肝病学。 作者手稿； PMC 2014年2月1日提供。
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美国国立卫生研究院： 尼姆斯408238
TLR2和棕榈酸通过激活炎症小体共同促进非酒精性脂肪性肝炎的发展 , 1, 2 , 1 , 三 , 1 , 2 和 1
三浦口一 1 加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院医学系，加利福尼亚州拉霍亚吉尔曼大道9500号，邮编92093
2 秋田大学医学研究生院消化系，日本秋田市秋田本都1-1-1号，邮编：010-8543
凌阳 1 加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院医学系，加利福尼亚州拉霍亚吉尔曼大道9500号，邮编92093
尼科·范·罗伊扬 三 荷兰阿姆斯特丹Vrije大学医学中心分子细胞生物学系
大卫·A·布伦纳 1 加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院医学系，加利福尼亚州拉霍亚吉尔曼大道9500号，邮编92093
Hirohide Ohnishi公司 2 秋田大学医学研究生院消化系，日本秋田市秋田本都1-1-1号，邮编：010-8543
Ekihiro Seki先生 1 加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院医学系，加利福尼亚州拉霍亚吉尔曼大道9500号，邮编92093
1 加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院医学系，加利福尼亚州拉霍亚吉尔曼大道9500号，邮编92093
2 秋田大学医学研究生院消化系，日本秋田市秋田本都1-1-1号，邮编：010-8543
三 荷兰阿姆斯特丹Vrije大学医学中心分子细胞生物学系
联系方式：加州大学圣地亚哥分校医学院医学系消化科医学博士Ekihiro Seki，邮编：92093-0702，Leichtag Biomedical Research Building Room#118B，La Jolla，CA 92093-702，电话：858-822-3347传真：858-82 2-5370， ude.dscu@ikeske网站 或Kouichi Miura，医学博士，秋田大学医学研究生院消化系，日本秋田秋田市秋田本都1-1-1号，邮编：010-8543，电话：+81-18-884-6104，传真：+81-1-836-2611， pj.ca.u-atika.dem.cod@611aruim公司
补充资料 补充图S1。
指南：B1C99AA5-feb-4763-A453-05DFBE26979B
补充图2。
GUID:CAA31BB0-A15E-4505-83B7-84D6761E0A3D
补充图S3。
GUID:B37473E8-A6DD-40C4-B8B2-1151C495A7A6
补充图4。
GUID:E61A5A75-E700-4367-9033-792CA595CA32
补充图S5。
GUID:90F1C4B8-8BBF-45D2-9116-A795263FA5B1
补充表S1。
GUID:D3715ECA-D16D-4ACA-B37C-8A307C27C461
补充图例。
GUID:C046D938-201C-4CBF-BE87-682AC61EFC86
摘要 与Toll样受体（TLR）相关的先天免疫信号是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展的关键途径。 在这里，我们表明TLR2和棕榈酸都是激活炎症小体、IL-1α和IL-1β所必需的，从而导致NASH的进展。 野生型（WT）和TLR2 −/− 小鼠喂食胆碱缺乏氨基酸定义（CDAA）饮食22周以诱导NASH。 骨髓移植的TLR2嵌合体小鼠在受体小鼠受到致命照射后生成。 从WT小鼠分离Kupffer细胞和肝星状细胞（HSC），并用TLR2配体和/或棕榈酸刺激。 CDAA饮食的WT小鼠出现严重的脂肪性肝炎和肝纤维化。 相反，TLR2 −/− 小鼠抑制了NASH的进展。 虽然Kupffer细胞和HSC对TLR2配体都有反应，但TLR2骨髓嵌合小鼠表明，Kupfer细胞在TLR2介导的NASH进展中相对比HSC更重要。 体外 棕榈酸本身并没有增加Kupffer细胞和HSC中TLR2信号靶基因，包括细胞因子和炎症组分。 TLR2配体增加了Kupffer细胞中的Nod-like receptor protein 3，这是一种炎症组分，但在HSC中没有增加。 在TLR2配体存在下，棕榈酸确实诱导Kupffer细胞caspase-1活化和IL-1α和IL-1β的释放，但在HSC中未观察到这些作用。 在体内， CDAA饮食中的WT显示肝脏中caspase-1激活增加，血清IL-1α和IL-1β水平升高，而TLR2中IL-1α、IL-1β的水平受到抑制 −/− 老鼠。 结论：TLR2和棕榈酸协同激活Kupffer细胞/巨噬细胞炎症小体参与NASH的发生发展。
