倍，与E-cadherin蛋白相关，r值为0.67。尽管Rab25被描述为乳腺癌EMT的标志物(33)这是非小细胞肺癌中首次与EMT相关。

与上皮组相比，间充质组EMT特征中相对较少的基因在较高水平上表达。其中，AXL公司mRNA表达与波形蛋白（r=0.60）和N-cadherin（r=0.54）密切相关。因为Axl以前被描述为乳腺癌和胰腺癌的EMT标记物(32-34)是非小细胞肺癌的潜在治疗靶点(38)，我们通过RPPA进一步研究了其在蛋白水平的表达。与mRNA数据一致，Axl蛋白在大多数上皮细胞系中表达较低，但在间充质细胞系的子集中表达较高(第页t检验=0.001，间充质细胞高3.5倍）(图2C、D).

EMT基因特征预测对EGFR和PI3K抑制剂的耐药性在体外

以前，E-cadherin的表达与厄洛替尼在非小细胞肺癌患者中的更大益处相关(15-18). 因此，我们测试了上皮细胞和间充质细胞分类与细胞系对厄洛替尼敏感性之间的关系。对来自治疗组患者的78个非小细胞肺癌细胞系进行了分析。间充质细胞系对埃洛替尼高度耐药，平均浓度为50%的细胞生长抑制（IC50)与上皮细胞系（n=44）相比，间充质细胞系（n=34）中的表达量高3.7倍（t检验，p=0.002）。(图3,补充图4-5). gefinitib治疗的45个细胞系（29个上皮细胞和16个间充质细胞）在上皮样组中也表现出更高的敏感性（t检验p=0.0003，平均IC差异5.5倍50值）(图3,补充图4-5). 尽管细胞系具有表皮生长因子受体在40个野生型细胞系（22个上皮细胞系，18个间充质细胞系）的亚群中，激活突变是对埃洛替尼最敏感的突变之一表皮生长因子受体和野生型KRAS公司EMT特征与厄洛替尼反应之间的相关性保持不变，间质样细胞系中的耐药性显著增加（p=0.023，平均IC高2倍50值）。重要的是，EMT特征比单个基因的mRNA探针组（如CDH1型或VIM公司(补充图6).

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间充质细胞系对EGFR抑制和PI3K通路抑制的抗性显著增强，但对SGI-7079对Axl的抑制敏感

（A）相对IC50靶向药物水平用对应于Wilcoxon秩和检验的p值表示。（B）上皮（E）细胞系与间充质（M）细胞系中平均IC50的折叠差异。（C）如西方分析所示，SGI-7079抑制Gas6诱导的Axl磷酸化。Western blot的密度直方图用非药物治疗对照组p-Axl相对于总Axl的百分比表示。欧盟委员会50SGI-7079小于100 nM。（D-E）间充质细胞系（红条）对SGI7079相对更敏感，而上皮细胞系（黑条）对埃洛替尼更敏感。灰色条（C）表示1uM浓度。

具有间充质特征的NSCLC细胞系对靶向PI3K/Akt途径的药物也更具耐药性，如选择性泛PI3K抑制剂GDC0941(图3B; p=0.068，IC高1.9倍50)和8-氨基腺苷，一种抑制Akt/mTOR信号传导的腺苷类似物（p=0.003，IC高1.7倍50) (39,40). 用Akt选择性抑制剂MK2206处理的间充质细胞也有更大的耐药性趋势(图3B; p=0.18，1.5倍差值IC50)，尽管这些没有达到统计显著性。与EGFR和PI3K抑制剂相比，间充质细胞对其他靶向药物（如索拉非尼）的耐药性并不高(图3B; p=0.33）或常用的细胞毒性化疗，包括培美曲塞、多西他赛、紫杉醇和双铂（p值≥0.2）。相反，与上皮细胞相比，间充质细胞对顺铂（p=0.11）、吉西他滨（p=0.06）和长春瑞宾（p=0.12）的相对敏感性更高(图3B). 间充质细胞系对某些化疗更为敏感的观察结果表明，EMT不是泛耐药的标志物，但可以确定癌症亚群或多或少对具有不同途径靶向或作用机制的药物的抑制反应。

