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《公共科学图书馆病理学》。2013年1月；9（1）：e1003124。
在线发布2013年1月24日。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1003124
PMCID公司：下午3点554583分
PMID：23358889

IFITM蛋白质限制病毒膜半融合

李坤,#1 鲁本·马科斯扬,#2 郑一民,#1 奥塔维亚·戈尔费托,三 布列塔尼·本加特,4 李明华,1 丁石磊,5 何玉仙,6 陈亮,5,7 詹姆斯·C·李,4 恩里科·格拉顿,三 弗雷德里克·科恩,2和刘珊璐1,*
迈克尔·埃莫曼，编辑器
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摘要

干扰素诱导跨膜（IFITM）蛋白家族代表了一类新的细胞限制因子，可阻止病毒复制的早期阶段；其潜在机制目前尚不清楚。在这里，我们提供了证据表明，IFITM蛋白限制了所有三类病毒膜融合蛋白的代表诱导的膜融合。IFITM1显著抑制了几乎所有检测到的病毒融合蛋白诱导的合胞体形成和细胞间融合；IFITM2和IFITM3也强烈抑制其融合，其效率在一定程度上取决于细胞类型。此外，用干扰素处理细胞也显著抑制病毒膜融合和进入。以雅格西克羊逆转录病毒包膜和甲型流感病毒血凝素为研究模型，我们发现IFITM介导的膜融合限制并不处于受体和/或低pH介导的触发步骤；相反，半融合的产生基本上被IFITM阻断了。氯丙嗪（CPZ）是一种已知的促进从半融合到完全融合过渡的化学物质，但它无法挽救IFITM介导的融合限制。相反，油酸（OA），一种脂质类似物，能产生负的自发曲度，从而促进半融合，实际上克服了限制。为了探讨IFITM蛋白对膜分子顺序和流动性的可能影响，我们使用Laurdan进行荧光标记，结合双光子激光扫描和荧光寿命成像显微镜（FLIM）。我们观察到表达IFITM蛋白的细胞膜的广义极化（GPs）和荧光寿命大大增强，表明分子有序度较高，流化膜较少。总之，我们的数据表明，IFITM蛋白在形成半融合之前抑制了病毒膜融合，并表明它们可能通过降低膜流动性和使细胞膜外叶产生正的自发弯曲来实现。我们的研究为理解IFITM蛋白家族如何限制病毒膜融合和感染提供了新的见解。

作者摘要

许多致病病毒都含有一个包膜，必须与细胞膜融合才能进入并引发感染。这一过程由病毒表面的一种或多种糖蛋白介导，称为病毒融合蛋白。最近，一个干扰素诱导跨膜（IFITM）蛋白家族被证明可以阻止病毒感染，包括高致病性病毒的感染。在这里，我们提供证据表明，这些IFITM蛋白能够有效抑制所有三类病毒融合蛋白的代表诱导的膜融合。有趣的是，我们发现，阻断并不是在受体结合或低pH值的步骤上触发膜融合所需病毒融合蛋白的构象变化。相反，我们发现半融合的产生是由IFITM蛋白阻断的，半融合是一种中间产物，在这种中间产物中，两个脂质双层的外膜已经融合，但内膜仍然保持完整。我们进一步证明IFITM蛋白的过度表达会使细胞膜僵化，从而降低膜流动性和融合潜能。我们的研究为理解IFITM蛋白如何限制病毒进入和感染提供了新的见解。

介绍

干扰素（IFN）系统是宿主抵抗病原体入侵（包括病毒感染）的第一道防线。它通过产生数百个IFN刺激的基因（ISG）来调节多种生物功能，从而起到保护作用。许多ISG（如PKR、RNase L、ISG 15等）已被鉴定为抑制病毒复制，其机制尚不明确（参考文献综述[1]). 最近几年的一个令人兴奋的进展是发现了一些新的ISG，也称为细胞限制因子（如APOBEC3G、Trim5α和Tetherin等），它们本质上阻止了逆转录病毒复制的不同步骤[2],[3],[4],[5],[6]值得注意的是，包括逆转录病毒在内的许多病毒已经进化成可以获得各种策略来规避干扰素介导的限制[7],[8],[9]这种固有免疫被认为在病毒-宿主共同进化和病毒发病机制中起着关键作用[7],[10].

干扰素诱导跨膜（IFITM）蛋白家族属于一组小ISG（～15 kD），最近被证明可以阻断病毒复制的早期阶段[11],[12]IFITM蛋白最初是通过RNAi基因筛查鉴定出来的，并显示能抑制甲型流感病毒（IAV）、西尼罗河病毒和登革热病毒的感染，现在已知其能有效限制一些高致病性病毒的进入和感染，包括HIV-1、丝状病毒和SARS冠状病毒[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]在人类中，IFITM蛋白至少有4个功能成员；IFITM1、2和3在多种人体组织和细胞系中表达，IFITM5仅限于骨骼，参与矿化[11]所有这些人类IFITM蛋白都被证明可以限制病毒的进入和感染，IFITM3通常被认为是最有效的[12],[13],[14],[15],[17],[18]最近的一项研究表明，IFITM3蛋白显著限制了流感相关的发病率和死亡率，进一步强调了IFITM2的关键作用体内 [19]Yount及其同事最近表明，小鼠IFITM3蛋白不仅是棕榈糖基化的，而且是泛素化的，并且这些翻译后修饰明显调节IFITM2的细胞定位及其抗流感活性[20],[21]虽然有人认为IFITM可能会阻止病毒膜融合[12],[13],[15]，目前仍缺乏直接证据，IFITM蛋白如何限制病毒进入和感染目前尚不清楚。

膜融合是包膜病毒进入宿主细胞并引发感染的重要步骤，这一过程由病毒颗粒表面的病毒融合蛋白介导[22]为了防止过早激活，成熟病毒颗粒中的病毒融合蛋白通常是亚稳的，并以高能状态存在。一旦受到特定的细胞刺激（如受体结合、低pH值或两者兼而有之）触发，它们就会经历一系列构象变化，导致病毒融合蛋白的融合肽插入靶细胞膜，导致半融合、气孔形成、扩张，最终完全融合[23],[24],[25],[26]虽然病毒膜融合的一般原理已被广泛研究，但控制这一过程的详细分子机制仍不清楚[22]特别是，病毒膜融合是如何由细胞因子而非特定触发因子（如受体结合、低pH值、组织蛋白酶裂解等）调节的，这仍然是一个需要探索的新兴课题。

在这项工作中，我们试图确定细胞IFITM蛋白限制病毒膜融合和进入的机制。由于Jaagsiekte绵羊逆转录病毒（JSRV）包膜蛋白（Env）和IAV血凝素（HA）蛋白的一些优点，我们选择它们作为研究的模型系统。JSRV是一种简单的逆转录病毒，环境介导的膜融合和进入需要受体结合和低pH值；最初的受体结合启动了随后的低pH依赖性构象变化，这是完全激活所必需的[27],[28],[29],[30]这种非常规的两步触发机制最初是在禽肉瘤白血病病毒（ASLV）中发现的[31]，现在已被建议用于其他包膜病毒，包括丙型肝炎病毒[32]与大多数依赖pH的病毒相比，JSRV具有相对较高的融合pH阈值（～pH6.3），融合过程可能发生在富含GPI锚定蛋白的内体室（GEEC）或小窝中[27],[33],[34]因此，对JSRV环境介导的融合的研究将为IFITM蛋白的作用机制带来新的见解。IAV是一种依赖pH的原型病毒，其进入和感染已被证明受到IFITM蛋白，特别是IFITM3的显著限制，这两种蛋白在体外和体内 [12],[13],[19]除了属于I类融合蛋白的JSRV Env和IAV HA外，我们还探讨了IFITM蛋白对分别代表II类和III类病毒融合蛋白的Semliki Forest virus（SFV）E1/E2和水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白诱导的膜融合的抑制作用[22]因此，本研究揭示的机制可能适用于其他病毒融合蛋白，并共同为我们理解IFITM蛋白限制病毒膜融合和进入的机制提供了关键的新见解。