关键词： 库普弗细胞、肝星状细胞、nalp3、胱天蛋白酶-1、白细胞介素-1β
引言 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是代谢综合征的肝脏后果，是发达国家的一个重大公共卫生问题。 NAFLD的范围从单纯脂肪变性到脂肪变性伴进行性肝炎症和纤维化，称为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最终导致肝硬化，可能增加肝细胞癌的发病率( 1 , 2 ). 然而，NASH发展过程中涉及多因素事件的大多数机制仍未解决。
肝固有免疫系统在NASH发病中被激活( 三 , 4 ). 类Toll受体（TLR）是一种模式识别信号受体，用于感应细菌和病毒衍生的特征基序，从而激活先天免疫系统( 5 ). TLR信号通过诱导免疫细胞中的促炎细胞因子在宿主防御入侵病原体中发挥作用。 然而，TLR信号的过度激活或TLR耐受性的破坏会产生大量炎性细胞因子，最终导致组织损伤( 6 ). 在哺乳动物中发现的13种TLR中，据报道TLR2、TLR4和TLR9与脂肪性肝炎有关( 4 , 7 , 8 ). TLR4和TLR9已被证明在实验性NASH中促进肝脏炎症和纤维化( 8 , 9 ). 然而，TLR2在NAFLD发病机制中的作用仍存在争议。 TLR2缺乏保护小鼠免受高脂饮食（HFD）诱导的肝脂肪变性( 10 , 11 ). 蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的NASH模型表明，TLR2的丢失增加了对致病相关脂肪性肝炎的易感性( 7 , 12 ). 这些相互矛盾的数据暗示了TLR2介导的NAFLD的复杂性。
炎症激活是通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的裂解将IL-1β和IL-18从其前体加工成活性形式所需的途径。 最近的报告表明，炎症组分的丢失可以保护小鼠免受高脂肪饮食诱导的NAFLD的影响( 13 , 14 ). 此外，IL-1受体信号的失活可减弱NASH小鼠模型( 9 , 15 ). 这些数据表明炎症小体参与了NAFLD的发展。 炎症小体激活接受双信号假说：第一个信号产生前IL-1β和炎症小体成分，第二个信号组装炎症小体组分参与caspase-1激活。 包括TLR2在内的TLR激活第一个信号，第二个信号由危险相关的分子模式激活，如细胞外ATP和尿酸盐晶体。 新的证据表明，游离脂肪酸（FFA）激活炎症小体( 16 , 17 )以及TLR( 18 – 20 )这意味着FFA是NASH的发起人。 代谢综合征（包括NAFLD）患者血浆FFA浓度升高( 21 )可能有助于NAFLD的发展。
哪种细胞类型对TLR配体有反应并负责炎症小体的激活，这一点经常引起争论。 包括库普弗细胞在内的巨噬细胞是激活炎症小体并产生TLR诱导的细胞因子的原代细胞。 包括肝星状细胞（HSC）和肝细胞在内的肝脏非免疫细胞也对TLR配体产生反应，是炎症小体激活的部位( 17 , 22 ).
在这里，我们发现TLR2是一种关键分子，可促进喂食胆碱缺乏氨基酸定义（CDAA）饮食的小鼠的肝损伤、炎症和纤维化，这些小鼠会发展为伴有肥胖和胰岛素抵抗的NASH( 9 , 23 ). TLR2信号转导增加了包括IL-1β和炎症组分Nod-like receptor protein（NLRP）3在内的促炎细胞因子的表达。 与棕榈酸协同作用，棕榈酸是NAFLD患者血浆中最丰富的游离脂肪酸( 16 , 24 )TLR2信号主要激活Kupffer细胞中的炎症小体，但不激活HSC或肝细胞中的炎小体。
材料和方法 动物和饮食 野生型（WT）C57BL/6小鼠和TLR2 −/− 从Jackson Laboratories（ME Bar Harbor）购买的小鼠在UCSD动物饲养场饲养。 TLR2级 −/− 将小鼠回交至C57BL/6背景至少10代，在标准实验室条件下表现出与WT小鼠相似的肝脏表型。 雄性小鼠在8周龄时被分为两组：补充胆碱的L-氨基酸限定饮食（CSAA）（目录号518754，美国宾夕法尼亚州伯利恒Dyets公司）和缺乏胆碱的L-胺基酸限定饮食（目录号5128753，美国Dyets公司）。 每组包括7至10只小鼠。 这些饮食持续了22周，没有任何中断。 对CDAA饮食中的食物摄入量进行为期一个月的监测，并观察到WT和TLR2之间的食物摄入相似 −/− 老鼠( 补充图1 ).
