肝纤维化中的自然杀伤和自然杀伤T细胞

摘要

1.简介

肝纤维化及其终末期后果肝硬化是几乎所有慢性肝病的最终共同途径，影响全球数亿人。尽管该领域取得了令人瞩目的进展，但目前除肝移植外，还没有治疗纤维化的治疗方案。慢性肝损伤发展为纤维化的复杂机制尚不完全清楚，因为细胞间的关系是多方面的，而且往往是矛盾的。越来越多的证据表明，肝损伤期间肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发展的关键步骤[1–5]. 在健康的肝脏中，HSC处于静止状态，在贮存视黄醇（维生素a化合物）中起着重要作用。损伤后，HSC被激活并转分化为基质生成细胞，称为肌成纤维细胞。HSC的激活受多种细胞因子、生长因子、免疫细胞和其他因素控制[1–5]. 在涉及的免疫细胞中，巨噬细胞不仅有助于肝纤维化的发病机制，而且有助于促进肝纤维化的消退[6]. 早期的一篇论文报道，树突状细胞（DC）通过产生TNF-α而加剧肝纤维化[7]但最近一项使用更特异DC标记物的研究表明，DC通过分泌基质金属蛋白酶-9促进纤维化消退，从而改善肝纤维化[8]. 此外，自然杀伤细胞（NK）和NKT细胞在肝纤维化形成中的作用最近受到了极大关注，因为这些细胞在肝淋巴细胞中富集，并且在各种肝病中也发生显著变化[9]. 在这篇综述中，我们重点介绍了NK和NKT细胞功能的最新研究进展，这些功能对肝纤维化的发病机制至关重要，并将简要讨论NK和KKT细胞作为抗纤维化治疗的潜在治疗靶点。

2.NK和NKT细胞生物学

NK细胞是先天免疫系统的淋巴细胞，可识别并杀死感染细胞和致瘤细胞。这些细胞代表了不同于T细胞和B细胞的第三种淋巴细胞谱系。与B细胞和T细胞不同，NK细胞不表达抗原受体。相反，他们依靠一系列细胞表面受体来检测宿主细胞表面分子表达的变化，这些分子通常出现在各种“应激细胞”上，包括微生物或病毒感染的细胞、转化细胞和受损细胞[10]. 杀伤细胞的决定是基于NK细胞上表达的抑制和激活受体分子传递的信号的净平衡。抑制性受体包括杀伤性Ig样受体（KIRs）、Ly-49A和CD94/NKG2受体，它们识别几乎所有正常细胞上表达的MHC I类分子（抑制性配体），随后使NK细胞功能失活。因此，NK细胞不会杀死正常的宿主细胞。NK细胞上的刺激受体包括NKp46、NKp30和NKp44，它们统称为天然细胞毒性受体、NKG2D和DNAX辅助分子-1（CD226）[10–12]. 其中，NKG2D是定义最明确的受体，它结合目标细胞上表达的配体（例如，人类的MICA/B和ULBP，小鼠的RAE-1和MULT1），随后促进NK细胞活化。活化后，NK细胞可以通过含穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒的胞吐直接杀伤靶细胞。NK细胞还可以通过利用FAS配体、TNF-α和TNF-相关凋亡诱导配体（TRAIL）以依赖于穿孔素的方式杀伤靶细胞。此外，许多细胞因子（尤其是IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-22）和趋化因子（包括MIP-1α、-β和RANTES）的产生是NK细胞调节靶细胞和免疫反应的另一个重要机制[13,14].

NKT细胞是一组异质性T淋巴细胞，可识别非经典MHC类I样分子CD1所呈现的脂质抗原[15]. 人类组织表达CD1的五种不同亚型，包括CD1a、-b、-c、-d和-e，而小鼠只表达CD1d。CD1d依赖性NKT细胞可分为两种类型的细胞：I型和II型NKT。I型NKT细胞也被称为经典或不变NKT（iNKT）细胞，因为它们表达一个不变T细胞受体α（TCR-α）链，占肝NKT淋巴细胞的95%。II型NKT细胞表达多种TCR，占肝NKT淋巴细胞的不到5%。在被脂质抗原如α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）激活后，iNKT细胞能够产生大量的IFN-γ、IL-4、IL-13、TNF-α、IL-17和许多其他细胞因子。活化的iNKT细胞还产生细胞毒性介质，如穿孔素、Fas配体和TRAIL，以杀死靶细胞。虽然已广泛研究了外源性脂质抗原α-GalCer对iNKT细胞的激活作用，但激活NKT淋巴细胞的内源性配体仍基本未知。

