Bergman胶质细胞中的自发钙波随着年龄和缺氧而增加，并可能减少组织氧

双光子激光扫描显微镜

实验使用商业双光子显微镜（SP5多光子/共焦激光扫描显微镜；丹麦巴勒鲁普莱卡）、MaiTai HP Ti:Sapphire激光器（Millennia Pro，Spectra Physics，Södertälje，瑞典）和20×1.0 NA水浸物镜（Leica）进行。激发波长设置为820 nm。帧大小通常为256×256像素（207 ms/帧），而512×512或2024×2024像素帧用于获取概览。

合成钙的团负荷²⁺指示剂俄勒冈州绿BAPTA-1/AM（10 mmol/L OGB-1/AM；Invitrogen，Naerum，丹麦）二甲基亚砜加20%Pluronic F-127（Sigma-Aldrich）稀释在人工脑脊液或50μ人工脑脊液中的硫罗丹明101（SR101，Invitrogen）的最终染料浓度为0.8 mmol/L。染料通过康宁Costar Spin-X离心管过滤器（0.22μm、 Sigma-Aldrich），然后通过微量移液管在50-100深处的2-4个位置加载药丸μ小脑皮层表面以下m处（3至5 p.s.i.，10至50秒；气动泵；世界精密仪器公司）(图1B和​和1C1摄氏度).

图像分析

使用用Python编程语言编写的定制软件，使用SciPy和Matplotlib[Hunter:2007]开源库离线处理获得的时间序列帧。自定义软件可从以下网址下载：http://code.google.com/p/image-funcut/并根据GNU通用公共许可证进行分发。时间间隔荧光电影作为tiff文件系列加载。将每个像素中的荧光强度归一化为dF类/SD，其中dF类=F类_T型−F类₀表示荧光时间差T型(F类_T型)和基线期间的平均荧光(F类₀)，而SD表示基线期间的标准偏差。基线周期被视为前250帧。归一化之后是一个平滑过程，其中每个像素中的值的时间序列通过卷积与三次B样条低通滤波器平滑(图1D、左侧和中间面板）。评估钙的振幅²⁺瞬态，响应标准化为基线期间的平均荧光(F类₀)，例如，当检查吡哆醛膦酸-6-唑苯基-2'，4'-二磺酸四钠盐（PPADS，Tocris，Bristol，UK）对Ca的影响时²⁺瞬态（图6E和6G）。

多尺度视觉模型

多尺度视觉模型用于胶质细胞钙的检测和重建²⁺波浪。用a特鲁斯变换后，在每个尺度上对小波系数进行阈值化，并用尺度间连通性标记出结果的邻接区域。¹⁰然后，将代表单个对象的小波系数集用于给定帧中的对象重建(图1D，右侧面板）。随后，相邻帧中的重叠对象被缝合在一起，以创建一个XYT公司3D物体或延时序列，对应于单个胶质波(图1E).

基于自组织映射算法的聚类分析

使用自组织映射算法进行聚类分析，以检测BG和PC中的自发活动。对于延时成像数据的聚类分析，我们应用了自组织映射方法。¹¹此算法将数据模式映射到n个-具有类似行为的单元的尺寸网格。集群数量N个=8被选为最小值，从而形成有意义的空间结构（有关详细说明，请参阅补充信息).

Purkinje细胞与Bergmann-Glia钙瞬变的相关性分析

使用image-funcut在延时电影中发现了自发的PC和BG活动（自定义软件可从以下网址下载http://code.google.com/p/image-funcut/). 感兴趣区域（ROI）分为五组，一个位于中央PC，其余四个位于相邻BG。PC中的ROI大小为细胞体直径的1/2，这消除了相邻BG的光学涂片风险。对55个时间序列进行正相关分析秒，包括自发活动开始前15秒的基线活动（OriginPro 8.6，Linear Fit，Northampton，MA，USA）。

ATP诱发的胶质波

吸管（尖端直径3至4μm） 充满ATP（1.0 mmol/L ATP（Sigma-Aldrich）+15μmol/L Alexa Fluor 954酰肼钠盐（Invitrogen，人工脑脊液）置于分子层25至50深处μ米(图1A和​和1B）。1B年). 用10注入ATPμ分别通过观察移液管尖端的红色烟团和红色和绿色通道中的诱发胶质细胞波来验证s3~5p.s.i.脉冲。