为了产生嵌合体小鼠，在骨髓移植前一天，静脉注射氯膦酸脂质体以耗尽常驻的肝巨噬细胞。 骨髓细胞（1×10 7 细胞）从WT或TLR2获得 −/− 在受照小鼠受到致命照射（10Gy）后，通过尾静脉移植小鼠。 骨髓移植8周后开始CDAA或CSAA饮食。 每组包括5至9只小鼠。 根据美国国立卫生研究院在《实验动物护理和使用指南》中提出的建议，这些小鼠接受了人道主义护理。 所有动物实验都得到了加州大学圣地亚哥分校和秋田大学动物护理和使用委员会的批准。
组织学检查 进行苏木精和伊红（H-E）、油红O、天狼星红、αSMA免疫组化染色（日本京都Dako Cytomation）、F4/80（加州圣地亚哥eBioScience）和Ly6C（马萨诸塞州剑桥Abcam）( 9 ). 在10个低功率（x40）场/载玻片上测量天狼星红阳性区域，并使用NIH成像软件进行量化。 根据公布的标准确定NAFLD活动评分( 25 ). F4/80和Ly6C阳性细胞在每片10个高功率（200x）场上计数。
定量实时PCR分析 从肝脏和细胞中提取的RNA通过反转录转化为cDNA。 然后使用ABI PRISM 7000序列检测器（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时定量PCR。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 引物序列总结于 补充表1 .
脂质的分离和测量 如前所述分离肝脏脂质( 9 ). 根据制造商的说明，使用甘油三酯E（Wako，大阪，日本）、胆固醇E（Wako）和NEFA C试验（Wako）测量甘油三酸酯、总胆固醇和游离脂肪酸含量。
蛋白质印迹 蛋白质提取物进行电泳，然后进行印迹。 用αSMA抗体（西格玛，圣路易斯，密苏里州）或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1抗体（密立波，特梅库拉，加利福尼亚州）培养斑点。
细胞和治疗 如前所述，从小鼠中分离出枯否细胞、HSC和肝细胞( 9 ). 在使用肝细胞的实验中，在分离前一天静脉注射200µL氯膦酸脂质体，以耗尽受污染的库普弗细胞。 我们已经通过NF-κB、STAT3和Akt的活化来评估这些肝细胞对TNFα、IL-6和胰岛素的完整反应（数据未显示）。 肝细胞和Kupffer细胞在无血清培养基中培养，HSC与含DMEM的1%FBS培养16小时，然后用试剂刺激。 帕姆 三 确认 4 （5µg/ml）（EMC Microcollection，Tuebingen，Germany）、CpG-ODN（5μg/ml）、（ODN1826:5'-tccatacgtcctgacgtt-3'）（invitrogen）和棕榈酸（200µM）（Sigma）用于刺激肝细胞。
统计分析 采用Mann-Whitney U检验比较两组之间的差异。 使用单因素方差分析（Dr.SPSS II）比较多组之间的差异； p<0.05为显著性。
结果 TLR2级 −/− CDAA饮食诱导的NASH小鼠炎症反应较少 正如我们之前报告的那样( 9 )，小鼠连续22周食用CDAA导致严重脂肪变性、炎性细胞浸润和肝细胞膨胀( ). TLR2级 −/− CDAA饮食的小鼠脂肪变性程度相似( )和WT小鼠肝脏甘油三酯含量( )而TLR2中炎性细胞浸润和肝细胞膨胀明显减弱 −/− 肝脏( ). 因此，TLR2中的NAFLD活动得分 −/− 小鼠显著低于WT小鼠（总分，WT vs.TLR2 −/− 小鼠=6.5对4.6，p<0.05）( ). CDAA饮食中的WT肝脏增加了表达F4/80和Ly6C的炎症细胞的浸润，而TLR2中炎症细胞的募集减少 −/− 肝脏( ). 血清ALT水平( )促炎细胞因子和趋化因子的表达( )TLR2也下降 −/− 小鼠与WT小鼠的比较。 喂食CDAA饮食的WT小鼠也表现出肥胖和胰岛素抵抗( ). 而WT和TLR2的代谢表型相似 −/− 喂食标准食物的小鼠( )TLR2减轻了体重增加和胰岛素抵抗的变化 −/− CDAA饮食小鼠( , ). 对照组喂食CSAA的小鼠出现中度脂肪变性，但这些动物的炎症不明显( ).