结果

IFITM蛋白的过度表达不同程度地限制了JSRV、IAV、10A1 MLV和VSV的进入

先前的研究侧重于IFITM3，并表明其主要作用于晚期内体或溶酶体，以限制在较低pH值（～pH 5.5）下融合的病毒，而不是早期内体中的病毒[12],[13],[14],[18]在这里，我们检测了IFITM蛋白是否也限制JSRV的进入，JSRV在pH 6.3或更高时容易发生环境介导的膜融合[27],[33]我们通过建立几个稳定的表达人IFITM1、2或3的株系，并测试其对JSRV进入的影响，以及其他几种病毒的影响，从而实现了这一目的。我们观察到，所有三种IFITM蛋白都能有效抑制HTX细胞（HT1080细胞系的一个亚克隆）中携带IAV HA/NA或VSV-G的MoMLV伪病毒的感染，效率大致相当(图1A; p<0.01）。有趣的是，IFITM1对HTX细胞中JSRV假病毒感染的抑制作用（p<0.01）远大于IFITM2和3（分别为p<0.01和p<0.05）(图1A). IFITM1也适度但持续地抑制了两亲性10A1 MLV伪病毒的感染（p<0.05），但IFITM2和3没有抑制甚至有些增强进入(图1A). 293个细胞也获得了类似的结果，其中IFITM1对JSRV进入的限制最大（p<0.01），尽管这些IFITM蛋白对VSV和IAV进入的总限制效率相对较低(图1B)，与之前的报告一致[13]免疫印迹显示，所有三种IFITM蛋白均在HTX和293细胞中表达(图1C和D)IFITM3在HTX细胞中的表达水平相对较低(图1C)，这可能是其在该细胞系中抗病毒活性相对较低的原因。

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IFITM蛋白对JSRV、10A1 MLV、IAV和VSV的进入具有不同的限制作用。

(A类)稳定表达IFITM1、2或3的HTX细胞感染了编码碱性磷酸酶（AP）的MLV假病毒。感染三天后，将感染细胞固定并染色以检测AP活性。计算AP阳性细胞的病灶，并将其归一化为感染相同数量假病毒的亲代HTX细胞的病灶（Mock）。(B类)293个稳定表达IFITM1、2或3的细胞被携带指示病毒糖蛋白的MLV-GFP假病毒感染。感染后2天，用流式细胞仪检测假病毒感染性；感染率与模拟对照组的感染率进行了标准化。(C、 D类)从（A）和（B）所示实验中使用的HTX（C）和293（D）细胞收获的细胞裂解物的免疫印迹。抗-FLAG和抗β-肌动蛋白分别作为检测IFITM和β-肌动蛋白的主要抗体。(E类)用500单位IFN-α2b处理293个细胞24小时，并感染指示的MLV-GFP假病毒。在没有干扰素-α2b治疗的情况下，病毒感染性被归一化为细胞感染性。(F类)靶向IFITM1或3稳定表达对照shRNA或shRNA的K562细胞[13]感染了带有指示病毒糖蛋白的MLV-GFP伪病毒。通过流式细胞仪测量感染性，并将其归一化为感染相同数量的指示假病毒的亲代K562细胞（Mock）的感染性。通常情况下，所有GFP假病毒感染均使用0.05–0.2的MOI。在所有情况下，显示了至少三个独立实验的平均值±SD；*表示p<0.05；**表示p<0.01。

为了确定在病毒进入时观察到的IFITM蛋白的表型不是由于其N末端附着的FLAG序列所致，我们创建了稳定表达野生型（WT）IFITM蛋白质的HTX细胞。我们观察到IFITM1、2和3对所有测试的病毒假型都有类似的限制模式(图S1). 总之，这些结果表明，与IFITM2和3相比，IFITM1主要限制JSRV进入，而这三种人类IFITM蛋白有效限制IAV和VSV进入，效率相似。

用干扰素刺激细胞或shRNA耗尽IFITM表达可明显调节JSRV、IAV、10A1 MLV和VSV的进入

IFITM蛋白通常在细胞中以基础水平表达，但可被I型和II型IFN显著诱导[35]为了检测IFN是否阻断病毒进入，我们用IFN-α2b（I型IFN的一个亚类）处理293或HTX细胞，并检查其对假病毒感染的影响。我们观察到IFN-α2b显著抑制JSRV、VSV和IAV伪病毒对293细胞的感染(图1E; p<0.01；未显示HTX电池的数据）。有趣的是，10A1 MLV的进入也被IFN-α2b治疗轻微但持续地阻断(图1E; p<0.05），与之前的报告类似[13],[36]干扰素对IAV和VSV进入293细胞的抑制作用更强(图1E)相对于单个IFITM蛋白的过度表达(图1B)这是意料之外的，因为IFITM蛋白在过度表达时的水平高于IFN诱导时的水平(图S2). 也许干扰素诱导的IFITM协同抑制病毒进入；此外，除IFITM外的ISG可能有助于观察到干扰素治疗293细胞的效果。在病毒感染期间使用的干扰素剂量没有观察到细胞毒性。

鉴于HTX或293细胞不表达显著水平的内源性IFITM，尤其是IFITM1和3(图S2)接下来，我们使用了一种髓细胞白血病细胞系K562细胞，来研究IFITM表达缺失是否会增强病毒进入。我们观察到，确实，在稳定表达抗IFITM1或3 shRNA的K562细胞中，JSRV和IAV的进入，以及VSV的进入在较小程度上得到增强（哈佛医学院Michael Farzan和I-Chueh Huang的馈赠）[13]与亲代K562细胞相比(图1F; p<0.01或0.05）。靶向IFITM1的shRNA也略微增强了10A1 MLV的进入，但没有统计学意义(图1F; p> 0.05）。shRNA没有显著降低K562细胞中的IFITM2，因此我们无法评估减少该蛋白的后果（数据未显示）。总的来说，这些结果表明内源性IFITM蛋白在本质上限制了JSRV、IAV和VSV的进入。

IFITM表达不影响JSRV-Env与其Hyal2受体或受体介导的融合激活启动子的结合

IFITM1先前已被证明与小窝蛋白-1有关，小窝蛋白-1是一种已知在小窝蛋白介导的内吞作用中发挥重要作用的蛋白质[37],[38]鉴于JSRV受体透明质酸酶2（Hyal2）是一种GPI-锚定蛋白，定位于脂筏中，JSRV可能使用富含GPI-锚固蛋白的内体室（GEEC）和/或小泡通道进入[33],[34],[39],[40]，我们考虑了IFITM1可能优先干扰JSRV Env与Hyal2的结合，从而限制病毒进入。我们利用了我们之前创建的JSRV SU-human IgG融合蛋白（JSU-hFc）的可溶性形式，并进行了在体外表达单个IFITM蛋白的HTX细胞与功能性人Hyal2的结合试验[27],[28],[29],[41]流式细胞术分析显示，表达IFITM蛋白的HTX细胞（包括IFITM1）的荧光位移与亲代细胞的荧光位移相似(图2A和B). 这表明IFITM蛋白的表达并不影响JSRV Env与表达Hyal2受体的HTX细胞的结合。我们还使用表达Gag YFP的MoMLV（Walter Mothes的同类礼物）携带JSRV Env的假病毒颗粒进行了病毒结合测定[28],[42]; 同样，在表达IFITM蛋白的细胞和亲代细胞中观察到类似的荧光强度(图2C和D). 用抗FLAG抗体检测HTX细胞表面IFITM蛋白的表达。与IFITM2和3相比，IFITM1的表面表达水平相对较高，但总的来说，荧光信号较低，两者的差异无统计学意义(图2E和F; 数据未显示）。我们得出结论，包括IFITM1在内的IFITM蛋白的表达不会影响JSRV Env与其细胞表面Hyal2受体的结合。

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IFITM蛋白的表达不会影响JSRV Env与表达Hyal2受体的细胞的结合，也不会干扰受体介导的融合激活启动。

(A类)检测JSRV Env与表达IFITM的细胞的结合。稳定表达指示IFITM蛋白的HTX细胞与纯化的JSRV SU-人IgG Fc蛋白在4℃孵育；在与FITC结合的抗人Fc抗体孵育后，用流式细胞术分析细胞。显示了一个典型实验的代表性直方图。箭头表示二级抗体单独控制。(B类)JSRV Env结合数据的定量分析如（A）所示。将从（A）中获得的荧光强度（几何平均值）平均并归一化为模拟对照的荧光强度。显示了至少三个独立实验的平均值±SD。(C类)JSRV伪病毒与表达IFITM细胞结合的检测。表达IFITM蛋白的HTX细胞与含有MLV-Gag-YFP的纯化JSRV假病毒孵育，以允许病毒结合。细胞清洗、固定并通过流式细胞仪进行分析。“对照”表示在没有JSRV Env的情况下用MLV Gag-YFP伪病毒培养的细胞。显示了具有代表性的流式细胞术曲线。(D类)JSRV伪病毒结合实验的定量分析如（C）所示。对三个独立实验的荧光强度进行了平均和绘制。(E类)IFITM蛋白在HTX细胞表面的表达。用抗FLAG抗体检测其表达，并用流式细胞术进行分析。(F类)定量分析IFITM在细胞表面的表达，如（E）所示。值是至少五个独立实验的平均值±SD。(G和H)检查IFITM对JSRV SU脱落的影响。用编码FLAG标记的JSRV-Env和FLAG标记的IFITM的质粒共转染293T细胞。在存在指定数量的sHyal2的情况下，对细胞进行代谢标记和追踪。收集细胞裂解物和培养基，并用抗FLAG珠免疫沉淀。样品通过SDS-PAGE进行解析，并进行自动放射自显影。（G） 转染细胞中JSRV Env和IFITM的表达。Env：JSRV Env的全长；SU：表面亚单位；TM：跨膜亚单位。（H） JSRV SU在培养基中的脱落。注意随着sHyal2含量的增加，表达JSRV Env的细胞中SU脱落增加；表达IFITM的细胞和模拟对照细胞之间的脱落没有显著差异。通过将无sHyal2刺激的模拟对照信号设置为1.0，计算出棚SU信号的相对强度；三个独立的实验用于量化。