测量组织氧分压

本地tpO₂用改良的克拉克型极谱氧微电极（OX-10；Unisense a/S）记录。小头尺寸（3至5μm） 有保证的可靠tpO₂测量，并且内置的保护阴极从电解质贮存器中去除了所有的氧气。这使我们能够测量tpO₂随着时间的推移，在不同的处理条件下具有良好的长期稳定性（信号漂移，每小时0%至0.5%）。灵敏度场是一个直径是尖端直径两倍的球体。在每次实验之前和之后，使用可重复的氧气测量在空气饱和和无氧的0.9%盐水中校准氧电极。O的尖端₂微电极的位置在20到50之间μATP加载吸管的m(图1A和​和1B）。1B年). 氧电极连接到高阻抗皮安计（PA 2000；Unisense a/S）。信号经过A/D转换，使用Power 1401数据采集接口和Spike 2软件（均来自英国剑桥电子设计公司）以10 Hz的频率记录，并使用空气饱和和无氧盐水中的校准点转换为毫米汞柱。噪声（包括心跳和机械通气伪影）通过使用1秒的时间常数进行平滑处理而最小化（Spike 2软件）。

协议

自发性胶质细胞钙²⁺使用(N个=来自5只小鼠的45个神经胶质波），并以时间投影图像和最大范围显示。

自发胶质细胞钙的年龄依赖性变化²⁺在两组小鼠中对波活动进行了研究：一组成年小鼠，平均年龄为10.1周（范围：7.6-14.6，N个=14）和第二个年龄组，平均年龄=79.6周（范围：79.6至91.3，N个=11). 使用相同的激光强度和数字变焦对两组患者的自发胶质波事件率进行监测。tpO₂由于初步实验表明激光激发电极并可能引发胶质波，所以电极没有放置在组织中。

通过测定tpO检查缺氧对胶质细胞波活动的影响₂其他两组小鼠的水平：一个成年队列，平均年龄9.25周（范围：7.6-14.6，N个=6），在老龄队列中，平均年龄为75.9周（范围：61.0至91.3，N个=5). 血氧饱和度降低对tpO的影响₂在三只成年小鼠中观察到，并在其他五只成年小鼠（平均年龄8.8周；范围8.1至11.0）中检测了氧饱和度降低对自发神经胶质波的影响。

使用tpO检测胶质细胞波与耗氧量之间的关系₂电极和ATP填充吸管放置在分子层中，尖端间距为25至50μm（平均年龄8.9周；范围7.6至14.0，N个=7). ATP诱发的胶质波和tpO₂当激光影响tpO时，以交错方式记录响应₂记录。嘌呤能P2Y受体拮抗剂PPADS（500μm） 局部用药（8.3周；范围7.6至9.0，N个＝4）来验证响应的来源。

在PC层中研究了PC和BG活性之间的耦合，其中PC和BG细胞体可以明显分化（平均年龄44周；范围11至86，N个=4). 在自发神经胶质波和PC活动期间，将感兴趣区域放置在PC和BG细胞体中。

自发性胶质细胞钙波活性随年龄增长而增加

在两组雄性NMRI小鼠（成年小鼠）中检测自发胶质波的发生率和事件率(N个=14）和衰老小鼠(N个=11). 两组患者均使用相同的低激光强度和双光子激光扫描显微镜的数字变焦度。自发性胶质细胞钙的小鼠数量²⁺波在两组之间有显著差异，14只成年小鼠中有3只出现了波(补充电影S2)11只衰老小鼠中的9只(补充电影S3科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫，P（P）=0.00366;图3A). 在整个分子层和PC层均观察到自发胶质波。与成人队列相比，老龄队列中的自发波事件率显著增高（2.62 vs.0.13神经胶质波/10分钟/mm²,P（P）=0.00737;图3B和​和3C）。3C公司). 年龄和波事件率之间存在显著的正相关（斜率为0.276，R（右）²=0.289,P（P）=0.0033,数据流=23;图3C). 注意，九只有胶质波的衰老小鼠中，有八只的胶质波事件率大于成年小鼠的平均事件率+2SD(图3C). 在未观察成年小鼠自发神经胶质波的情况下，连续5或10分钟进行双光子激光扫描，扫描时间长达4小时。