TLR2级 −/− CDAA诱导的NASH小鼠炎症反应较少 WT和TLR2 −/− 给小鼠喂食CSAA饮食（CS）或CDAA饮食（CD）22周。 闭合条表示WT鼠标，开放条表示TLR2 −/− 老鼠。 （A，左）苏木精-伊红（HE）和油红O染色。 介绍了CDAA饮食的肝脏切片。 WT和TLR2的脂肪变性分级相似 −/− 小鼠TLR2中炎症细胞浸润（箭头）和肝细胞膨胀（箭头）减弱 −/− 老鼠。 HE和油红O染色的原始放大倍数为×400。 棒材100µm。 （A，右）NAFLD活动评分。 （B） F4/80和Ly6C的免疫组织化学染色。 介绍了CDAA饮食的肝脏切片。 TLR2中F4/80-和Ly6C-阳性细胞的浸润受到抑制 −/− 老鼠。 原始放大倍数，F4/80为×400，Ly6C为×600。 棒材100µm。 （B，右）F4/80阳性细胞和Ly6C阳性细胞的数量。 （C） 血清ALT水平。 （D） TNFα、IL-1β和MCP-1的mRNA表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 （E，F）包括喂食标准食物（ST）的小鼠的数据。 （E） 体重。 （F） HOMA-IR.ND； 未检测到。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05。 不另说明。； 不重要。
表1 CSAA和CDAA饮食喂养22周后的体重/肝脏/脂肪重量和脂质水平。
标准食物 CSAA公司 CDAA公司 WT小鼠 （n=7） TLR2级 −/− 小鼠 （n=7） WT小鼠 （n=10） TLR2级 −/− 小鼠 （n=7） WT小鼠 （n=10） TLR2级 −/− 小鼠 （n=9） 体重（g，开始，wk=0） 22.5 ± 0.95 21.4 ± 0.65 21.5 ± 1.13 22.9 ± 0.93 23.0 ± 1.74 21.0 ± 0.82 体重（g，结束时，wk=22） 30.9 ± 1.22 29.5 ± 0.73 42.0 ± 2.52 一 33.8 ± 1.75 42.8 ± 2.02 一 33.5 ± 1.94 c（c） 肝脏重量（g） 1.22 ± 0.14 1.15 ± 0.22 1.88 ± 0.21 一 1.37 ± 0.53 2.54 ± 0.38 一 , b 1.54±0.28 c（c） 肝脏重量（%） 3.71 ± 0.75 3.80 ± 0.66 4.44 ± 0.73 一 4.05 ± 0.68 5.50 ± 0.64 一 , b 5.11 ± 0.58 c（c） 附睾脂肪（g） 0.96 ± 0.22 0.87 ± 0.36 2.24 ± 0.76 一 1.25 ± 0.51 2.39 ± 0.52 一 1.01 ± 0.34 c（c） 附睾脂肪（%） 2.85 ± 0.34 2.95 ± 0.54 4.82 ± 0.91 一 4.00 ± 0.77 4.70 ± 0.75 一 3.53 ± 0.67 c（c） 等离子 甘油三酯（mg/dl） 36.5 ± 6.25 33.8 ± 4.82 55.3±7.55 48.8 ± 6.12 70.5 ± 10.6 一 51.1 ± 8.76 总胆固醇（mg/dl） 70.3 ± 6.32 66.9 ± 7.12 143 ± 12.8 一 99.1 ± 15.8 99.6 ± 8.69 82.8 ± 7.93 游离脂肪酸（mEq/L） 0.40 ± 0.11 0.35±0.08 0.47 ± 0.19 0.41 ± 0.13 0.50 ± 0.21 0.36 ± 0.12 肝脏 甘油三酯（mg/g肝脏） 33.5 ± 3.91 30.7 ± 3.67 80.4 ± 8.81 一 54.3 ± 6.92 155 ± 19.5 一 , b 150 ± 20.6 总胆固醇（mg/g肝脏） 11.6 ± 2.56 10.6 ± 1.68 17.5±2.56 12.6 ± 1.05 23.7 ± 3.09 一 15.1 ± 2.61 游离脂肪酸（mEq/g肝脏） 0.60 ± 0.16 0.57 ± 0.17 2.79 ± 0.85 一 2.55 ± 0.51 3.08 ± 0.88 一 2.48±0.62
TLR2抑制肝纤维化 −/− CDAA饮食喂养后的小鼠 肝纤维化是晚期NASH的主要表现。 根据天狼星红染色评估，CDAA饮食22周导致WT小鼠窦周纤维化( ). 相反，TLR2 −/− 小鼠未表现出明显的肝纤维化( ). TLR2中αSMA的表达也减弱 −/− 免疫组织化学检测小鼠( )和免疫印迹( ). TLR2患者肝脏α1（I）、α1（IV）、转化生长因子β1（TGF-β1）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA水平降低 −/− 小鼠与WT小鼠的比较( ). WT和TLR2都不是 −/− 喂食对照CSAA饮食的小鼠出现肝纤维化或HSC激活( A-2E）。