JSRV Env使用双重触发机制，其中受体结合使Env经历低pH依赖性构象变化，从而导致融合[28],[29]这一不寻常的特征使我们能够检查IFITM蛋白是否会影响受体介导的融合启动。我们对共表达IFITMs和JSRV-Env的293T细胞进行了代谢标记，并确定了在存在或不存在可溶形式的Hyal2（sHyal2）的情况下JSRV-SU的脱落。在我们之前的研究中，我们已经确定JSRV SU脱落到培养基中是Hyal2受体介导的JSRV Env融合激活触发的重要指标[28],[29],[30]在这里，我们观察到，从表达IFITM1、2或3的293T细胞培养基中获得的JSRV SU水平与亲代细胞的水平相当，并且它们都随着sHyal2的存在而以剂量依赖的方式增加(图2H). 这些放射性标记细胞中JSRV Env表达的总水平大致相等，这可以通过Env前体和处理后的TM的强度来证明(图2G). 总之，我们得出结论，包括IFITM1在内的IFITM蛋白的过度表达不会影响JSRV Env的表达和运输，也不会损害受体介导的融合激活启动。

IFITM1深刻抑制JSRV Env和IAV HA诱导的合胞体形成；这种影响发生在广泛的pH值范围内

合胞体形成和细胞间融合检测有助于理解膜融合，包括病毒膜融合[43]我们试图获得IFITM蛋白可能限制JSRV Env和其他病毒融合蛋白介导的病毒膜融合的直接证据。由于JSRV Env要求在低pH值下检测膜融合的Hyal2过度表达[27]，我们生成了稳定的HTX和293细胞系，这些细胞系过度表达Hyal2和IFITM1、2或3，作为以下所述合胞体形成和细胞-细胞融合分析的靶细胞。对于过度表达Hyal2（293/LH2SN，模拟）的亲代293细胞，我们观察到在pH5.0脉冲后5-10分钟内，JSRV Env和IAV HA几乎完全诱导了合胞体形成（～100%）(图3A). 与此形成鲜明对比的是，在表达IFITM1的293/LH2SN细胞中，即使在1小时的恢复期后，也很少检测到合胞体的形成(图3A). 表达IFITM2的293/LH2SN细胞的合胞体形成也显著减少，但表达IFITM3的细胞，尤其是JSRV Env(图3A). 这些IFITM蛋白对10A1 MLV（一种在中性pH下融合的病毒，图2B)[12],[13]因此，我们在中性pH下测量了10A1 MLV Env（其R肽被删除）诱导的合胞体形成，发现如预测的那样，IFITM对合胞体的形成没有显著影响(图3A). 用融合指数（分别为0.51±0.06、0.50±0.05和0.52±0.04）量化10A1 MLV Env在IFITM1、2和3表达细胞中的融合效率，与亲代细胞（0.52±0.05）的融合效率相当。在表达WT IFITM蛋白（无N末端FLAG标签）的细胞中，IFITM对JSRV Env和IAV HA的合胞体抑制顺序类似，即IFITM1>IFITM2>IFITM3(图S3). IFITM对293/LH2SN细胞中JSRV Env和IAV HA合胞体形成的差异抑制作用不太可能，因为它们的IFITM表达水平通过Western blots检测(图3B). 对共表达JSRV Env和WT IFITM蛋白的293T细胞进行流式细胞术分析表明，表达IFITM细胞表面的JSRV Env水平与模拟对照组相当(图3C)这表明合胞体形成减少并非由于Env表面表达的改变。

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表达IFITM蛋白或用IFN处理细胞可抑制JSRV Env和IAV HA诱导的合胞体形成。

(A类)用编码R肽缺失的JSRV Env、IAV HA或10A1 MLV Env（10A1 Env R−); 细胞在pH5.0缓冲液中处理1分钟（对于JSRV Env和IAV HA）或不处理（对于10A1 MLV Env），并使用荧光显微镜分析合胞体的形成。注意，相对于IFITM2和3，IFITM1对JSRV Env和IAV HA的抑制作用更强；10A1 MLV Env未观察到明显抑制作用。(B类)用抗FLAG抗体免疫印迹法测定293/LH2SN细胞中IFITM蛋白的表达。β-actin作为负荷对照。(C类)IFITM蛋白的表达不会下调细胞表面JSRV Env的表达。293T细胞与编码FLAG-tagged JSRV Env的质粒DNA（在N端和C端）以及指示的野生型IFITM共同转染。将细胞与抗FLAG抗体在冰上孵育，并通过流式细胞术测定JSRV SU的表面表达。仅使用第二种抗体作为对照。(D类)用编码JSRV Env、IAV HA或10A1 MLV Env的质粒转染293/LH2SN细胞，并删除R肽；转染后6 h，用指示量的IFN-α2b或培养基处理细胞24 h。将细胞暴露在pH 5.0的缓冲液中1 min（对于JSRV Env和IAV HA）或不处理细胞，并检查合胞体的形成。

为了评估IFITM蛋白对JSRV Env诱导的合胞体形成的差异影响是否依赖于有限的pH值范围，我们分别以不同的pH值（即pH值6.2、5.7和5.0）处理JSRV环境表达细胞。在这些pH条件下，IFITM1对JSRV Env诱导的合胞体形成始终表现出最强的抑制作用(图S4). 进一步降低pH值（pH4.0）或培养293个sHyal2浓度增加的细胞（高达30µg/ml）并没有克服IFITM1介导的融合限制（数据未显示），这表明IFITM 1的阻断不会在触发步骤发生。先前已经针对甲型流感确定，逐渐降低pH会导致更多融合蛋白的激活；而不是使每个蛋白质经历越来越广泛的构象变化[44],[45]根据这里描述的JSRV Env的结果，我们得出结论，IFITM抑制机制与融合蛋白密度无关。

我们还评估了用干扰素处理细胞是否可以抑制病毒膜融合。我们观察到，在293/LH2SN细胞与IFN-α2b孵育24小时后，JSRV Env或IAV HA诱导的合胞体形成以剂量依赖性的方式显著减少(图3D). 相比之下，10A1 MLV环境介导的合胞体形成未受到干扰素-α2b治疗的显著影响(图3D). 在24小时干扰素治疗期间未观察到细胞毒性；通过免疫印迹和流式细胞术检测，JSRV Env和Hyal2的表达也没有任何变化（数据未显示）。由于293个细胞不表达大量的IFITM，特别是IFITM1和3(图S2)，我们无法明确确定293细胞中shRNA对单个内源性IFITM的消耗是否会促进合胞体的形成。尽管如此，这些实验清楚地证明了干扰素可以阻断病毒膜融合。

IFITM1抑制JSRV-Env诱导的细胞融合；抑制作用在靶细胞中的表达与在效应细胞中的相同

我们应用更定量的细胞-细胞融合分析来评估IFITM蛋白对JSRV环境介导融合的影响，并了解可能的抑制机制。我们在稳定表达GFP的293T效应细胞中表达JSRV Env，并用红色荧光染料CMTMR标记表达IFITM蛋白的HTX/LH2SN靶细胞；用荧光显微镜和流式细胞术检测细胞间融合[27]与合胞体形成结果相似(图3A)，IFITM1表现出最强的抑制作用，将JSRV Env的细胞-细胞融合效率降低了约50%(图4A、B和C; p<0.01）。IFITM2和3也抑制细胞间融合，但效率低得多(图4A、B和C; p<0.01）。考虑到亲本HTX/LH2SN细胞中融合细胞的大小远大于表达IFITM1的细胞中融合细胞的大小(图4A)流式细胞术分析中排除了较大的细胞群体，流式细胞仪测量的融合减少百分比可能(图4B和C)低估了IFITM蛋白的抑制作用（参见下面的另一个细胞-细胞融合分析）。然而，这些实验清楚地表明，JSRV Env细胞-细胞融合产生的内容物转移受到IFITM蛋白的抑制。