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图3

年龄依赖性自发神经胶质钙（Ca）增加²⁺)波活动和基底组织O减少₂张力（tpO₂). (A类)自发胶质细胞钙的小鼠发生率（%）²⁺与成年小鼠（14只小鼠中的3只；平均年龄10.1周；Kolmogorov–Smirnov试验，P（P）=0.00366). (B类)胶质钙²⁺波事件率（胶质波/10分钟/mm²)在老龄化队列中显著高于成年队列（ANOVA，P（P）=0.00737). (C类)年龄与神经胶质细胞Ca呈显著正相关²⁺同时分析两组时的波事件率（红线；斜率，0.276，R（右）²=0.289,P（P）=0.0033,数据流=23). 衰老小鼠的胶质波事件发生率高于成年小鼠(P（P）=0.00112，方差分析）。一只成年小鼠和八只老龄小鼠的胶质波事件率高于成年组的平均+2SD水平。(D类)基本氧张力（tpO₂)在衰老小鼠中显著降低(N个=5）比成年小鼠（ANOVA，P（P）=0.0301;N个=6只成年小鼠；左），但血氧饱和度（sO）没有差异₂; 方差分析，P（P）=0.785; 右侧）。

缺氧诱导的自发性胶质钙波

tpO₂在另外两组成人的小脑皮层分子层中监测（毫米汞柱）(N个=6）和衰老NMRI小鼠(N个=5）使用克拉克式O₂电极（尖端直径=3μm） ●●●●。静息皮层tpO₂老龄小鼠的汞柱含量不到成年小鼠的一半（19.5对43.8毫米汞柱；图3D). 这一发现表明，与成年小鼠相比，衰老过程中大脑能量稳态更依赖于氧水平。

静息时脑氧分压与自发胶质细胞钙的发生²⁺在衰老过程中，脑电波似乎成反比，我们验证了脑氧分压可以独立于年龄影响自发神经胶质波活动的假设。使用一组成年小鼠(N个=5），tpO₂在小脑皮层中，通过去除空气中的氧气补充物而减少。这导致了血液的血氧饱和度（sO₂)显著减少(图4A，上部痕迹）和皮质tpO₂减少20%至85%(图4A，下迹线）。sO的减少₂不影响潮气末CO₂(图4A，第二迹线）。这些影响持续到皮质tpO₂恢复供氧后恢复正常。重要的是，在tpO期间₂减少，自发神经胶质波的事件率增加(图4B，左起第二个面板），并在tpO时意外地进一步增加₂返回基线(图4B，右侧第二个面板）；相反，正常氧1小时后，波事件率逐渐下降(图4B，右侧面板）。图4C显示sO₂低氧前、低氧时、恢复常压后5～25分钟和1小时的自发神经胶质波活动。

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图4

自发胶质细胞钙（Ca²⁺)急性缺氧引起的波活动。(A类)原始数据显示诱导急性缺氧20分钟，如血液O减少所示₂饱和度（第一次追踪）。急性缺氧以稳定的潮气末CO为特征₂（第二次追踪）、稳定的动脉血压（第三次追踪）和脑组织O减少₂张力（tpO₂，第四个追踪）。(B类)显示自发胶质细胞Ca轮廓的伪彩色时间平均图像²⁺缺氧诱导前、中、后的波。急性缺氧期间胶质波事件率增加（第二组），恢复常压后继续增加（第三组）。恢复常压1小时后，胶质细胞波活性下降，但没有恢复到基线水平（第四组）。每个胶质细胞波用不同的颜色表示；等高线表示每个波的最大范围。(C类)总结O的箱线图₂饱和度（蓝色方框，时间控制：虚线浅蓝色方框）和胶质波事件率（胶质波/10分钟/mm²，红色方框，时间控制：红色虚线方框）急性缺氧之前、期间和之后(N个=5). 在缺氧期间，五只小鼠中有三只小鼠的胶质波事件率增加，而在恢复常压20分钟后，五只老鼠中有四只进一步增加。在与缺氧组相同的时间段，在正常氧条件下进行时间控制记录(N个=8).