TLR2级 −/− 小鼠肝纤维化较少 WT和TLR2 −/− 给小鼠喂食CSAA饮食（CS）或CDAA饮食（CD）22周。 闭合条表示WT小鼠，开放条表示TLR2 −/− 老鼠。 （A） 天狼星红染色。 原始放大倍数，×400。 棒材100µm。 （B） 天狼星红色阳性区域。 TLR2减轻了肝纤维化 −/− 老鼠。 （C） αSMA的免疫组织化学染色。 原始放大倍数，×400。 棒材100µm。 （D） αSMA的Western印迹。 （E） 成纤维基因的mRNA表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05。 未另行规定。； 不重要。
TLR2配体激活Kupffer细胞和HSC 由于枯否细胞和HSC是参与肝脏炎症和纤维化的原代细胞，我们检测了培养的枯否细胞及HSC是否对TLR2配体产生反应( 27 ). Pam治疗 三 确认 4 ，一种合成TLR2配体，在mRNA处增加WT-Kupffer细胞中的TNFα水平( )和蛋白质水平( ). 在静止和培养激活的HSC中，Pam 三 确认 4 治疗增加了包括TIMP-1、PAI-1和TGF-β1在内的成纤维基因的mRNA表达( )Bambi的mRNA表达降低，Bambi是TGF-β受体信号的诱饵受体( )证明TLR2配体在HSC中诱导促纤维化表型。
合成TLR2配体激活Kupffer细胞和HSC 分离WT Kupffer细胞和HSC，并在5µg/ml Pam存在下培养 三 确认 4 （A） Kupffer细胞中TNFα的mRNA表达。 （B） WT Kupffer细胞培养上清液中的TNFα浓度。 （C） 静止HSC和培养激活HSC中成纤维基因的mRNA表达。 （D） HSC中Bambi mRNA的表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05** p<0.01。 不另说明。； 不重要。
造血细胞包括Kupffer细胞有助于肝脏炎症和纤维化的进展 由于Kupffer细胞和HSC都可能参与TLR2介导的NASH和纤维化，我们想确定表达功能性TLR2的脂肪性肝炎的责任细胞。 我们生成了TLR2骨髓（BM）嵌合小鼠，其中肝巨噬细胞被移植的BM细胞重建。 如前所述，骨髓移植三个月后，90%以上的Kupffer细胞被移植的骨髓细胞替换( 23 , 28 – 30 ). 移植WT BM的小鼠（移植到WT小鼠或TLR2的WT BM-细胞 −/− CDAA饮食喂养的小鼠表现出严重的脂肪变性和炎症细胞浸润( ). 相反，接受TLR2移植的小鼠 −/− BM（TLR2 −/− 骨髓细胞移植到WT小鼠或TLR2 −/− 小鼠）炎症细胞浸润较少( ). TLR2移植小鼠血清ALT和肝脏炎症细胞因子mRNA水平的升高受到抑制 −/− 骨髓细胞( ). 这些结果表明，包括库普弗细胞在内的造血细胞是TLR2介导的肝脏炎症的主要细胞类型。 与肝脏炎症的组织病理学一致，用TLR2重组的小鼠肝纤维化减轻 −/− 通过天狼星红染色评估BM与WT-BM小鼠的比较( ). TLR2移植小鼠肝纤维化基因的mRNA水平受到显著抑制 −/− BM公司( ). 因此，造血细胞（包括Kupffer细胞，但不是HSC）负责TLR2介导的NASH肝炎症和纤维化。
包括Kupffer细胞在内的造血细胞对NASH肝炎症和纤维化的发展至关重要 生成TLR2骨髓（BM）嵌合小鼠，其中肝巨噬细胞由移植的BM细胞重建。 介绍了CDAA饮食小鼠。 （A） HE染色（上部）和天狼星红染色（下部）。 WT BM转基因小鼠出现炎症细胞浸润（箭头所示），TLR2减弱 −/− BM移植小鼠。 TLR2可减轻肝纤维化 −/− BM移植小鼠。 原始放大倍数，×400。 棒材100µm。 （B） 血清ALT水平。 （C） TNFα和IL-1β的mRNA表达。 （D） 成纤维基因的mRNA表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05。
TLR2配体和棕榈酸协同激活Kupffer细胞中的炎症小体 我们试图阐明Kupffer细胞是TLR2介导的NASH的主要细胞类型的机制。 由于棕榈酸被报道为TLR2配体( 19 , 20 )，我们测试了棕榈酸是否能产生由Pam诱导的TLR2介导的细胞因子 三 确认 4 ( ). 与之前的研究相比( 18 , 19 )，WT-Kupffer细胞对棕榈酸（10至500µM）没有增加TNFα和CD68( 补充图2A、2B ). 此外，棕榈酸并没有增加HSC中纤维生成因子的mRNA表达( 补充图2C ). 这些数据表明，单独的棕榈酸在库普弗细胞或HSC中不能起TLR配体的作用。