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JSRV Env诱导的细胞融合被IFITM蛋白抑制，细胞外低pH脉冲不能克服IFITM1介导的JSRV进入限制。

用编码JSRV Env的质粒转染效应器293T/GFP（绿色）细胞。第二天，将细胞与稳定表达指示IFITM蛋白的CMTMR（红色）标记的HTX/LH2SN细胞共培养。然后用pH5.0缓冲液处理共培养细胞1分钟，并用荧光显微镜检查细胞间融合(A类)和流式细胞术(B类). 流式细胞术轮廓右上象限中显示的值代表融合细胞的百分比。(C类)表达IFITM的HTX/LH2SN细胞中融合细胞的百分比归一化为模拟对照。值是至少三个独立实验的平均值±SD。(D和E)用单独编码JSRV-Env的质粒（第1列和第2列）或编码JSRV-Env加IFITM1的质粒（第3列和第4列）转染效应293T/GFP细胞；转染后24小时，细胞与CMTMR标记的靶细胞共同培养，靶细胞为亲本HTX/LH2SN（第1和第3列，Mock）或稳定表达IFITM1的HTX/LH2SN（第一和第四列）。通过流式细胞术（E）测量融合细胞的百分比，求平均值，并将其归一化为对照组的百分比（第1列）（D）。数值是至少三个独立实验的平均值±SD。*p<0.05；**表示p<0.01。NS：无统计学意义（p>0.05）。(F类)低pH值不能克服IFITM1介导的JSRV进入障碍。表达IFITM1的HTX或HTX细胞用20 nM BafA1（中柱和右柱）或0.01%DMSO（左柱，作为对照）预处理2 h，然后用JSRV假病毒在4°C下旋转接种1 h。在37°C孵育1 h以允许内吞之前，用冷PBS清洗细胞以去除未结合病毒（见参考文献33和34）。然后用pH 7.5或pH 5.0的缓冲液在37°C下处理细胞5–10分钟，然后用0.01%二甲基亚砜或20 nM BafA1额外培养4小时，以允许感染。感染后三天，通过计数AP阳性病灶来测定病毒滴度，并通过归一化所有滴度（相对于用DMSO处理的亲代HTX细胞中的滴度）来计算相对传染性。值是三个独立实验的平均值±标准偏差。

我们探索了在共同表达病毒融合蛋白的效应细胞中表达的IFITM蛋白是否也可以限制细胞间融合。我们在293T/GFP效应细胞、HTX/LH2SN靶细胞（上述稳定细胞系）或两者中表达IFITM1，并比较它们对JSRV环境诱导的细胞-细胞融合的影响。在效应细胞中表达IFITM1(图4D，第3列；图4E)与在靶细胞中表达IFITM1一样，JSRV Env在减少细胞间融合方面同样有效(图4D，第2列；图4E)效应细胞和靶细胞共表达IFITM1增强了这种抑制作用(图4D，第4列；将第2列和第3列与第4列进行比较；两组均p<0.05；图4E). 因此，IFITM1对细胞-细胞融合的抑制与其在效应细胞或靶细胞中的表达无关。这一结果表明，IFITM蛋白不太可能通过直接作用于特定病毒融合蛋白或其相应受体而抑制细胞间融合，而是通过一种共同的物理机制（见下文）。

一个关键问题是，这里采用的细胞-细胞融合分析是否与内吞融合有关；这一点尤其重要，因为IFITM蛋白已被证明主要限制需要低pH值才能进行膜融合和进入的病毒。为了解决这个问题，我们利用了我们之前的发现，JSRV伪病毒实际上对低pH失活具有抵抗力，细胞外低pH脉冲可以克服质子泵抑制剂介导的JSRV进入障碍[27],[33],[34]我们用20 nM巴非霉素A1（BafA1）预处理JSRV假病毒结合HTX或HTX/IFITM1细胞，然后用pH-5.0脉冲处理5-10分钟；然后让细胞在BafA1存在下感染4小时。我们观察到，正如预期的那样，虽然低pH值显著挽救了亲代HTX和HTX/IFITM1细胞中BafA1介导的阻滞[33],[34]，低pH处理并没有将HTX/IFITM1细胞中的JSRV滴度提高到与亲代HTX细胞相似的水平(图4F). 这一结果与SARS冠状病毒的结果明显不同，IFITM对SARS冠脉病毒的融合抑制先前已被胰蛋白酶绕过[13]总的来说，我们的数据表明，在质膜上表达的IFITM1有效地阻止了低pH脉冲引起的JSRV的强制进入，这与细胞-细胞融合数据一致。

IFITM蛋白抑制所有三类病毒融合蛋白诱导的细胞间融合；抑制效率取决于细胞类型

为了评估IFITM对病毒膜融合可能产生的广泛影响，我们采用另一种细胞-细胞融合试验检测IAV HA、SFV E1/E2和VSV-G，它们分别代表I、II和III类融合蛋白[22]在这些实验中，效应细胞是稳定表达IAV HA（朱迪·怀特的恩赐）的NIH 3T3衍生HAB2细胞系[46]或用编码SFV E1/E2或VSV-G的质粒瞬时转染的COS7；我们用钙调素AM标记这些细胞。我们加载表达单个IFITM蛋白的靶293/LH2SN细胞（与用于合胞体形成分析的细胞系相同，如图3)使用CMAC，可以通过荧光显微镜监测融合期间的水性染料转移。我们发现，有点令人惊讶的是，IFITM1和3都强烈抑制所有三类病毒融合蛋白诱导的膜融合，并且它们的效率几乎相同。IFITM2也抑制病毒膜融合，但效率普遍较低(图5A、B和C)与合胞体形成的结果一致(图3A)以及上述GFP转移细胞-细胞融合分析(图4). 更令人惊讶的是，我们观察到当JSRV Env蛋白作为效应物在COS7细胞中表达时，环境介导的融合也被IFITM3显著抑制(图5D). 这与IFITM3在293T细胞作为效应细胞表达JSRV Env时对融合基本无影响的情况形成鲜明对比(图5E).

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IFITM蛋白抑制由三类病毒融合蛋白代表诱导的细胞间融合。

(A到E)表达指示病毒融合蛋白的效应细胞被钙调素AM负载，并与靶向293/LH2SN细胞（Mock）或表达CMAC预先标记的指示IFITM蛋白的细胞结合。然后，将JSRV Env的pH值降至5.0，IAV HA的pH值降低至4.8，VSV G的pH值下降至5.7，SFV E1/E2的pH值减少至5.4。在细胞重新中和到7.2后，在荧光显微镜下对成对效应细胞和靶细胞之间的融合进行评分。(A类)IAV HA（一种I类融合蛋白）。(B类)VSV G（III级）。(C类)SFV E1/E2（II级）。(D类)JSRV Env（I类），COS7作为效应细胞。(E类)JSRV Env，以293T细胞作为效应细胞。注意IFITM3对JSRV融合的不同影响，如（D）和（E）所示。(F类)COS7/LH2SN细胞中IFITM蛋白对JSRV和IAV进入的限制。COS7/LH2SN细胞（Mock）或表达IFITM蛋白的衍生物感染了携带JSRV Env或IAV HA/NA的GFP-编码的MoMLV假病毒，并按照图1注意，IFITM3和IFITM1一样有效地抑制了JSRV的进入；典型的流式细胞术曲线如所示图S4A.