间充质细胞对Axl抑制敏感

由于间充质细胞系表达较高水平的受体酪氨酸激酶Axl，我们接下来测试了Axl抑制剂SGI-7079在间充质与上皮性非小细胞肺癌细胞系中的活性。根据Western分析，SGI-7079在存在外源性Gas6配体的情况下有效抑制Axl活化(图3C). 为了保持较高的靶向表达，间充质细胞系对Axl抑制的总体敏感性提高了1.3倍，尽管这没有达到统计学意义（t检验p值0.17）(补充图5). 接下来，我们测试了Axl抑制是否可以逆转间充质细胞对EGFR抑制的耐药性，因为Axl的抑制已被证明可以逆转其他上皮癌的间充质表型(34). 表达Axl的间充质细胞系单独使用SGI-7079、厄洛替尼或SGI-7079+厄洛替尼联用治疗。在表达高水平Axl的细胞系中，厄洛替尼单独对细胞生长几乎没有影响。相反，这些相同的细胞系对SGI-7079本身高度敏感。然而，当联合使用时，Axl抑制（SGI-7079）与EGFR抑制（erlotinib）的结合导致了显著的协同效应，如Chou-Talalay联合指数所示（IC时CI<1.050对于组合，范围0.46-0.72）在六个细胞系中的四个细胞系中(表1) (41). 在Axl蛋白表达最高的两个细胞系（Calu-1和H2882）中，该组合仅在较高浓度的SGI-7079下具有协同作用，这可能反映了在目标表达水平较高的细胞中需要更高剂量。

表1

Axl抑制逆转间充质细胞对EGFR的抵抗。

A549型Calu-1号机组H157型H1299型H460型H2882型
Erlotinib IC公司50（μM）13.54>10048.50>100>100>100
SG-Axl-I集成电路50（微米）0.922.440.741.742.014.29
CI@IC500.46>1.00*0.670.720.57>1.00*
组合：Erlotinib+SG-Axl-I IC50（微米）1.07 + 0.3513.86 + 4.471.46 + 0.473.76 + 1.213.53 + 1.1416.44 + 5.30
*对于Calu-1和H2882，该组合在IC上是拮抗的50但较高浓度的SG-Axl-i具有协同作用。

Axl阻断抑制间质性非小细胞肺癌的生长

接下来，我们使用间充质非小细胞肺癌细胞系A549在非小细胞肝癌小鼠异种移植模型中测试了SGI-7079的疗效。当肿瘤体积达到100毫米时三，只动物被随机分为治疗组。SGI-7079以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长，在最大剂量下，与对照组相比，抑制肿瘤生长67%（ΔT/ΔC 33%；图4A). Axl（SGI-7079）联合EGFR（厄洛替尼）的联合抑制效果显著高于两种药物单独使用的效果（t检验，与厄洛替尼比p<0.001，与SGI-7079比p<0.00）。值得注意的是，SGI-7079+erlotinib（25/100 mg/kg）使肿瘤生长减少82%（ΔT/ΔC 18%T/C）(图4B,补充表3).

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SGI-7079阻断Axl抑制间叶非小细胞肺癌异种移植瘤的生长

（A） 用载体或SGI-7079治疗的小鼠中植入A549异种移植物的平均肿瘤体积。（B） 经载体和SGI-7079联合厄洛替尼治疗的小鼠A549异种移植物的平均肿瘤体积。

复发或转移性NSCLC患者的EMT特征

最后，我们对参与BATTLE-1试验（肺癌靶向治疗的生物标记综合方法）的晚期非小细胞肺癌患者进行了EMT特征测试(42). 与我们在细胞系中观察到的结果一致，尽管所有患者都患有晚期转移性疾病，但大多数患者（约2/3）都表现出上皮特征(图5). 然而，与细胞系不同，临床样本表皮生长因子受体和KRAS公司突变在两组之间分布更均匀，可能是因为先前的治疗（例如，EGFR突变患者中先前的EGFR抑制剂）。