接下来，我们测试了棕榈酸是否有助于炎症小体的激活。 帕姆 三 确认 4 WT-Kupffer细胞中IL-1β和IL-1αmRNA表达增加，但棕榈酸没有增加( ). Pam也不是 三 确认 4 非棕榈酸增加HSC中IL-1βmRNA( 补充图3A ). 然后，我们测量了上清液中IL-1β和IL-1α的活性形式。 在Pam面前 三 确认 4 ，棕榈酸诱导Kupffer细胞分泌活性形式的IL-1β和IL-1α( ). 相反，通过同样的治疗，HSC不分泌IL-1β( 补充图3B )和棕榈酸或Pam 三 确认 4 单独使用不会诱导Kupffer细胞或HSC分泌IL-1β，这表明炎症小体激活需要TLR2配体和棕榈酸两步刺激。 为了评估TLR2配体和棕榈酸对炎性体的激活，我们测量了包括NLRP3、ASC、NLRP1和AIM2在内的炎性体成分的表达。 其中，Pam 三 确认 4 在Kupffer细胞中诱导NLRP3表达，但在HSC中不诱导( , 补充图3C )而NLRP3不是仅由棕榈酸处理诱导的( ). 与上述结果一致，Kupffer细胞被Pam激发 三 确认 4 棕榈酸对caspase-1活性的影响( ). 正如预期的那样，棕榈酸没有激活以Pam为底物的HSC中的caspase-1 三 确认 4 ( 补充图3D ). 我们进一步检查了肝细胞对Pam的反应 三 确认 4 和棕榈酸。 从用氯膦酸脂质体预处理以耗尽Kupffer细胞的小鼠中分离出的原代肝细胞 体内 Pam不增加IL-1βmRNA和蛋白、NLRP3 mRNA和caspase-1活性 三 确认 4 和棕榈酸处理( 补充图4A-D ). 这些肝细胞对Pam的反应也没有产生TNFα 三 确认 4 ( 补充图4E、F ). 这些结果表明肝细胞不是TLR2介导的炎症小体激活的负责细胞类型。
棕榈酸与TLR2配体协同激活Kupffer细胞中的炎症小体 从WT小鼠中分离出Kupffer细胞，并在5µg/ml Pam存在下培养 三 确认 4 和/或200µM棕榈酸。 （A） 上清液中IL-1β和活性IL-1β的mRNA表达。 （B） 上清液中IL-1α和活性IL-1α的mRNA表达。 （C） NLRP3的mRNA表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 （D） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性。 （E） 显示了caspase-1活性形式的免疫接种。 N.D（不适用）； 未检测到。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05。
TLR2中炎症小体激活减弱 −/− 小鼠 最后，我们研究了炎症小体的激活 体内 CDAA饮食的WT小鼠IL-1βmRNA表达增加( )肝脏中的炎症组分NLRP3( ). 相反，TLR2的这种诱导作用减弱 −/− 小鼠肝脏( , ). 此外，TLR2中门静脉FFA水平较低 −/− 小鼠比WT小鼠( ). 此外，服用CDAA饮食的WT小鼠的肝脏caspase-1活性和血清IL-1β和IL-1α水平增加( )而TLR2 −/− 小鼠肝脏中胱天蛋白酶-1活性降低，血清中IL-1β和IL-1α水平降低( ). 这些结果表明，在喂食CDAA饮食的小鼠中，TLR2是激活炎症小体所必需的。
TLR2中的炎症激活被消除 −/− 小鼠 WT和TLR2 −/− 给小鼠喂食对照组CSAA（CS）饮食和CDAA（CD）饮食22周。 闭合条表示WT小鼠，开放条表示TLR2 −/− 老鼠。 （A） NLRP3的肝脏mRNA表达。 将基因归一化为18S RNA作为内部控制。 （B） 门静脉中的FFA浓度。 （C） 肝脏中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的激活。 （D） 血清IL-1β浓度。 （E） 血清IL-1α浓度。 N.D（不适用）； 未检测到。 数据表示平均值±标准偏差，*p<0.05。 不另作说明。； 不重要。
TLR2和TLR9配体对Kupffer细胞分泌细胞因子的协同作用 由于TLR9信号通过IL-1β促进NASH进展( 9 )，我们研究了棕榈酸是否参与TLR9介导的IL-1生成。 棕榈酸与合成TLR9配体CpG-ODN结合，可在Kupffer细胞中分泌IL-1α和IL-1β( ). 然后，我们检测了TLR2和TLR9配体在Kupffer细胞中的协同作用。 TLR2和TLR9配体协同上调促炎细胞因子的mRNA水平，包括IL-1β、IL-1α、TNFα和MCP-1( ). TLR2和TLR9配体对IL-1α和TNFα蛋白的分泌也有协同作用( ). 这些结果表明TLR2和TLR9信号协同诱导Kupffer细胞产生促进NASH的细胞因子。
TLR2和TLR9配体协同在Kupffer细胞中产生炎性细胞因子 从WT、TLR2中分离出Kupffer细胞 −/− 和TLR9 −/− 小鼠，并在5µg/ml Pam存在下培养 三 确认 4 、5µg/ml CpG-ODN和/或200µM棕榈酸。 上清液中的（A，B，E）IL-1β（A）、IL-1α（B）和TNFα（E，右）蛋白。 IL-1β（C）、IL-1α（D）、TNFα（E，左）和MCP-1（F）的（C-F）mRNA表达。 将基因标准化为18S RNA作为内部对照。 N.D（不适用）； 未检测到。 数据表示平均值±SD，*； 与Pam治疗的WT KCs有显著差异 三 确认 4 或CpG-ODN，#； 与用CpG-DNA处理的WT KCs有显著差异，§； 与Pam治疗的WT KCs无显著差异 三 确认 4 .