也许COS7细胞表达一种特殊的细胞因子，在功能上促进人IFITM3对病毒膜融合的抑制作用。与这一概念一致，表达人IFITM3的COS7细胞（也被设计为联合表达人Hyal2，因为COS7对JSRV感染不允许）显著抑制了JSRV的进入，其效率几乎与IFITM1相当(图5F和5安). 这一观察结果与HTX和293细胞中的情况形成鲜明对比，其中IFITM3的作用较小(图1A和B). 同样，在COS7细胞中，人类IFITM3和IFITM1几乎同样抑制JSRV Env和IAV HA的合胞体形成活性(图S5B)与293/LH2SN细胞相比(图3A). 这种细胞类型依赖性对细胞-细胞融合的影响反映了先前的报告，表明IFITM介导的对病毒进入和感染的限制也是细胞类型依赖的[13],[15]总之，我们的数据表明，这三种人类IFITM蛋白能够有效抑制所有三类病毒融合蛋白诱导的细胞间融合。

氯丙嗪（CPZ）不能克服IFITM蛋白诱导的细胞融合障碍

接下来，我们研究了IFITM蛋白对病毒膜融合过程中哪些步骤的抑制作用。为此，我们使用的条件是，在没有IFITM蛋白的情况下，允许融合进行到半融合点并通过半融合点，同时防止导致孔隙形成的步骤。我们通过创造一种融合中间产物来达到这一目的，这种中间产物被称为冷阻态（CAS）。以前的研究表明，对于在低pH值下诱导融合的病毒融合蛋白，在4°C的低温下降低pH值会产生半融合；在中性pH下升高温度，然后导致孔隙形成和生长[47],[48],[49]。我们为JSRV Env和IAV HA创建了CAS，如预期的那样，发现没有发生膜融合(图6A和B，中间面板）。在中性pH和低温条件下向亲本细胞（模拟细胞）添加CPZ，导致显著的水性染料转移(图6A、C和D). 随后将温度升高至37°C后，任何进一步的染料转移在统计学上都不显著(图6A、C和D). 对于表达IFITM蛋白的靶细胞，在CAS中添加CPZ后扩散的水性染料远远少于亲本细胞(图6B、C和D). 相反，提高温度导致染料扩散显著增加；但总的染料扩散仍然小于亲代细胞(图6B、C和D). CPZ诱导的染料扩散量相对较小，这表明表达IFITM的细胞很少发生半融合。随着温度升高，染料扩散的量越大，表明靶细胞膜中的IFITM蛋白阻止了半融合的产生。蛋白质构象变化的温度依赖性通常大于不接近相变的脂类。因此，我们假设IFITM蛋白的存在阻断了半融合所需的JSRV Env和IAV HA的构象变化。但IFITM蛋白（见下文）引起的膜流动性降低可能会抑制脂质重新排列成半融合构型。

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CPZ不能挽救IFITM对病毒融合蛋白的细胞-细胞融合的限制。

表达JSRV Env的COS7细胞或表达IAV HA的HAB2细胞（未显示图像）加载钙黄绿素AM（绿色）并结合到靶细胞（未标记），即亲本293/LH2SN（模拟）或表达IFITM1（IFITM1）的衍生物。用pH 5.0缓冲液在4°C下处理细胞1分钟，以产生冷停状态（CAS），在此状态下，水性染料未转移。然后将细胞切换到37°C或用CPZ处理，在荧光显微镜下监测细胞间融合。(A类)在模拟细胞中（JSRV环境介导融合）：当CAS的温度从4°C升高到37°C时，图像中的两个靶细胞被钙调素-AM（箭头）标记，说明融合现在是广泛的。类似地，在CAS的细胞中添加CPZ也会导致两个靶细胞接收钙黄绿素AM，这说明添加CPZ后的融合与升高温度时的融合一样广泛。(B类)在IFITM1表达细胞（JSRV环境介导融合）中：温度升高导致钙黄绿素转移到四个靶细胞中的一个（箭头所示）。添加CPZ不会导致钙调素-AM转移到三个靶细胞中的任何一个。(C–D)JSRV Env（C）和IAV HA（D）中给出了这些现象的量化。对IFITM2和3-表达细胞应用了类似的实验程序，数据绘制如（C）和（D）所示。

负性致弯脂质油酸（OA）有效地挽救了IFITM介导的病毒膜融合抑制

单分子膜在结合中相互接触的负自发曲率促进了半融合[50],[51]因此，使自发性曲度更负应与IFITM的抑制作用相反，从而促进半融合。我们通过向水溶液中添加油酸（OA）15分钟来测试这一点，以使其融入到质膜中。我们观察到，当添加CPZ时，在OA存在的情况下创建CAS会导致更多的融合(图7A，将第二列与每个单元格行中的第一列进行比较）并升高温度(图7B，将第二列与每个单元格行中的第一列进行比较）。对于亲代靶细胞，OA的加入导致几乎所有细胞对之间的融合(图7A和B). 对于表达IFITM蛋白的靶细胞，OA的添加导致融合细胞对的百分比大幅增加(图7A和B). 与此形成鲜明对比的是，在生成CAS之后将OA加入到膜中，无论是添加CPZ还是提高温度，都无法有效促进融合(图7A和B，将每行单元格中的第三列与第二列进行比较）。OA几乎完全挽救了IFITM介导的对半融合的限制，这进一步支持了这样的观点，即靶膜中ITIFM蛋白引起的融合主要阻滞发生在半融合的上游。IFITM的存在可能通过使质膜外叶的自发弯曲更积极来阻止半融合。

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在创建CAS之前使自发性曲度变得更负，可促进JSRV环境介导的半融合。

CAS的创建如所述图6.OA在CAS之前或之后添加（详见材料和方法). 在创建CAS（三组中间柱）之前添加OA可在添加CPZ后促进水性染料转移(A类)或将CAS温度升高至37°C(B类). 相反，与对照组（第一列）相比，在创建CAS（第三列）后添加OA不会影响CPZ添加或温度升高引起的染料转移程度。这是一般模式，与靶细胞是否含有IFITM蛋白无关（Mock）。

IFITM蛋白的过度表达导致细胞膜脂序增加

原则上，IFITM蛋白可以改变自发的单层曲率，从而通过影响膜分子顺序和膜流动性来限制半融合的产生。为了探索这些可能性，我们用Laurdan标记了表达IFITM1、2或3的293/LH2SN细胞或模拟对照细胞，这是一种对脂相高度敏感的疏水性荧光探针，并测量了它们的广义极化（GP）使用2光子激光扫描和荧光寿命成像显微镜（FLIM）的值和荧光寿命[52],[53]由于Laurdan在能量耗散过程中具有较大的激发态偶极矩来排列周围的水分子，因此它通常被用来报告水渗透到脂质双层的程度，这与脂质堆积有关[52],[54]一般来说，较高的GP值和较长的使用寿命表明膜的分子有序性更强，而较低的GP数值和较短的使用寿命则表明膜分子有序性更低[52]在模拟对照细胞中，GP分布具有两个峰值，一个是与细胞膜相关的低GP，另一个是通过质膜确定的高GP；在模拟对照中，有序度较低的种群占优势(图8A–D; 第一行）。在用甲基-β-环糊精（MβCD）处理的细胞中，一种众所周知的胆固醇消耗试剂会使细胞膜变得无序[55]，我们观察到GP信号显著减少，导致直方图中较高的GP峰值几乎完全丢失(图8A–D; 第二排）。与之形成鲜明对比的是，表达IFITM1、2或3的细胞的GP值均显著增加，这在较高的GP峰值中尤为明显(图8A–D; 第三、第四和第五行），表明这些细胞膜比模拟对照细胞膜更有序。

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IFITM蛋白的表达增加了细胞膜的脂质顺序。

将稳定表达IFITM1、2或3的293/LH2SN细胞或模拟对照细胞与1.8µM月桂聚糖在37℃孵育40分钟，并使用双光子荧光显微镜成像。用10 mM MβCD处理亲代293/LH2SN细胞1 h作为对照。(A类)荧光强度图像。蓝色通道的荧光信号从416 nm到474 nm，绿色通道从474 nm到532 nm。(B类)广义极化（GP）图像。GP图像是根据GP函数生成的，GP函数是蓝色通道和绿色通道之间的归一化比率（GP比例从−1到+1）。根据计算的GP值，我们将GP范围从−0.3限制为0.5。(C类)GP直方图。使用两种高斯分布拟合GP直方图。较低的GP值与内膜有关，较高的GP数值与质膜有关。(D类)伪彩色GP图像。较低和较高的GP分布分别为绿色和红色的假彩色。(E类)平均GP值。对单个细胞系的GP值进行平均并绘制曲线；对于每个细胞系，共使用12-18张图像进行统计分析。模拟对照组与质膜中的IFITM1（p=0.00672）和IFITM3（p=0.00107）之间存在显著差异。有关详细信息，请参阅文本。

定量分析表明，IFITM1和3在质膜中的平均GPs值与模拟对照组显著不同（分别为p=0.00672和p=0.00107）(图8E). IFITM1和3-加压细胞胞膜的平均GP值也增加，尽管与模拟对照组相比没有统计学意义（p=0.08～0.37）(图8E). 不幸的是，在这项分析中，我们无法区分内胚层膜和总细胞膜的脂质顺序。值得注意的是，IFITM2表现出GP值的适度增加（p=0.1388）(图8E)其对合胞体形成和细胞融合的抑制作用较小(图3,​,44和​和5）。5). 与模拟对照组和MβCD-处理细胞相比，表达IFITM蛋白的细胞的FLIM寿命更长，也证明了其脂质顺序增加(图S6). 总之，这些结果表明，IFITM蛋白的过度表达显著增加了细胞膜的脂质堆积顺序，使其流动性降低，可能对膜融合的能力降低（见下文讨论).