ATP诱发的胶质钙波与耗氧量

胶质细胞钙²⁺通过皮质内注射ATP可以在小脑中诱发波。²我们发现ATP（10μs、 3至5 p.s.i.）比自发的神经胶质波传播得更远，持续时间更长(图5A，最大直径～100μ25.2至28.0秒）。ATP诱发的胶质细胞Ca增加²⁺荧光（dF类/F类钙²⁺)当以60秒和90秒的间隔注射ATP时，其重复性较好，但当以较短的间隔注射时，其振幅降低(图5B)，表明该组织在从前一波中恢复时是难治性的。

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图5

ATP诱发胶质细胞钙（Ca）的作用²⁺)组织O上的波₂张力（tpO₂). (A类)显示应用ATP加Alexa Fluor 954（红点用黑色箭头表示）如何诱发钙增加波的时间序列²⁺荧光（dF类/F类₀)因为Bergmann胶质细胞活化。(B类)重复诱发神经胶质波的时间进程表明F类/F类₀钙²⁺当用药间隔小于60秒时，振幅降低。以90秒（蓝色轨迹）和60秒（绿色轨迹）的注射间隔诱发可再现的反应。当以40秒（红色迹线）和20秒（黑色迹线）的间隔给予ATP时，响应幅度随着注射次数的增加而依次下降。(C类)tpO的同步记录₂（蓝色轨迹）和dF类/F类₀钙²⁺（红色轨迹）在以40秒的间隔三次应用ATP期间。随着申请数量的增加，这两种反应逐渐减少。注意，在同时记录胶质细胞波活动和tpO的过程中₂、tpO₂由于激光扫描产生高频噪声，电极位于双光子焦平面外。(D类)平均tpO₂对诱发胶质波的反应（±SEM，N个=3). tpO的初始增长₂是ATP注入的伪影。tpO的减少₂以黄色突出显示。(E类,F类)P2Y受体拮抗剂PPADS对dF/SD-Ca的影响²⁺和tpO₂响应。ATP诱发的胶质波诱导Ca增加²⁺（dF/SD；E类)以及tpO的减少₂(F类). 两个响应（蓝色轨迹E类和F类)通过局部应用PPADS（500μmol/L，青色痕量E类和F类). 红色箭头表示PPADS应用之前（大箭头）和之后（小箭头）的响应。两张图中的插图显示了平均响应±SEM(N个=4个响应）。(G公司)tpO₂响应（如所述测量F类)作为d的函数F类/SD钙²⁺振幅（按照E类)在应用PPADS（蓝圈）之前和之后诱发。PPADS抑制了两种tpO₂和Ca²⁺胶质细胞波幅相伴，产生正相关（红线；R（右）²=0.570,P（P）=0.00009,N个=4只小鼠）。

众所周知，通过胶质细胞膜的钙通量可以激活胶质细胞钠⁺-K（K）⁺ATP酶¹²这可能会增加胶质细胞的能量消耗，我们检测了脑氧张力（tpO₂)存在ATP诱发的胶质细胞钙²⁺波浪。ATP诱发波引起tpO的时间锁定变化₂(图5C). 平均诱发tpO₂使用60秒应用间隔的响应包括tpO的短暂增加₂持续1至2秒，这可能是由于皮质内注射ATP导致的压力伪影，随后tpO减少了约20秒₂(图5D,N个=3). 当以小于60秒的间隔注射ATP时，诱发的tpO₂减少与胶质细胞钙平行减少²⁺瞬态(图5C). P2Y受体拮抗剂PPADS（500μmol/L）阻断诱发的tpO₂减少(图5F)和胶质细胞Ca²⁺瞬态（dF类/SD；图5E). tpO的大小之间存在显著的正线性相关₂减少和胶质细胞钙²⁺控制条件下和PPADS存在下的瞬态(R（右）²=0.557,P（P）=0.00009,N个=4;图5G). 这一发现表明诱发的tpO₂ATP-依赖性钙的增加可能导致体内钙的减少²⁺-受激K⁺BG的摄取，来自PC活性的增加（见下文），来自小部分皮质内血管的血管收缩，或来自这些可能性的组合。