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埃洛替尼治疗具有上皮特征的BATTLE患者8周疾病控制改善

（A）根据EMT特征，BATTLE患者（所有治疗组）被分为间质性或类上皮性。（B）在接受厄洛替尼治疗的野生型EGFR和KRAS患者中，对于上皮性肿瘤较多的患者，8周的疾病控制效果更佳（p=0.052）。（C）其他治疗组的上皮性和间叶性肿瘤在8周疾病控制方面没有显著差异。

为了评估EMT特征作为厄洛替尼对患者肿瘤反应的预测标记物的潜在价值，我们分析了EMT特征表达与临床结果之间的关系。分析仅限于EGFR野生型/KRAS野生型患者，因为该组没有经验证的EGFR抑制剂反应标记（而EGFR突变与反应相关，KRAS突变与耐药相关(三,4,43)). 尽管数量较少（n=20），但与没有疾病控制的患者相比，8周时（主要研究终点）疾病控制的EGFR/KRAS野生型患者表现出更多的上皮样特征，差异具有临界意义（通过t检验，p=0.05）。在疾病控制8周的BATTLE患者中，七分之六的患者具有上皮性EMT特征（定义为EMT特征中位数以下的第一个主要成分），而只有五分之一的患者具有间叶性EMT标志（主要成分中位数以上）的疾病控制。

相比之下，在101/139名临床可评估患者（所有治疗组）的整个组中，EMT特征基因的表达并不能预测整个组的8周疾病控制（p=0.40）或无进展生存期（PFS），它也与其他个体治疗组（如索拉非尼治疗的患者）疾病控制的差异无关。这些结果表明，EMT信号可能是厄洛替尼在表皮生长因子受体野生型/KRAS公司野生型肿瘤，而不仅仅是侵袭性较低的肿瘤表型的预后标志物。

由于我们对Axl靶向治疗非小细胞肺癌的潜在治疗方法感兴趣，我们还专门研究了具有间叶和上皮特征的BATTLE患者Axl水平的差异。间叶性肿瘤患者的Axl mRNA水平较高（t检验p<0.01）。更引人注目的是，Axl配体GAS6在这些肿瘤中显著增加（p<0.0001）。总之，这些数据表明，通过其受体Axl抑制GAS6信号传导可能对患有间叶肿瘤的非小细胞肺癌患者亚群有治疗益处。

讨论

在这些研究中，我们开发并测试了一种稳健的EMT基因表达特征，能够评估非小细胞肺癌细胞经历非小细胞肝癌细胞和患者肿瘤EMT状态的程度。对mRNA表达和蛋白质组数据的综合分析证实了EMT特征与E-cadherin蛋白水平的显著相关性。此外，在上皮细胞系中观察到活化的EGFR途径蛋白的高表达，而在间充质细胞系中则观察到受体酪氨酸激酶Axl（与其他上皮癌EMT相关的特征基因）的高蛋白表达。最后，我们证明了上皮性癌和间叶性癌之间的药物反应差异。根据EMT特征分类为间充质细胞的细胞株和/或患者对抑制EGFR或PI3K/Akt途径的药物更具耐药性，但对某些化疗和Axl抑制剂SGI-7079更敏感。此外，Axl抑制逆转了一部分间充质细胞系对厄洛替尼的耐药性，在非小细胞肺癌的间充质异种移植模型中，联合阻断Axl和EGFR比抑制任一单一靶点更有效地控制肿瘤生长。

基因表达特征的一个常见限制是它们的平台依赖性，这是由于在特定的微阵列平台上衍生特征所致。本研究的一个特别优势是使用来自两个独立mRNA分析平台Affymetrix和Illumina的微阵列数据，初步开发训练细胞系中的特征。这种策略使我们能够为四个EMT标记识别最强大的探针集(CDH1、VIM、CDH2、和FN1型)然后用它们导出76-gene签名。选择最佳跨平台探针集的目的是增加签名应用于不同类型的mRNA阵列上的样本以及RNA序列等新兴技术的可能性。独立测试集证明了该方法的成功，包括Illumina v2和v3阵列上的细胞株和Affymetrix Human ST 1.0阵列上的患者肿瘤。