讨论

IFITM蛋白家族是迄今为止已知的第一个也是唯一一个阻止病毒进入的限制因子[12],[56]先前的研究表明，这些蛋白质，尤其是IFITM3，主要限制在较低pH值下融合于晚期内体或溶酶体隔室的病毒[12],[13],[14],[17],[18]在这里，我们提供了证据表明，该蛋白家族还可以有效地限制具有较高pH阈值的融合病毒，例如JSRV（～pH 6.3），它需要受体结合和低pH值来共同触发膜融合激活。这种激活过程可能发生在GPI-锚定蛋白富集的内体室或小窝蛋白相关室[27],[29],[33]有趣的是，我们发现，在检测的三种人类IFITM蛋白中，IFITM1在限制JSRV进入方面比IFITM2和3更为活跃(图1A和B). 这不是因为JSRV Env或其Hyal2受体下调，也不是因为融合激活的受体介导启动的扰动(图2). 相反，合胞体形成和细胞-细胞融合实验的结果表明，在低pH下，JSRV-Env介导的融合被IFITM1严重抑制(图3,​,44和​和5）。5). 假设细胞外低pH脉冲不能绕过IFITM1介导的JSRV内体进入抑制(图4F)IFITM蛋白在中性pH下不抑制10A1 MLV环境介导的融合(图3)，我们得出结论，本研究中采用的合胞体形成和细胞-细胞融合分析可以反映病毒膜在内体中融合的情况，内体被认为是IFITM介导的抑制病毒进入的主要部位。

令人惊讶的是，我们观察到IFITM1在抑制IAV HA诱导的合胞体形成方面通常比IFITM2和3更有效(图3A)和VSV-G（未显示），尽管这些蛋白质以几乎相当的效率限制病毒进入(图1A和B). 这些观察结果的确切机制目前尚不清楚，但部分可能与293细胞表面IFITM1的表达水平相对较高有关，而IFITM2和3的表达水平相对较高(图1E和F). 定量细胞-细胞融合分析证实了合胞体的形成数据(图5)，但也揭示了当COS7而不是293T被用作效应细胞时，IFITM3显著抑制了病毒膜融合(图4,​,55和图S5). 这些结果表明，IFITM蛋白对病毒膜融合的影响可能依赖于细胞类型，这与之前对病毒进入的观察一致[13],[15]因为所有三种被测试的人类IFITM蛋白对所有三类具有不同结构的病毒融合蛋白诱导的病毒膜融合都表现出强大的抑制作用(图5)我们认为这是一种共同的物理机制，而不是与病毒融合蛋白的特定相互作用。结果我们的一系列实验支持了这一假设。

我们的第一条证据是CPZ对细胞间融合的影响(图6). 先前已经确定CAS是一种半融合状态，在CAS中间层向细胞添加CPZ可导致完全融合[47],[57]众所周知，对于由酸性条件触发的融合蛋白带入CAS的细胞，在中性pH值下升高温度会导致完全融合[47],[48],[58]我们观察到，添加CPZ或提高CAS温度后，表达IFITM蛋白的靶细胞中的水性染料扩散程度远小于37°C时降低pH值所诱导的融合(图6). 这些发现为IFITM蛋白抑制半融合的产生提供了有力证据。因为添加CPZ或提高温度对JSRV Env和IAV HA的影响在性质上相似(图6C和D)，我们得出结论，IFITM蛋白的抑制机制并不依赖于精确的融合蛋白。尽管IFITM蛋白可能影响孔隙的形成和/或扩张，但其主要机制似乎是防止半融合。

IFITM介导的半融合阻滞的第二条证据来自OA实验(图7). 反复表明，负自发曲率促进了半融合，而正自发曲率则抑制了半融合[51],[57]因此，如果IFITM蛋白对含有它们的膜产生正的自发弯曲，这些蛋白将自然阻止半融合。由于OA具有较大的负自发曲率[57]我们推断，如果曲率是IFITM作用的核心，那么它应该克服IFITM蛋白的抑制作用。实验上，我们观察到OA的加入几乎克服了IFITM蛋白融合的所有障碍(图7A和B). 也就是说，当加入OA诱导半融合时，尽管靶膜中存在IFITM蛋白的表达，但很容易在没有任何抑制的情况下形成孔隙。在建立CAS后添加OA对IFITM介导的抑制没有明显影响，这进一步支持了以下结论：阻滞发生在形成半融合之前的步骤(图7A和B).

IFITM蛋白如何阻止半融合？我们的Laurdan标记实验表明，表达IFITM的细胞膜比模拟对照细胞膜更有序，其GP值增加和FLIM寿命延长证明了这一点(图5,​,8,8和S6）。表达IFITM的细胞，特别是其质膜中脂质顺序的增加，与IFITM抑制病毒膜融合的效力相关(图8和图S6). 因此，IFITM蛋白可能通过降低其所含膜的流动性来阻止半融合：流动性降低会降低脂质进行实现半融合所需运动的能力。正如蛋白质存在时较高的GP值所表明的那样，双分子层对水的排斥增加也是可能的(图8)这是由于相对于其酰基链扫出的面积，脂类头部基团所占的平均面积增加。这相当于更大的正自发曲率。IFITM蛋白的表达可能会改变细胞膜的脂质组成，从而影响其流动性和自发曲率。我们强调，虽然脂质顺序和膜流动性的变化可能解释了IFITM对病毒膜融合的一般抑制作用，但它们并不能完全解释本研究和以往研究中报道的病毒特异性和细胞类型依赖性IFITM抑制病毒进入的现象(图1,​,44和​和5；5;图S5)[12],[13],[15]可能还涉及其他因素，例如特定的IFITM结合伙伴和可能调节IFITM介导的病毒进入抑制的病毒元件。在这方面，IFITM蛋白可能影响或不影响发育和细胞融合原介导的细胞间融合，这取决于表达IFITM和细胞融合素的特定细胞系统。

IFITM蛋白促进更高脂级的原因尚不清楚，但我们提出了一个建议。IFITM蛋白可以通过采用非传统的膜拓扑结构或拓扑结构直接改变膜曲率，这些拓扑结构或拓扑学结构起楔形作用，产生正的自发曲率。人们越来越认识到，脂质结合蛋白以及脂质本身可以影响膜的曲率，这对囊泡运输和膜融合至关重要[59],[60].结果连续体膜力学的研究表明，靶膜靠近表达融合蛋白的膜（即外叶）的单层的自发弯曲影响半融合，但远端单层（即内叶）的自发弯曲不影响半融合[61]鉴于我们的实验数据显示IFITM蛋白阻断了半融合(图6和​和7），7)我们认为IFITM蛋白可能通过跨越部分或全部外单层影响外单层。这一建议与IFITM蛋白的预测膜拓扑结构相一致[11]其中N端和C端面对小泡腔。先前和我们目前的工作也支持这一观点，表明IFITM3的N末端和C末端标记的表位都可以通过流式细胞术和免疫染色检测到，尽管不是很显著，但无需通透性(图2E和F)[12],[14].

最近的一项研究表明，小鼠IFITM3蛋白采用了另一种拓扑结构[20]在本报告中，作者提供了证据表明，最初预测的IFITM3跨膜结构域折叠成发夹环，仅跨越内叶，从而形成了N端和C端都朝向胞浆的膜内拓扑结构[20]虽然我们的数据没有明确证明这种替代拓扑的存在，但IFITM蛋白可能采用多种动态拓扑。事实上，已有研究表明，一些跨膜蛋白，包括病毒糖蛋白，由于“脂质翻转”和/或细胞溶质序列净电荷的变化，采用双重或动态拓扑结构[62],[63],[64]动态拓扑可能是由哺乳动物细胞N端和C端观察到的IFITM蛋白的裂解引起的[11],[19],[65]（我们未发布的数据）。因此，IFITM蛋白，包括其在不同物种中的同源序列，可能在N端和C端存在显著差异[11]在哺乳动物细胞中采用不同的拓扑结构；这些序列和拓扑差异可能解释并促成了它们在抑制病毒膜融合和进入宿主细胞方面的某些不同表型。

材料和方法

细胞

293T、293、HTX（HT1080的亚克隆）、COS7、293T/GFP（稳定表达GFP）、HAB2（表达IAV HA，弗吉尼亚大学夏洛茨维尔分校Judy White的馈赠）、293/LH2SN（稳定表达Hyal2）、HTX/LH2SN（稳定表达Hyal2）和293/GP-LAPSN（表达MLV Gag-Pol和碱性磷酸酶（AP）)单元格都已在前面描述过[27],[40],[46],[66]表达人Hyal2的COS7细胞通过编码人Hyal 2的PT67/LH2SN逆转录病毒载体转导产生[40]用编码IFITM1、2或3（见下文）的pQCXIP（Clontech，Mountain View，CA）逆转录病毒载体转导，生成稳定表达IFITM蛋白的.293、HTX、293/LH2SN、COS7/LH2SN、HTX/LH2SN细胞。稳定表达对照shRNA或靶向IFITM1或3 mRNA的shRNA的K562细胞是Michael Farzan和I-Chueh Huang（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）的馈赠。所有使用的哺乳动物细胞均生长在含有10%FBS（Hyclone，Logan，UT）的Dulbecco改良Eagle's（DMEM）培养基中。