3.肝NK和NKT细胞

肝脏中的NK细胞最初在大鼠体内被称为“Pit”细胞，位于肝窦内，靠近肝脏非实质细胞，是一种独特的器官相关NK细胞群[16]. 在正常生理条件下，肝脏NK细胞具有快速更新，估计在肝脏中的停留时间为1至2周。由于其增殖活性很低，肝NK细胞群不断从肝外干细胞来源中补充，而干细胞来源很可能位于骨髓中[16]. 肝淋巴细胞中NK细胞的频率远高于外周血淋巴细胞；在小鼠中，10%的肝淋巴细胞是NK细胞，而大鼠和人类肝脏中30-50%的肝淋巴细胞则是NK淋巴细胞[9]. 各种病理状况（如病毒感染、急性和慢性炎症）以及使用生物反应调节剂激活免疫系统（如聚肌苷多囊酰酸[poly-I:C]或IFNs）的治疗显著增加肝脏中NK细胞的数量（见综述[9]以及其中的参考）。目前，NK细胞在肝脏中富集的机制尚不完全清楚，尽管人们认为粘附到窦状内皮细胞是NK细胞从血管室向肝脏募集的重要步骤[17]. 这种粘附由细胞粘附分子调节，细胞粘附分子介导细胞与细胞和细胞与基质的相互作用。在人类中，在NK细胞表面检测到一些细胞粘附分子，如CD11a/CD18、CD2、CD54、CD56和CD58[18]用中和抗体阻断这些分子可显著减少肝脏中NK细胞的数量[17].

在迁移到肝脏后，外周NK细胞发展成具有独特特征的肝脏特异性NK细胞，例如与其他器官的NK细胞相比，对不同肿瘤靶细胞具有更高水平的细胞毒性[19,20]. 这种肝脏特异性NK细胞的发育被认为受肝窦微环境的控制。例如，从活体供肝移植的正常供肝灌流液中提取的人类NK细胞能够杀死人类肝癌细胞系HepG2细胞，IL-2治疗进一步增强了这种作用；然而，即使在IL-2刺激下，肝硬化患者受体肝脏中的NK细胞也表现出抗肿瘤活性受损[19]. 目前，肝脏微环境如何影响肝脏特异性NK细胞的发育尚不清楚。

除了NK细胞外，NKT细胞也在肝淋巴细胞中富集，因为大约30–35%的小鼠肝淋巴细胞是NKT淋巴细胞，5–10%的大鼠和人类肝淋巴细胞是KKT细胞，其频率明显高于外周血淋巴细胞（<5%的NKT）[9]. NKT细胞不仅直接杀伤靶细胞，还产生多种细胞因子，从而在控制肝损伤、纤维化、再生和肝癌发生中发挥着不同的作用[9].

4.NK细胞的抗纤维化作用

2006年，两组不同的小鼠模型首次证明活化的HSC对NK细胞的杀伤作用[21,22]这一观察结果后来在动物模型中得到了许多其他研究的证实[23–32]和患者[28,31,33–36] (表1). 总的来说，这些发现表明NK细胞选择性地杀死早期激活（过渡期）或衰老激活的HSC，但不杀死静止或完全激活（肌成纤维细胞）的HSC(图1). 此外，NK细胞还产生IFN-γ，从而诱导HSC凋亡和细胞周期阻滞，随后抑制肝纤维化(图1).

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图1

NK细胞抗纤维化作用的机制。NK细胞可以被几种TLR配体和细胞因子激活。早期和衰老激活的HSC表达水平升高的NK细胞激活配体，这些配体结合NK细胞上的几个NK激活受体，包括NKG2D（小鼠和人类）、NCR1（小鼠）和NKp46（人类），随后诱导NK细胞活化。活化的NK细胞释放细胞毒性介质，选择性杀死早期或衰老激活的HSC，但不杀死静止或完全激活的HSCs。活化的NK细胞也产生IFN-γ，不仅直接诱导HSC死亡，而且进一步增强NK细胞对HSC的细胞毒性。静止和完全激活的HSC不表达升高的NK细胞激活配体，并且对NK细胞杀伤具有抵抗力。