我们认为，使用交叉验证的、稳健的探针集来推导EMT特征也导致了EMT中具有生物学相关性的基因的特征富集。有趣的是，EMT第一主成分与E-钙粘蛋白水平的相关性比最好的还要好CDH1型RNA探针装置。这一观察结果支持了我们的假设，即在评估复杂的生物过程（如EMT）时，包含多个相关标记的特征可能优于任何单个标记。此外，两个标志性基因Rab25在上皮细胞系和Axl在间充质细胞系中的高表达在蛋白质水平上得到了证实。这两个基因在其他癌症类型中被确定为EMT标记(32-34). 然而，据我们所知，这是首次证明它们是NSCLC中EMT的标志物。这一发现具有潜在的治疗意义，特别是对于间充质性非小细胞肺癌，因为许多Axl抑制剂目前正在开发或临床测试中。此外，我们在其他肿瘤类型中观察到的EMT特征和EMT标记之间的相似性表明，我们的EMT标记也可能适用于其他上皮性肿瘤，如乳腺、结肠或头颈部。

这项研究的另一个重要结果是，EMT评分预测了埃洛替尼在两种药物中的敏感性表皮生长因子受体-突变体和表皮生长因子受体-野生型NSCLC。虽然该特征来自细胞系，但在成功识别的临床样本中得到了验证表皮生长因子受体-从EGFR TKIs治疗中获益的野生型患者。目前，激活表皮生长因子受体是非小细胞肺癌对EGFR酪氨酸激酶抑制剂反应的唯一经验证的生物标志物。然而，这种突变仅发生在少数非小细胞肺癌患者中，不能解释表皮生长因子受体-在几项临床试验中显示从EGFR TKIs获益的野生型患者(8-10). 因此，我们证明厄洛替尼对EGFR-wild型肿瘤患者有更大的临床益处，BATTLE研究显示上皮表型，这表明EMT可能是缺乏已知与药物敏感性相关突变（EGFR突变）患者的临床相关预测标记物或耐药性（KRAS突变），值得进一步调查。与这些发现一致，在我们的蛋白质分析中，我们观察到上皮细胞系（EGFR突变型和野生型）相对于间充质细胞系的EGFR通路激活显著增强。虽然激活机制表皮生长因子受体-野生型患者尚不清楚，上皮样非小细胞肺癌中EGFR通路激活频率较高可能是上皮组对厄洛替尼更敏感的原因。

本研究中的另一个主要观察结果是间充质细胞系对PI3K/AKT途径抑制剂的耐药率显著升高。这是针对该途径的四种不同药物的类效应。结合EGFR抑制剂的数据，这表明间充质细胞可能降低了对受体酪氨酸激酶EGFR家族信号和下游信号通路的依赖性。一些PI3K/AKT抑制剂正在临床上开发用于非小细胞肺癌。因此，识别一组不太可能从药物中受益的患者的阴性预测信号具有直接的临床意义。为了测试这种可能性，EMT特征将在正在进行的BATTLE-2研究中进行评估，该研究包括厄洛替尼治疗组以及AKT抑制剂MK2206的两种组合。如果在非小细胞肺癌患者中证实EMT和PI3K/AKT抑制剂耐药性之间的关联，那么它也可能与其他上皮性肿瘤有关，例如乳腺癌，这些药物也正在研究中。

我们还研究了EMT状态是否预测了对用于非小细胞肺癌和其他靶向药物的标准化疗药物的反应性。索拉非尼和大多数化疗药物的EMT状态和药物反应之间没有关联，表明间充质表型与泛耐药无关。吉西他滨和长春瑞滨表现为间叶细胞瘤，与上皮细胞相比，间叶细胞的IC50中位数降低了2倍以上。这些发现表明，某些化疗药物或靶向药物可能在间质型肿瘤中具有更大的活性，并为开发针对间质型瘤的联合方案提供了一个起点。