质粒和试剂

通过PCR从pRetro-Tet-IFITM构建体中扩增具有或不具有N-末端FLAG标签的人IFITM1、2和3基因[15]PCR产物被消化并连接到pQCXIP载体的EcoRI/BamHI限制性位点，得到pQCXIP-IFITM。反转录病毒包装质粒编码MoMLV Gag-Pol（pCMV-Gag-Pol-MLV）和转移载体编码GFP（pCMV GFP-MLV）是法国里昂INSERM U758-ENS公司赠送的礼物。前面已经描述过编码JSRV Env和N端和C端FLAG、10A1型amphotropic MLV Env、水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）和SFV E1/E2的质粒[27],[29],[67],[68]通过PCR去除R肽的最后16个氨基酸，构建了删除R肽的10A1 MLV Env结构。编码IAV HA和NA（泰国KAN-1/2004 H5N1毒株）的质粒是Gary Nabel（NIH，Bethesda，MD）赠送的礼物。MLV Gag-YFP构造是Walter Mothes（耶鲁大学，新天堂，CT）的一份礼物。抗FLAG单克隆抗体珠（EZview™-红色）、抗FLAG抗体、抗β-肌动蛋白单克隆抗体、抗微管蛋白、与FITC、TRITC或HRP偶联的次级抗小鼠免疫球蛋白G、氯丙嗪（CPZ）、巴非霉素A1（BafA1）和油酸（OA）均购自Sigma（密苏里州圣路易斯）。Anti-IFITM1、Anti-IFITM2和IFITM3购自Proteintech Group（伊利诺伊州芝加哥）。IFNα-2b、CMAC（7-氨基-4-氯甲基香豆素）、钙黄绿素-AM、甲基-β-环糊精（MβCD）、CMTMR（5-（和-6）-（（4-氯甲基）苯甲酰基）氨基）四甲基罗丹明）和Lipofectamine 2000购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。快车35S-Met/Cys蛋白标记混合物购自Perkin Elmer（马萨诸塞州波士顿）。如前所述，生产并纯化JSRV SU-人IgG-Fc融合蛋白和sHyal2[27],[41].

伪病毒的产生、转导和感染

如前所述，生产了GFP和AP表达的带有JSRV Env、10A1 MLV Env、IAV HA/NA和VSV-G的MLV伪病毒[33]在5µg/ml Polybrene（Sigma）存在的情况下，用适量的病毒库存感染目标细胞，并在感染48小时后通过流式细胞术评估GFP表达，或在感染72小时后通过细胞染色评估AP活性。为了测试干扰素（IFN）对病毒进入的影响，在假病毒感染之前，用200-1000单位的IFN-α2b或单独培养基处理293个细胞24小时。通常，所有感染都使用0.05至0.2的MOI。

为了建立稳定表达IFITM1、2或3的细胞系，我们使用磷酸钙法将编码IFITM（pQCXIP-IFITMs）、MLV-Gag-Pol（pCMV-Gag-Pol-MLV）和VSV-G（pMD.G）的质粒转染293T细胞，从而产生逆转录病毒假型。转染后48–72小时收集上清液，并在3200 g下离心以去除细胞碎片。细胞在5µg/ml Polybrene的存在下感染假病毒。感染后24小时，在含有1µg/ml嘌呤霉素（Sigma）的生长培养基中选择细胞。为了生产携带JSRV Env的MLV Gag-YFP伪病毒，采用磷酸钙法将293/GP-LAPSN细胞与编码Gag-YFP和JSRV Env的质粒共转染。

病毒结合试验

携带JSRV Env和Gag-YFP的MLV假病毒通过在2 ml 20%蔗糖缓冲液上以185000 g离心浓缩3 h，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中重新悬浮。用PBS加5 mM EDTA分离细胞，用不同量纯化的假病毒在冰上孵育3 h。用PBS洗涤5次，用3.7%多聚甲醛固定，然后用流式细胞仪进行分析。

细胞表面染色

用含5 mM EDTA的PBS分离细胞，再悬浮于PBS加2%FBS中5将HTX细胞与10µg纯化的JSRV SU-人IgG Fc蛋白在冰上孵育3 h，洗涤3次，再与FITC结合的抗人IgG-Fc抗体孵育1 h。然后对细胞进行洗涤、固定并通过流式细胞术进行分析。为了检测标记有FLAG的JSRV Env和IFITM的表达，使用了类似的程序，但细胞与抗FLAG抗体在冰上孵育1 h，然后与FITC结合的抗鼠IgG抗体孵育1h，然后用流式细胞仪分析细胞。

代谢标记

如前所述进行代谢标记[27]简而言之，通过磷酸钙法将编码JSRV Env和/或IFITM的质粒瞬时转染293T细胞。转染后24小时，细胞在不含半胱氨酸和甲硫氨酸的DMEM中饥饿30分钟（MP Biomedicals，Cost Mesa，CA），用62.5µCi半胱氨酸与甲硫氨酸混合物（Perkin Elmer，Waltham，WA）脉冲标记1小时，然后在完全生长介质中进行追逐标记。为了检查追逐期后3 h JSRV SU的脱落，添加了指示量的sHyal2，并将细胞再培养3 h。细胞裂解液和含有35收集S标记的JSRV Env，并用抗FLAG珠免疫沉淀。然后通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对样品进行分离，并应用于放射自显影。使用Quantity One（Bio-Rad，Hercules，CA）量化带强度。

合胞素诱导试验

如前所述进行合胞体诱导试验[27]简而言之，293/LH2SN或COS7/LH2SN-细胞，无论是亲本（模拟）还是稳定表达IFITM的衍生物，都接种在6孔板中，并与编码JSRV Env或10A1 MLV Env的2µg质粒共转染，同时删除R肽（10A1 Env-R−)或编码IAV HA的0.5µg质粒，再加上使用磷酸钙方法的0.5μg peGFP-N1（Clontech）。转染后24小时，用预先加热的缓冲液（pH 6.2、pH 5.5、pH 5.0等）处理细胞1分钟，并在荧光显微镜下检查合胞体的形成。如果适用，在用低pH缓冲液处理细胞以诱导合胞体之前，用指示剂量的IFN-α2b培养细胞24小时。对于10A1 Env-R−，在转染后添加IFN-α2b，并在整个融合试验中保持。融合指数通过使用（f） = [1-（C/N）]，其中C是融合后每个相场的细胞数，N是细胞核总数[69].至少使用五个相控显微镜场进行分析，并计算平均值和标准偏差。

细胞-细胞融合分析

本研究采用了两种细胞-细胞融合分析。如前所述，第一次细胞-细胞融合试验用于JSRV Env[27]简而言之，通过Lipofectamine 2000将2µg质粒转染293T/GFP细胞，该质粒单独编码JSRV Env或加上IFITM1。转染后24小时，用PBS加5 mM EDTA分离细胞，并与CMTMR预标记效应器HTX/LH2SN细胞系（亲本（模拟）或表达IFITM蛋白的衍生物）共同培养。共培养1 h后，用pH 5.0缓冲液处理细胞1 min，然后在完整的生长培养基中再恢复1 h。细胞在荧光显微镜下或流式细胞仪下进行融合分析。

在第二次细胞-细胞融合试验中，病毒融合蛋白（JSRV Env、VSV G和SFV E1/E2）分别在COS7细胞中表达，以产生效应细胞。在一些实验中，293T细胞被用作效应细胞，以测试效应细胞的类型是否具有功能性后果。对于IAV，使用稳定表达流感病毒HA的细胞株HAB2作为效应剂。如上所述，稳定表达IFITM蛋白的293/LH2SN细胞是靶细胞。效应细胞被荧光染料钙黄绿素AM（Invitrogen）负载，靶细胞被染料CMAC（Invit罗gen）标记。对于融合实验，允许细胞在室温下结合30分钟，然后通过交换水溶液将pH值降低10分钟，JSRV Env降至5.0，IAV HA降至4.8，VSV G降至5.7，SFV E1/E2降至5.4。然后将pH值重新中和至7.2，30分钟后通过转移两种水性染料对成对效应细胞和靶细胞之间的融合进行评分，如荧光显微镜所示。