4.1. NK细胞选择性杀伤早期激活但非静止或完全激活的HSC：体内和体外证据

在健康肝脏中，HSC处于静止状态并储存视黄醇，但在肝脏损伤时，HSC被激活并转化为高度增殖、收缩的肌纤维母细胞样细胞[三]. 损伤肝脏中HSC的激活会产生一系列处于不同激活和转分化阶段的细胞，这些细胞显示过渡表型、基因表达和功能，可以通过几个标记物进行识别。其中，Desmin是一种典型的收缩细胞中间丝，已被广泛用作鉴定啮齿动物肝脏HSC所有阶段的“金标准”，尽管其在人类中的表达并不可靠[三]. 如所示图2ADesimin免疫染色显示静止的HSC中有许多突起，而3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢柯立定（DDC）诱导的纤维化小鼠肝脏中早期激活的HSC被鉴定为缺乏突起的细胞质的小圆形细胞。肌纤维母细胞样细胞呈细长形状，位于门脉纤维化区域。

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图2

体内NK细胞与早期活化HSC接触的证据。(A类)：DDC喂养小鼠纤维化肝脏中早期激活/过渡型HSC和NK细胞的鉴定。在光学显微镜下，早期激活的结蛋白阳性细胞（中间面板中的箭头所示）表现为细胞质稀少的小细胞，缺乏静止HSC典型的许多突起（左侧面板中的图标所示）。棒材，50μm。（B） ：用DDC饮食喂养小鼠2周。肝切片分别用结蛋白和Ly49G抗体染色以鉴定HSC和NK细胞。阳性染色采用含氯化镍的3,3′-二氨基联苯胺（HSC为黑色染色）或3-氨基-9-乙基咔唑（NK细胞为红色染色）。注意，阳性细胞占据了肝实质的类似区域，包括2区和3区。（C） ：高倍镜下分别显示位于Diss窦周间隙和肝窦内的HSC和NK细胞。（D） ：NK细胞和HSC的双重免疫染色表明Ly49G-阳性NK细胞（红色）位于结蛋白阳性（黑色）早期激活的HSC附近。棒材，50μm。

免疫组织化学分析显示体内NK细胞杀死早期激活的HSC，但不是静止的或完全激活的HSCs。首先，给药NK细胞激活剂poly I:C后，DDC喂养的小鼠早期激活的卵圆形结蛋白阳性HSC数量显著减少（Radaeva和Gao，未发表数据）。第二，免疫组织化学分析表明，早期激活的HSC和NK细胞在肝实质II区和III区具有相似的分布，但不存在于门脉周围纤维化区域(图2B–C). 第三，NK细胞和早期激活的HSC之间的直接接触经常出现在受损的肝脏中(图2D).

体外细胞共培养和细胞毒性试验清楚地表明，NK细胞杀死早期激活的HSC，但不能杀死静止或完全激活的HSC(图1) [24]. 静止的HSC在塑料培养皿中培养时会自发激活，根据细胞形态和基因表达，HSC的激活可分为早期和慢性激活阶段。培养4-7天的HSC成为特征性的早期激活HSC，并逐渐失去其贮存的视黄醇，而长时间（21天）培养的细胞成为具有肌纤维母细胞样功能的完全激活HSC。体外细胞毒性试验表明，NK细胞只杀死培养第5-7天的HSC，而不杀死新分离的静止HSC或培养第21天的HSCs，这表明NK细胞选择性地杀死早期激活的HSC[24]. 此外，我们提供的证据表明，在活化过程中，早期活化的HSC产生维甲酸，维甲酸上调了NK细胞活化配体维甲酸诱导基因1（RAE1）在HSC上的表达。RAE1与NK细胞上的NKG2D结合，然后激活NK细胞，通过TRAIL和NKG2D-依赖机制杀死早期激活的HSC[21,24]. 相反，慢性激活的HSC或肌成纤维细胞失去了其细胞质中的视黄醇储存，不产生RA和RAE1，从而获得了对NK细胞杀伤的抵抗力。与小鼠模型类似，HCV感染患者的NK细胞通过TRAIL、Fas L和NKG2D依赖机制有效诱导活化的HSC凋亡[34]. 此外，激活后HSC中TRAIL受体表达升高[37]这可能也有助于提高这些活化HSC对NK细胞杀伤的敏感性。