自发胶质波的表征

我们发现胶质细胞钙²⁺波具有最大传播距离和椭球形状，这与之前报道的啮齿动物小脑的研究结果一致。²我们还报道了自发神经胶质波并没有侵入以前由自发波占据的皮层区域，这是以前没有描述过的现象，提供了自发神经胶钙后BG不应期的证据²⁺波浪。本研究也证实了先前报道的ATP诱发胶质波后BG不应性状态。²此前也有报道称，燃烧后的BG耐火状态。⁶总之，这些发现表明胶质细胞钙²⁺波浪确实具有生理相关性体内麻醉小鼠和清醒小鼠。

衰老和低氧对自发性胶质波钙活性的影响

衰老小鼠自发胶质细胞钙的发生率较高²⁺波浪比成年老鼠多。胶质细胞钙的年龄依赖性²⁺之前在视网膜中已经显示出波的活动。⁸除了随年龄增长而增加的波事件率外，我们还发现休息时的tpO₂在衰老小鼠的小脑皮层中减少。在人类中，基础血流和皮质O₂随着年龄的增长，消耗量会发生不成比例的减少，血流量减少最为显著，导致氧浓度增加₂血液提取率随年龄增长而变化。²³这些改变意味着静止的tpO₂随着年龄的增长而减少，这是我们在本研究中观察到的衰老小鼠。我们发现自发胶质波事件率增加，静息皮层tpO减少₂在老龄小鼠队列中，我们假设皮层tpO₂可能在诱导神经胶质波中发挥作用。

低氧血症的作用

我们发现降低tpO₂在大脑中导致神经胶质波活动增加。这可能是NAD（+）/NADH氧化还原状态改变的结果，因为NADH的增加反映了低tpO₂在脑组织中²⁴细胞溶质NADH的增加导致Ca的显著增加²⁺星形胶质细胞中的信号传导。²⁵因此，胶质细胞钙²⁺NAD（+）/NADH氧化还原状态的变化可能会引起波活动。²⁶缺氧增加了质膜Cx43半通道的数量。²⁷自发胶质细胞活性和半通道的增加导致ATP释放增加，触发胶质细胞Ca²⁺波浪。随后ATP通过半通道流出导致其代谢物腺苷的积累，腺苷是一种有效的神经保护剂，²⁷这表明胶质细胞波活性的增加可能是一种适应过程，可以预先处理组织，增加细胞对缺氧的抵抗力，从而保护大脑功能和体内平衡。²⁶

胶质波对耗氧量的贡献

ATP诱发的胶质波引起tpO的小幅度降低₂，表明O有小幅增加₂消费。这可能反映出钙导致PC活性增加²⁺-从属K⁺在BG中的吸收，^7,12但也有可能组织O的减少₂是局部血管收缩引起的。这两种可能性都表明小脑O₂胶质钙降低了可用性²⁺波浪，这可能导致O值较低₂使衰老小鼠紧张，增加组织敏感性。未来的实验将使用带压电聚焦的双光子激光扫描显微镜来解决这个问题。

Bergmann-Glia和Purkinje细胞相互作用

我们观察到，胶质细胞波活动是由单个BG细胞启动的，从该细胞波再生传播到相邻BG。BG中的自发活动也传播到PC，尽管与相邻BG相比，其响应强度较低。自发活动BG与PC之间的相关性相对较低，在某些情况下，电脑根本没有反应。这可能与所报告的PC的双稳态有关，²⁸其中Ca²⁺BG增加，细胞外K减少⁺可能会增加神经元活动。⁷增加的Ca²⁺胶质细胞波期间BG中的信号传导与Ca增加相关，时间锁定在Ca增加之前²⁺PC活性。相比之下，自发PC-Ca²⁺与之前相比，瞬态没有扩散到BG在体外对海马体的研究表明，神经元活动通过细胞外K间接触发星形细胞活动⁺.⁷因此，我们发现胶质细胞波活动不是由PC活动激活的，而是起源于BG。

作者感谢Micael Lönstrup提供了出色的手术协助，Sanne Barsbale Jessen提供了有益的讨论，Krzystof Kucharz提供了数字协助，Tycho Hoogland提供了评论和建议。

作者贡献

CM设计了研究并进行了研究；CM和AB开发了分析工具并分析了数据；CM、KT、AB和ML撰写了论文。