BafA1或IFITM1介导的小瓶入口堵塞的低pH救援

按照之前的描述进行了实验[33],[34]简而言之，用20 nM BafA1预处理HTX或HTX/IFITM1细胞2小时，并在4°C下用JSRV或IAV假病毒旋转接种1小时。用冷PBS洗涤三次后，将病毒细胞复合物直接暴露于pH 5.0溶液中（对于IAV）5–10分钟或在37°C下在20 nM BafA1存在下预培养1小时（对于JSRV），然后在pH值5.0下培养5–10 min。在这两种情况下，在20 nM-BafA1的存在下感染的总时间为4小时。在感染期后，使用柠檬酸缓冲液（pH值3.0）灭活非内化病毒，在感染开始72小时后，通过计数AP阳性病灶来确定病毒感染性。pH 7.5-PBS缓冲液和0.01%二甲基亚砜分别作为pH 5.0缓冲液和20 nm BafA1的对照。

创建和使用CAS

在室温下将标记的效应细胞和靶细胞结合在培养皿的盖玻片上30分钟后，将培养皿放在冰上，使细胞浸泡溶液达到4°C。pH值降低（～pH值5.0）10分钟，然后在4°C下重新中和至pH值7.2。此时，细胞处于“冷应激”阶段（CAS）。3分钟后，进行两次手术中的一次。首先，添加0.5 mM CPZ（通过在4°C下交换溶液），1分钟后用含有脱脂BSA的溶液清洗CPZ。将每个盘子放在冰上，取下每个盖玻片，通过荧光显微镜监测水性染料转移。在第二次操作中，将CAS中的细胞置于37°C的培养箱中30分钟，然后监测染料转移。为了使自发单层曲率更负，在产生CAS之前或之后将285µM油酸（OA，Sigma）并入细胞膜。对于先前的掺入，将效应细胞和靶细胞在室温下一起孵育20分钟，然后加入OA；15分钟后，将溶液降至4°C，并生成CAS。通过用含有脱脂BSA的溶液清洗细胞，在4°C下去除OA。然后添加CPZ或将温度升高至37°C。为了在CAS之后加入OA，将OA添加到CAS的细胞中，并添加CPZ或在不去除OA的情况下升高温度。

劳尔丹标签

将膜探针Laurdan（6-十二烷基-2-二甲氨基萘，Invitrogen）溶解在DMSO（二甲基亚砜）中，使储备浓度为1.8 mM。将表达IFITM1、2或3或无IFITM12或无IFITM1的293/LH2SN细胞（Mock）与1.8µM月桂单在37°C下孵育40 min。为了消耗胆固醇，将甲基-β-环糊精（MβCD，Sigma-Aldrich）溶解在纳米纯水中，制备50 mM储备溶液。将细胞与10mM MβCD在37°C下孵育1小时。所有细胞在进行成像处理之前用PBS冲洗一次。

Laurdan标记中涉及的显微镜处理、成像和数据分析

为了定量评估膜阶数，发展了一种称为广义极化（GP）的比率法[52].表征Laurdan光谱特性的GP函数或值通过以下表达式计算：

方程式图像
(1)

哪里我蓝色和我绿色是各自的强度，通常集中在440nm（有序度较高的脂质双层的发射最大值）和490nm（有序程度较低的脂质的发射最大）。

GP和FLIM数据是使用蔡司LSM710 META激光扫描显微镜采集的，并与双光子Ti:Sapphire激光器（Spectra-Physics Mai Tai，Newport Beach，CA）耦合，产生80 MHz重复频率的80 fs脉冲，使用ISS A320 FastFLIMBox获取寿命数据。所有实验均使用40×水浸物镜1.2 N.A.（德国奥伯科钦蔡司）。激发波长设置为780 nm。使用SP760nm二向色滤光片从激光中分离荧光信号。对于FLIM数据，荧光信号通过495 LP滤波器定向，并在两个光电倍增探测器（日本滨松H7422P-40）之间分割信号，每个探测器前面分别有以下带宽滤波器：蓝色通道460/40和绿色540/25。对于图像采集，像素帧大小设置为256×256，像素驻留时间为25.61µs/像素。样品的平均激光功率保持在mW水平。对于GP数据，使用LSM 710的光谱检测器，通过连接检测器的6个通道（每个通道的带宽为9.7 nm），从416 nm到474 nm（蓝色通道）和从474 nm到532 nm（绿色通道）获取荧光信号。对于图像采集，像素帧大小设置为256×256，像素驻留时间为177.32µs/像素。样品的平均激光功率保持在mW水平。荧光动力学实验室开发的SimFCS软件(网址：www.lfd.uci.edu)用于获取FLIM数据并处理FLIM和GP数据。通过测量荧光素（pH 11），对FLIM数据的系统和相量图进行校准，荧光素的已知单指数寿命为～4.04 ns。使用DMSO中的Laurdan对GP数据进行校准，其参考GP值等于零。

使用SimFCS计算图像的GP直方图，并使用MatLab例程进行直方图拟合。GP直方图的特征是存在两个高斯分布。在突出显示图像中的相应像素后，可以将第一高斯分布（以较低的GP值为中心）与细胞的细胞内膜耦合，并将第二分布（以较高的GP值为中心）与质膜耦合[70]使用两个直方图分布计算细胞膜和质膜的平均GP值。

统计分析

配对学生t吨除非另有说明，否则测试用于统计分析。通常使用三到八个独立实验的数据进行分析。

支持信息

图S1

野生型IFITM对JSRV、10A1 MLV、IAV和VSV进入的影响。实验按照中所述进行图1除表达野生型IFITM1的HTX细胞外，2或3用于感染。

（畅通节能法）

图S2

检测293个细胞中IFITM的表达。将稳定表达IFITM1、2或3的293或293细胞用IFN-α2b（500单位/ml）处理24小时或不处理，并分别使用抗IFITM 1、抗IFITM2、抗IFIT M3和抗FLAG抗体通过Western blot检测细胞裂解物的IFITM表达。Tubulin作为负荷控制，由抗Tubulin-抗体确定。注意，由干扰素-α2b在293细胞中诱导的内源性IFITM表达水平远低于IFITM过度表达水平。

（畅通节能法）

图S3

不同pH值对JSRV Env诱导的合胞体形成的影响。进行的实验与图3，但使用了指示的pH缓冲液。实验进行了三次，得到了类似的结果。显示了具有代表性的图像。

（畅通节能法）

图S4

野生型IFITM对JSRV Env和IAV HA诱导的合胞体形成的影响。按照中所述进行分析图3，除表达野生型IFITM1的293/LH2SN细胞外，使用2或3。实验重复了至少4次，获得了类似的结果。展示了具有代表性的图像。

（畅通节能法）

图S5

人IFITM3抑制JSRV环境介导的进入和COS7细胞的细胞间融合。(A类)表达人IFITM1、2或3的COS7/LH2SN细胞感染GFP编码的携带JSRV Env或IAV HA/NA的MLV假病毒；感染后24h，用流式细胞仪检测感染滴度。显示了一个典型实验的流式细胞术曲线。(B类)实验按照中所述进行图3除表达IFITM1、2或3的COS7/LH2SN细胞外，用编码JSRV Env或IAV HA的质粒转染2或3细胞，并在pH5.0处理5分钟后检查合胞体的形成；箭头表示JSRV Env诱导的合胞体。

（畅通节能法）

图S6

用FLIM检测IFITM表达对细胞膜脂质顺序的影响。用荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析细胞。FLIM图像是使用ISS A320 FastFLIMBox采集的。荧光动力学实验室（加州大学欧文分校）开发的SimFCS软件用于获取FLIM数据并处理FLIM和GP数据。相量法用于直接可视化Laurdan寿命分布，并将颜色图与寿命值相关联（见参考文献53）。请注意，绿色光标与寿命较短或有序程度较低的脂质膜（例如MβCD处理的细胞）相关，而红色光标与寿命较长的有序脂质膜（如表达IFITM的细胞）相对应。(A类)荧光强度图像。(B类)绿色通道中的FLIM图像。(C类)相量图。(D类)相量调色板分布。

（畅通节能法）

致谢

我们感谢Michael Farzan和I-Chueh Huang为K562细胞提供表达shRNA靶向IFITM蛋白的细胞。我们感谢Roy Duncan、Lorraine Albritton、Abraham Brass、Harvey McMahon、Judith White、Yong Xiong、Dong Xu和Nuno Correia Santos的有益讨论。我们还感谢米尔卡·斯塔基奇的技术援助。

资金筹措表

这项工作得到了密苏里大学、美国国立卫生研究院（GM066837、P41-RRO3155、P41 GM1035401、P50-GM076516、R21AG032579、R21AI105584）和加拿大卫生研究所（MOP-77649）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