最后，Axl在本研究中被确定为非小细胞肺癌EMT的新标记物，并代表了非小细胞肝癌潜在的新治疗靶点。在NSCLC细胞系中，间充质组Axl抑制活性更强。此外，在其他癌症模型中显示的对Axl的抑制可以减少经过EMT的癌症的侵袭、迁移和其他行为特征(34)-在间充质NSCLC的异种移植物模型中，在体外和体内对EGFR抑制剂埃洛替尼致敏原本具有抗性的间充质NSCLC系。这表明，除了单药活性外，Axl抑制可能在逆转EGFR抑制剂耐药性中发挥作用。重要的是，在提交这份手稿之后，Zhang等人(44)据报道，Axl的活化增加，并有证据表明EMT使用体外和体内EGFR-获得性耐药埃洛替尼的突变肺癌模型。在这些模型中，Axl抑制恢复了对厄洛替尼的敏感性。综上所述，这些结果支持进一步研究Axl和EGFR联合抑制间充质肿瘤和获得性EGFR抑制剂耐药性，这在某些情况下与EMT相关。

总之，本研究建立了一种强大的跨平台EMT信号，能够将NSCLC细胞系和患者肿瘤分类为上皮样或间充质样。独立于微阵列平台对此类肿瘤进行准确分类的能力，将有助于未来对EMT日益增长领域的研究。此外，此处确定的间充质表型似乎是靶向EGFR或PI3K/Akt通路药物反应的负预测因子。最后，该分析确定酪氨酸激酶Axl是一种新的EMT标记物和潜在的间质相关靶点，可用于非小细胞肺癌的治疗。

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翻译重要性声明

尽管在非小细胞肺癌（NSCLC）中已发现一些分子标记物，如EGFR突变和ALK融合，可用于选择患者治疗，但仍没有对大多数NSCLC患者进行有效预测的生物标记物。在本研究中，我们研究了EMT是否影响肺癌细胞系和患者肿瘤对已建立（如EGFR抑制剂）和新出现（如PI3K抑制剂）靶向药物的反应。我们的数据表明，强大的基因表达特征可以识别可能对某些化疗药物和靶向治疗（如EGFR和PI3K/Akt抑制剂）产生耐药性的间叶性非小细胞肺癌，并揭示潜在的靶向治疗策略。受体酪氨酸激酶Axl首次在非小细胞肺癌中作为一种新的EMT标记物显示出作为其他上皮性癌的早期治疗靶点的潜力，应在间质性非小细胞癌中进一步研究。

补充材料

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致谢

研究支持：我们要感谢Emily C.Brantley博士的编辑协助。这项工作得到了得克萨斯大学西南医学中心和得克萨斯大学MD安德森癌症中心肺SPORE拨款5 P50 CA070907的支持；国防部前景拨款W81XWH-07-1-0306；国防部战争拨款W81XWH-06-1-0303 03；R01 CA168484-01；CCSG拨款5 P30 CA016672；克莱伯格分子标记中心；查普曼癌症个性化治疗生物信息学基金，1 U24 CA143883；和E.L.Wiegand基金会。LAB部分由AACR-AstraZeneca-Provent Cancer Foundation转化型肺癌研究奖学金和Barbara Rattay高级奖学金项目提供支持。

来自细胞系训练集的Affymetrix微阵列结果之前已在基因表达综合库中发布和存档(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO加入GSE4824）。

Illumina v2（GSE32989）和v3（GSE32036）的结果已保存在GEO存储库中，并可在以下私人链接上获得（发布时公开）

Illumina v2：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token=lxatjamqwakaidw&acc=GSE32989

Illumina第3版：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token=pfiphqkackiyubo&acc=GSE32036

BATTLE阵列结果已保存在GEO存储库（GSE33072）中，可通过以下私人链接获得（发布后公开）：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token=xfwnxqsygocaajg&acc=GSE33072