除了NKG2D，NK细胞激活受体NKp46及其小鼠直系同源物NCR1也分别通过杀死原代人和小鼠HSC参与控制肝纤维化[31]. NKp46是哺乳动物NK细胞的统一标记，识别病毒血凝素和未知的细胞配体[38]. 最近，Gur等人[31]表明，在没有NKp46的情况下，尽管活化的NK细胞仍然能够杀死HSC，但对HSC的非活化NK细胞杀伤被完全废除，这表明NKp45在介导HSC非活化NK细胞杀伤和其他受体（如NKG2D）中起着关键作用有助于激活HSC的NK细胞杀伤。

此外，活化的HSC对NK细胞杀伤的敏感性增加也可能是由于NK细胞抑制性配体表达的变化[22]. 遵循CCl₄-诱导纤维化，活化的HSC失去MHC-1抗原的表达，MHC-1是一种NK细胞抑制配体，通过结合NK细胞上的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（iKIR）抑制NK细胞功能。因此，这些活化的HSC对NK细胞杀伤变得敏感[22]. iKIR在减弱NK细胞介导的抗纤维化作用中的重要作用得到了以下发现的支持：通过iKIR siRNA转染沉默iKIR可以增强HSC的NK细胞杀伤并抑制肝纤维化[28].

5.NKT细胞在肝纤维化形成中的多种复杂作用

与NK细胞介导的抗纤维化作用的一致结果相反，由于以下原因，NKT细胞在肝纤维化发病机制中的功能似乎更复杂，可能发挥不同的作用。首先，有几种类型的NKT细胞，包括I型和II型NKT淋巴细胞，它们在肝脏中发挥不同的作用，有时甚至相反的功能[9,44,45]. 其次，由于NKT细胞标记物的快速下调和/或活化后的凋亡，活化后的NKT淋巴细胞检测比NK细胞更困难[46,47]. 第三，内源性配体和细胞因子激活NKT细胞的机制体内基本上仍不为人知[48]. 第四，活化后，NKT细胞对随后的刺激产生耐受性和无反应性[49–51]. 最后，活化的NKT细胞可以产生大量抗纤维化（如IFN-γ）和促纤维化（如IL-4、IL-13、刺猬配体和骨桥蛋白）细胞因子，以及许多其他细胞因子、趋化因子和可差异调节肝纤维化形成的介质(图3).

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图3

NKT细胞在肝纤维化形成中复杂作用的机制。NKT细胞可以被CD1d在抗原呈递细胞（APC）上呈递的脂质抗原（如α-GalCer）激活。此外，一些细胞因子也可以激活NKT细胞。活化的NKT细胞迅速产生多种抗纤维化和促纤维化介质，分别减弱和增强肝纤维化。NKT细胞的净效应反映在NKT的抗纤维化和促纤维化作用之间的平衡。因此，NKT细胞在不同阶段和不同类型的肝脏疾病中可能在肝纤维化的控制中发挥不同的作用。OPN：骨桥蛋白；Hh：刺猬配体。

表2列出了最近评估NKT细胞在肝纤维化发生中作用的主要研究。2004年，第一项关于NKT细胞与肝纤维化的研究在丙型肝炎患者中进行[52]作者报告称，肝硬化HCV患者肝内iNKT细胞数量、CD1d在肝脏的表达以及iNKT细胞产生的促纤维化IL-4和IL-13细胞因子显著增加。基于这些发现，作者得出结论，iNKT细胞对慢性HCV感染引起的进行性肝损伤作出反应，随后通过产生促纤维化细胞因子促进肝纤维化。最近才开始使用动物模型研究NKT细胞在肝纤维化形成中的作用(表2). 这些研究大多依赖于两种NKT缺陷型小鼠：J 18 KO小鼠（I型iNKT细胞缺陷）和CD1d KO小鼠。

6.人类肝病中的NK细胞与肝纤维化

目前来自动物模型的研究表明，NK细胞抑制肝纤维化。有趣的是，最近的几项研究表明，与小鼠模型相比，NK细胞在控制慢性肝病患者肝纤维化方面可能发挥更大的作用。首先，人类肝淋巴细胞约为30–50%的NK细胞，这比小鼠肝淋巴细胞群（约10%的NK淋巴细胞）的频率要高得多。其次，在大多数啮齿动物肝纤维化模型中，肝脏NK细胞没有显著改变，而在病毒性肝炎、干扰素-α治疗、慢性饮酒和肝硬化等肝病患者的许多情况下，NK细胞的功能都有显著改变。在此，我们讨论了NK细胞在患者肝纤维化发病机制中的潜在意义。