讨论 我们之前已经证明，TLR4信号的激活通过HSC中TGFβ信号的放大对肝纤维化的发展至关重要( 28 ). 在小鼠NASH模型中，TLR4配体LPS和TLR9配体细菌DNA在血浆中升高( 9 , 23 )TLR4和TLR9的信号转导促进了NASH的发展。 MyD88是TLR2、TLR4和TLR9的衔接分子，对NASH进展至关重要( 9 ). 本研究表明，在CDAA饮食诱导的NASH中，TLR2信号作为肝脏炎症和纤维化的促进剂( 和 ). 有趣的是，TLR2 −/− 小鼠表现出较少的肝脏炎症和纤维化，但肝脂肪变性程度与WT小鼠相似，这表明TLR2信号传导有助于肝脏炎症和肝纤维化，但肝脏脂质积累与TLR2无关。 尽管TLR2配体可以激活Kupffer细胞和HSC( )，我们的 体内 使用TLR2-BM嵌合小鼠的研究表明Kupffer细胞负责TLR2介导的肝脏炎症和纤维化( ). 在TLR2-d缺乏小鼠中，CDAA饮食中WT小鼠的炎性体激活以及IL-1α和IL-1β的产生受到抑制( ). 在Kupffer细胞中，TLR2配体和棕榈酸介导的协同作用是激活炎性体和产生IL-1α和IL-1β所必需的( ). 我们还发现TLR2和TLR9信号协同诱导炎症细胞因子的产生，从而促进NASH( ).
之前的研究报告称TLR2 −/− 缺乏会加重MCD饮食导致的NASH( 12 ). 当小鼠喂食MCD饮食时，TLR2 −/− 与WT小鼠相比，小鼠更容易受到LPS诱导的炎症和纤维生成反应的影响( 7 , 12 ). 本研究使用的CDAA饮食会导致体重增加、胰岛素抵抗和肝纤维化，而MCD饮食会导致体重减轻、胰岛素信号改善，并且只有非常轻微的肝纤维化。 我们的数据显示，喂食CDAA饮食而非MCD饮食的小鼠的门静脉FFA水平升高( 补充图5 ). 因为大多数NASH患者出现肥胖、胰岛素抵抗和肝纤维化，FFA水平升高( 21 )，我们认为CDAA饮食模型比MCD饮食模型更适合人类NASH模型。 小鼠HFD模型会导致肥胖、胰岛素抵抗和肝脂肪变性，但肝脏炎症非常轻微，不会形成纤维化。 TLR2级 −/− 老鼠和MyD88 −/− 在HFD上，小鼠的脂肪变性比WT小鼠少( 10 , 11 ). 类似地，TLR2 −/− 在CDAA饮食中，小鼠表现出较少的肝脏炎症和纤维化，这会影响肥胖和全身胰岛素抵抗。 特别是TLR2 −/− CDAA饮食组小鼠出现了类似程度的肝脂肪变性，但胰岛素抵抗受到抑制。 另外，与CDAA饮食相比，CSAA饮食引起的肝脂肪变性要少得多，但引起的胰岛素抵抗程度与CDAA膳食相似( )( 9 , 31 ). 这些发现表明，系统性胰岛素抵抗、单纯性脂肪变性和NASH相互影响很大，但可能由不同的病因引起，脂肪变性不是NASH的初步肝脏状况( 32 ).