脚注

*利益冲突：DJB和SLW受雇于Tolero Pharmaceuticals，Inc.。JMK受雇于Astex Pharmaceuticals，Inc.，并对其拥有所有权。SBK受雇于Astex Pharmaceuticals，Inc。

工具书类

1Koivunen JP、Mermel C、Zejnullahu K、Murphy C、Lifshits E、Holmes AJ等。EML4-ALK融合基因和ALK激酶抑制剂在肺癌中的疗效。临床癌症研究。2008;14:4275–83. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Pao W、Miller V、Zakowski M、Doherty J、Politi K、Sarkaria I等。EGF受体基因突变在“从不吸烟”的肺癌中很常见，并且与肿瘤对吉非替尼和埃洛替尼的敏感性相关。美国国家科学院院刊。2004;101:13306–11. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Lynch TJ、Bell DW、Sordella R、Gurubhagavatula S、Okimoto RA、Brannigan BW等。非小细胞肺癌对吉非替尼反应性的表皮生长因子受体激活突变。N英格兰医学杂志。2004;350:2129–39.[公共医学][谷歌学者]
4Paez JG、Janne PA、Lee JC、Tracy S、Greulich H、Gabriel S等。肺癌中EGFR突变：与吉非替尼治疗临床反应的相关性。科学。2004;304:1497–500.[公共医学][谷歌学者]
5Tokumo M、Toyooka S、Kiura K、Shigematsu H、Tomii K、Aoe M等。非小细胞肺癌中表皮生长因子受体突变与临床病理特征的关系。临床癌症研究。2005;11:1167–73.[公共医学][谷歌学者]
6.Cappuzzo F、Hirsch FR、Rossi E、Bartolini S、Ceresoli GL、Bemis L等。非小细胞肺癌中表皮生长因子受体基因和蛋白与吉非替尼敏感性。美国国家癌症研究所杂志。2005;97:643–55.[公共医学][谷歌学者]
7.Soda M，Choi YL，Enomoto M，Takada S，Yamashita Y，Ishikawa S，等。非小细胞肺癌中转化EML4-ALK融合基因的鉴定。自然。2007;448:561–6.[公共医学][谷歌学者]
8Bell DW、Lynch TJ、Haserlat SM、Harris PL、Okimoto RA、Brannigan BW等。非小细胞肺癌中表皮生长因子受体突变和基因扩增：IDEAL/INTACT吉非替尼试验的分子分析。临床肿瘤学杂志。2005;23:8081–92.[公共医学][谷歌学者]
9Zhu CQ，da Cunha Santos G，Ding K，Sakurada A，Cutz JC，Liu N，等。KRAS和EGFR在加拿大国家癌症研究所临床试验小组研究BR.21中作为埃洛替尼反应生物标志物的作用。临床肿瘤学杂志。2008;26:4268–75.[公共医学][谷歌学者]
10Mok TS、Wu YL、Thongprasert S、Yang CH、Chu DT、Saijo N等。吉非替尼或卡铂-哌啶醇在肺腺癌中的作用。新英格兰医学杂志。2009;361:947–57.[公共医学][谷歌学者]
11Huber MA，Kraut N，Beug H.肿瘤进展过程中上皮-间充质转化的分子要求。当前操作细胞生物学。2005;17:548–58.[公共医学][谷歌学者]
12.Thiery JP。肿瘤进展中的上皮-间充质转变。Nat Rev癌症。2002;2:442–54.[公共医学][谷歌学者]
13Thiery JP，Acloque H，Huang RY，Nieto MA。发育和疾病中的上皮-间质转化。单元格。2009;139:871–90.[公共医学][谷歌学者]
14Hugo H、Ackland ML、Blick T、Lawrence MG、Clements JA、Williams ED等。癌进展中的上皮-间充质和间充质-上皮转变。细胞生理学杂志。2007;213:374–83.[公共医学][谷歌学者]
15Yauch RL、Januario T、Eberhard DA、Cavet G、Zhu W、Fu L等。上皮与间充质表型决定体外敏感性，并预测埃洛替尼在肺癌患者中的临床活性。临床癌症研究。2005;11:8686–98.[公共医学][谷歌学者]
16Thomson S、Buck E、Petti F、Griffin G、Brown E、Ramnarine N等。上皮-间充质转化是非小细胞肺癌细胞系和异种移植物对表皮生长因子受体抑制敏感性的决定因素。癌症研究。2005;65:9455–62.[公共医学][谷歌学者]