7.人类肝病中的NKT细胞与肝纤维化

小鼠肝淋巴细胞约占NKT细胞的30-40%，而人类肝淋巴细胞群中NKT淋巴细胞的百分比可能要低得多。NKT（CD56）的百分比⁺CD3（CD3）⁺)人类肝淋巴细胞中的细胞变化很大，从3%到15%不等[63,84]CD1d依赖性NKT细胞占人类肝淋巴细胞的比例小于1%[84,85]. 虽然α-GalCer治疗小鼠会导致显著的肝脏炎症和损伤[50]，I/II期临床试验表明，注射α-GalCer不会对人类产生任何肝损伤迹象[85–87]. 这一结果表明，人类肝淋巴细胞可能含有较低百分比的NKT细胞，这些细胞在患者肝纤维化的发病机制中可能发挥不太重要的作用。

无肝硬化HCV患者的NKT细胞同时产生抗纤维化（IFN-γ）和促纤维化（IL-4和IL-13）细胞因子，而肝硬化HCV病人的NKT细胞则优先产生IL-4和IL-13。因此，人们认为NKT细胞促进HCV患者的肝纤维化[52]. 在NASH相关性肝硬化中，NKT细胞的数量显著增加，这种增加被认为可以促进NASH患者的肝纤维化[63]. 由于这些细胞产生多种细胞因子和细胞毒性介质，NKT细胞可能在不同阶段和不同病因的慢性肝病患者的肝纤维化控制中发挥复杂甚至相反的作用。需要进一步的临床研究来阐明NKT细胞的这种复杂功能。

8.NK/NKT细胞作为抗纤维化治疗的潜在治疗靶点

过去6年对动物模型和患者的研究清楚地表明，NK细胞具有较强的抗纤维化活性，这表明诱导NK细胞活性可能代表一种治疗肝纤维化的新策略[88]. 已知几种细胞因子可刺激NK细胞活化，包括IFN-α/β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ。其中，IFN-α/β具有最大的诱导NK细胞活化的能力，并且IFN-α治疗已被证明能增强HCV患者活化HSC的NK细胞杀伤[34]. 因此，干扰素-α作为NK激活剂和HSC的直接抑制剂，是病毒性肝炎或其他病因患者抗纤维化治疗的一个很有希望的选择。事实上，早期研究表明，干扰素-α治疗改善了对抗病毒治疗有反应的丙型肝炎患者以及对丙型肝炎病毒感染无反应的患者的肝纤维化[89,90]. 然而，最近的一项大型、多中心、为期5年的低剂量IFN-α试验表明，该疗法对慢性HCV感染和晚期纤维化伴或不伴肝硬化的患者的肝纤维化没有益处[91]. 低剂量IFN-α治疗缺乏有益效果可能是由于观察到晚期纤维化与高水平的TGF-β有关，TGF-β抑制低剂量IFN-α介导的NK细胞活化[29]. 此外，目前正在进行的许多抗纤维化临床试验正在检测干扰素-α单独或干扰素与其他药物联合使用的效果[92]. 在这些试验中纳入研究，以确定外周和肝内NK细胞在干扰素-α治疗后是否被激活，以及这种激活是否与患者肝纤维化的改善相关，这将很有意义。IL-12和IL-18也是强大的NK细胞激活剂，但使用IL-12或IL-18治疗会导致显著的肝脏炎症和损伤[93]因此，这不是治疗肝纤维化的好策略。

除了NK细胞活化剂外，许多因素也被证明可以减弱NK细胞对HSC的细胞毒性。例如，据报道，TGF-β、饮酒和NK细胞抑制受体可抑制HSC的NK细胞杀伤[26,28,29]. 去除这些抑制因子可能为治疗肝纤维化提供其他有希望的策略。例如，iKIR的siRNA敲除增强了小鼠NK细胞的功能，并促进了NK细胞在小鼠中和与人类NK-HSC共同培养时的抗纤维化活性，该技术已被提议作为抗纤维化治疗的一种治疗选择[28].

NKT激活剂α-GalCer也用于治疗病毒性肝炎的I/II期临床试验，但没有显示任何抗病毒作用[86,87]. 然而，在这些研究中没有对肝纤维化进行研究。由于这些细胞产生多种细胞因子和细胞毒性介质，在调节肝纤维化中发挥复杂且可能相反的作用，因此NKT细胞很难用作抗纤维化治疗的治疗靶点。

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脚注

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