炎症小体是一个包含NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2的多蛋白平台，通过衔接蛋白ASC激活caspase-1。 活化的caspase-1蛋白水解裂解前IL-1β和前IL-18，生成活性形式的IL-1β与IL-18( 33 ). 最近的一份报告表明，IL-1α的分泌也需要炎症小体的激活( 34 ). 据报道，炎症激活对肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗的发展很重要( 13 , 14 , 16 ). 在这些报告中，NLRP3 −/− 、ASC −/− 和半胱天冬酶-1 −/− HFD组小鼠肝脂肪变性和肥胖减少，胰岛素敏感性提高( 13 , 14 , 16 ). MCD饮食诱导的NASH模型中炎症小体的功能存在争议。 两份报告表明，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1在内的炎症组分的激活促进了MCD饮食诱导的NASH中的肝脏炎症和纤维化( 17 , 35 ). 然而，最近的一项研究表明，缺乏caspase-1、ASC或NLRP3的小鼠在MCD饮食中发生更多脂肪变性( 36 ). 我们目前和以前的研究结果与炎症小体激活促进NASH和胰岛素抵抗的概念一致。 特别是TLR2 −/− 喂食CDAA的小鼠表现出炎症组分的表达降低，包括NLRP3、casapae-1、IL-1α和IL-1β，以及TLR2 −/− 小鼠和IL-1R −/− 与WT小鼠相比，小鼠体重增加减少，胰岛素抵抗、肝损伤、炎症和纤维化受到抑制( 9 ). TLR配体本身足以通过NF-κB诱导NLRP3，但不足以激活炎性体( 37 , 38 ). 其他因素，如特定的细菌毒素、细胞外ATP或某些危险信号，对于炎症组分的组装和激活是必需的( 33 , 39 , 40 ). 饮食因素，如尿酸、胆固醇晶体和棕榈酸也被报道为在巨噬细胞中聚集炎症组分的触发因素( 16 , 41 , 42 ). Wen等人证明，LPS与棕榈酸（NAFLD血浆中最丰富的饱和脂肪酸之一）协同激活BM衍生巨噬细胞中的炎症小体( 16 , 42 ). 同样，我们的数据表明，TLR2或TLR9配体单独不能激活炎症小体，而棕榈酸与TLR2或TLR9配体联用可诱导Kupffer细胞中炎症小体的激活( , 7 ) ( 9 ). 重要的是，在肝巨噬细胞/Kupffer细胞中，LPS本身可以通过MyD88诱导的依赖性TRIF依赖途径激活炎性体产生IL-1β、IL-1α和IL-18( ) ( 43 , 44 ). 尽管棕榈酸被认为是TLR2和TLR4配体，可诱导炎症细胞因子( 18 – 20 )，最近的研究和我们的研究数据都不支持棕榈酸在Kupffer细胞和HSC中的这种作用( 45 ).
从受损肝细胞释放的HMGB-1除了作为NASH的内源性配体TLR4外，还可能激活TLR2。 肠道菌群也可能是TLR2配体的来源，因为TLR2代谢性疾病的表型矛盾 −/− SPF和非SPF条件下影响肠道菌群组成的小鼠( 10 , 11 , 46 ). 口腔细菌有助于包括动脉粥样硬化在内的代谢性疾病的进展( 47 , 48 ). 因此，内源性配体（如HMGB-1）和来源于肠道菌群或口腔细菌的成分可以作为NASH中TLR2的配体。
本研究表明TLR2 −/− 与WT小鼠相比，小鼠表现出NASH降低，但似乎NASH病理学比TLR9更严重 −/− 老鼠( 9 ). 我们的数据表明TLR2 −/− 库普弗细胞对TLR9配体的反应比WT-Kupffer细胞更容易产生炎性细胞因子，而TLR9 −/− Kupffer细胞对TLR2配体的反应与WT-Kupffer-细胞相似( ). 可以想象，TLR9信号可能补偿TLR2中炎症细胞因子的表达 −/− Kupffer细胞，这可能解释TLR9中抑制NASH病理的机制 −/− 小鼠与TLR2的比较 −/− 老鼠。 然而，TLR2中的肝脏炎症 −/− 小鼠仍然少于WT小鼠，因为NASH的进展需要TLR2和TLR9信号的协同作用。 这种协同作用诱导Kupffer细胞产生炎症细胞因子，促进NASH。 特别是，TLR2和TLR9介导的IL-1诱导纤维生成反应，包括TIMP-1和PAI-1的上调，以及TGFβ的内源性抑制剂Bambi的下调； 因此，这些反应的结合促进了HSC的肝纤维化( 9 ).
确认 我们感谢Rie Seki、Karin Diggle、Jingyi Isabelle Song（加州大学洛杉矶分校UCSD医学系）和Yukie Komatsu（秋田大学医学研究生院）提供的卓越技术援助。
财政支持
本研究由美国国立卫生院拨款R01AA02172（ES）、R01DK085252（ES），R24DK090962（DAB），R01GM041804（DAB， Mishima Kaiun纪念基金会（KM）和JSPS（科学研究拨款（C））。
使用了非标准缩写 中高音 丙氨酸转氨酶 宝马 骨髓 中央控制室 CC趋化因子受体 CDAA公司 定义的胆碱缺乏氨基酸 CSAA公司 定义的胆碱补充氨基酸 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验 高等教育 苏木精和曙红 高频驱动 高脂肪饮食 HOMA-IR公司 胰岛素抵抗的稳态模型评价 HSC公司 肝星状细胞 IL-1β 白细胞介素-1β 麦当劳 蛋氨酸和胆碱缺乏 MCP公司 单核细胞趋化蛋白 北美自由贸易区 非酒精性脂肪肝 美国国立卫生研究院 非酒精性脂肪性肝炎 NLRP公司 结节样受体蛋白 PAI-1型 纤溶酶原激活物抑制剂-1 转化生长因子-β1 转化生长因子β1 TIMP-1公司 金属蛋白酶组织抑制剂-1 TLR公司 Toll样受体 肿瘤坏死因子α 肿瘤坏死因子α 重量 野生型
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