17Frederick BA、Helfrich BA、Coldren CD、Zheng D、Chan D、Bunn PA、Jr等。上皮-间质转化预测头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌细胞系中吉非替尼的耐药性。摩尔癌症治疗。2007;6:1683–91.[公共医学][谷歌学者]
18Nikolova DA、Asangani IA、Nelson LD、Hughes DP、Siwak DR、Mills GB等。西妥昔单抗抑制非小细胞肺癌的转移和u-PAR表达：u-PAR和E-cadherin是西妥昔单抗敏感性的新生物标志物。癌症研究。2009;69:2461–70.[公共医学][谷歌学者]
19Witta SE、Gemmill RM、Hirsch FR、Coldren CD、Hedman K、Ravdel L等。恢复E-cadherin表达可提高肺癌细胞系对表皮生长因子受体抑制剂的敏感性。癌症研究。2006;66:944–50.[公共医学][谷歌学者]
20Ramirez RD、Sheridan S、Girard L、Sato M、Kim Y、Pollack J等。在缺乏病毒癌蛋白的情况下人类支气管上皮细胞的永生化。癌症研究。2004;64:9027–34.[公共医学][谷歌学者]
21Phelps RM、Johnson BE、Ihde DC、Gazdar AF、Carbone DP、McClintock PR等。NCI-Navy医学肿瘤科细胞系数据库。细胞生物化学杂志。1996;24:32–91.[公共医学][谷歌学者]
22Gandhi J，Zhang J，Xie Y，Soh J，Shigematsu H，ZhangW，等。肺癌细胞株EGFR信号通路基因的改变及其与EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性的关系。公共科学图书馆一号。2009;4：e4576。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Byers LA，Sen B，Saigal B，Diao L，Wang J，Nanjundan M，等。非小细胞肺癌中c-Src和STAT3的相互调节。临床癌症研究。2009;15:6852–61. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Gemmill RM、Roche J、Potiron VA、Nasarre P、Mitas M、Coldren CD等。非小细胞肺癌中的ZEB1应答基因。癌症快报。2011;300:66–78. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Wang J，Wen S，Symmans WF，Pusztai L，Coombes KR。双峰指数：从癌症基因表达谱数据中发现和排序双峰特征的标准。癌症信息。2009;7:199–216. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Miyoshi A、Kitajima Y、Sumi K、Sato K、Hagiwara A、Koga Y等。蜗牛和SIP1通过上调肝细胞癌细胞中的MMP家族来增加癌症侵袭。Br J癌症。2004;90:1265–73. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Yokoyama K、Kamata N、Fujimoto R、Tsutsumi S、Tomonari M、Taki M等。蜗牛诱导的鳞状细胞癌间质转化导致侵袭性增加和基质金属蛋白酶-2表达增加。国际癌症杂志。2003;22:891–8.[公共医学][谷歌学者]
28Cano A、Perez-Moreno MA、Rodrigo I、Locascio A、Blanco MJ、del Barrio MG等。转录因子snail通过抑制E-cadherin的表达来控制上皮-间质转换。自然细胞生物学。2000;2:76–83.[公共医学][谷歌学者]
29Eger A、Aigner K、Sonnederger S、Dampier B、Oehler S、Schreiber M等。DeltaEF1是E-cadherin的转录抑制因子，调节乳腺癌细胞的上皮可塑性。致癌物。2005;24:2375–85.[公共医学][谷歌学者]
30Bindels S、Mestdagt M、Vandewalle C、Jacobs N、Volders L、Noel A等。SIP1对人类上皮性乳腺癌细胞中波形蛋白的调节。致癌物。2006;25:4975–85.[公共医学][谷歌学者]
31.Guaita S、Puig I、Franci C、Garrido M、Dominguez D、Batlle E等。蜗牛对肿瘤细胞上皮-间充质转化的诱导伴随MUC1阻遏和ZEB1表达。生物化学杂志。2002;277:39209–16.[公共医学][谷歌学者]
32.Gjerdrum C、Tiron C、Hoiby T、Stefansson I、Haugen H、Sandal T等。Axl是乳腺癌转移和患者生存的重要上皮-间充质转化诱导调节因子。美国国家科学院院刊。107:1124–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Vuoriluoto K、Haugen H、Kiviluoto S、Mpindi JP、Nevo J、Gjerdrum C等。波形蛋白通过调控乳腺癌中Axl的表达，调节Slug和致癌H-Ras诱导的EMT和迁移。致癌物。30:1436–48.[公共医学][谷歌学者]
34Koorstra JB、Karikari CA、Feldmann G、Bisht S、Rojas PL、Offerhaus GJ等。Axl受体酪氨酸激酶对胰腺癌的预后产生不利影响，并代表了一个新的治疗靶点。癌症生物治疗。2009;8:618–26. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Batlle E、Sancho E、Franci C、Dominguez D、Monfar M、Baulida J等。转录因子snail是上皮性肿瘤细胞中E-cadherin基因表达的阻遏物。自然细胞生物学。2000;2:84–9.[公共医学][谷歌学者]
36.De Craene B、Gilbert B、Stove C、Bruyneel E、van Roy F、Berx G。转录因子snail通过调节上皮细胞分化程序诱导肿瘤细胞侵袭。癌症研究。2005;65:6237–44.[公共医学][谷歌学者]
37池内J，松田M，Furuse M，Tsukita S。上皮-间充质转变期间紧密连接的调节：蜗牛对克劳丁/闭塞素基因表达的直接抑制。细胞科学杂志。2003;116:1959–67.[公共医学][谷歌学者]
38Ye X，Li Y，Stawicki S，Couto S，Eastham-Anderson J，Kallop D等。抗Axl单克隆抗体可抑制异种移植瘤生长并增强多种抗癌治疗的效果。致癌物。29:5254–64.[公共医学][谷歌学者]
39Dennison JB、Shanmugam M、Ayres ML、Qian J、Krett NL、Medeiros LJ等。8-氨基腺苷抑制套细胞淋巴瘤中的Akt/mTOR和Erk信号传导。鲜血。116:5622–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Ghias K，Ma C，Gandhi V，Platanias LC，Krett NL，Rosen ST.8-氨基腺苷诱导p38有丝分裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶1/2和Akt激酶磷酸化丢失：在诱导多发性骨髓瘤凋亡中的作用。摩尔癌症治疗。2005;4:569–77.[公共医学][谷歌学者]
41.Chou TC，Talalay P.剂量-效应关系的定量分析：多种药物或酶抑制剂的联合作用。高级酶调节。1984;22:27–55.[公共医学][谷歌学者]
42.Kim ES HR、Wistuba II、Lee JJ、Blumenschein Gr、Tsao A、Stewart DJ、Hicks ME、Erasmus J、Gupta S、Alden CM、Liu S、Tang X、Khuri FR、Trans HT、Johnson BE、Heymach JV、Mao L、Fossella F、Lies M、Papadimitrakopoulou V、Davis SE、Lippman SM、Hong WK。BATTLE试验：肺癌个性化治疗。癌症发现。2011;1:43–51. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Eberhard DA、Johnson BE、Amler LC、Goddard AD、Heldens SL、Herbst RS等。表皮生长因子受体和KRAS的突变是单独化疗和联合埃洛替尼治疗的非小细胞肺癌患者的预测和预后指标。临床肿瘤学杂志。2005;23:5900–9.[公共医学][谷歌学者]
44Zhang Z，Lee JC，Lin L，Olivas V，Au V，Laframboise T，等。AXL激酶的激活导致对EGFR靶向治疗肺癌的耐药性。自然遗传学。2012;44:852–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]