趋化因子CXCL14与结直肠癌根治术后患者预后相关

CXCL14的克隆、转染和半定量RT-PCR

为了克隆CXCL14 cDNA，我们从HCT116细胞株中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用逆转录酶和随机六聚体，使用ExScript™试剂盒（中国大连TaKaRa）从1μg总RNA中逆转录出最终体积为20μl的第一链cDNA。底漆是使用Primer Premier 5软件设计的。使用的引物为CXCL14:forward 5^′-CGG GAT CCA TGT CCC TGC TCC CAC GCC-3^′，倒档5^′-CCC TCG AGC TAT TCT TCG TAG ACC CTG CGC TT-3^′（336 bp产物片段）。根据以下标准方案，在DNA热循环器（Bio-Rad）中使用rTaq（TaKaRa）进行PCR：初始变性（94℃下2分钟），然后在94℃下30个周期变性30秒，在56℃下退火45秒，在72℃下伸长率50秒。最后一个周期后，终端伸长率步骤（5添加72℃下的min），然后将样品保持在4℃。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上进行，用SYBR Gold（Molecular Probes，Eugene，OR）染色，并在紫外光下分析。

为了构建真核表达载体，根据制造商的说明，使用真核TA表达试剂盒（Invitrogen Life Technologies，Grand Island，NY）将CXCL14 cDNA克隆到pcDNA3.1（+）质粒中。根据供应商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies，Grand Island，NY）将人CXCL14表达载体转染人大肠杆菌细胞系SW620。接下来，分离转染细胞并用G418（纽约州格兰德岛Invitrogen Life Technologies）处理，获得12个克隆。以稳定转染pcDNA3.1（+）空载体的SW620细胞作为模拟对照。通过半定量RT-PCR验证大肠细胞系之间CXCL14表达的差异。GAPDH和CXCL14的基因转录通过上述两步逆转录-PCR进行分析。

靶向CXCL14的shRNA表达载体的构建及转染

根据已发表的文献，合成了靶向CXCL14的21 mer shRNA表达载体（shCXCL14）及其作为阴性对照的乱序表达vecotr（shNC）[22]. CXCL14 shRNA的插入序列为5^′-GCA CCA AGC GCT TCA TCA ACT GTG AAG CCA CAG ATGGGT TGA TGA AGC GCT TGG TGC-3^′干扰控制shRNA为5^′-GCC ATA CGC GAC ATA ACC TC合同T GTG AAG CCA CAG ATGGGA GGT TAT GTC GCG TAT GGC-3^′。带下划线的核苷酸表示19-bp发夹环序列。使用脂质体转染HCT116细胞和这些载体。单独用脂多糖胺处理的细胞被用作模拟对照。为了进行增殖和运动试验，在使用前将这些载体转染细胞24小时。为了进行表达分析，在转染后48小时收集细胞。

蛋白质印迹

在RIPA缓冲液中提取蛋白质（50 mM Tris-base、1.0 mM EDTA、150 mM NaCl、0.1%SDS、1%TritonX-100、1%脱氧胆酸钠、1 mM苯甲基磺酰氟），并使用DC蛋白质检测试剂盒（美国Bio-Rad）进行定量。样品在10%或12%SDS-PAGE上分离，并转移到PVDF膜（Amersham Biosciences）。用含0.1%吐温20的PBS在4°C的5%脱脂牛奶中隔夜封闭膜，然后使用以下主要抗体进行探测：兔抗-CXCL14（稀释1:400，Proteintech）。将印迹与各自的初级抗体在室温下孵育2小时，并用吐温20在TBS中洗涤3次。随后，将印迹与结合辣根过氧化物酶的第二抗体（稀释1∶1000；Santa Cruz Biotechnology）在室温下孵育2小时。如前所述，通过增强化学发光试剂（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）检测目标蛋白[23]. β-actin作为内部对照。

体外增殖试验

5-溴-2^′-脱氧尿苷（BrdU）掺入试验，如前所述进行[24]. 细胞以5×10的密度接种在24孔培养板中⁵，增长到预影响（60%）。治疗后，将BrdU（10 mM）（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）添加到每个孔中，并孵育4小时。抗-BrdU抗体（中国中山生物技术公司），使用适当的异硫氰酸荧光素标记的二级抗体。使用共焦显微镜观察染色（德国海德堡莱卡）。通过计算八个备选区域中BrdU阳性细胞的数量来确定细胞增殖。如前所述，进行3-（4,5-甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析[25]. 为了评估软琼脂中的细胞生长，将细胞（3000个细胞/孔）重悬于含有10%FBS和0.35%琼脂糖的DMEM中，并在6孔板上的DMEM中的0.5%琼脂糖上分层。对于集落形成分析，将SW620细胞（100个细胞/孔）与rhCXCL14（PeproTech）（0-100 ng/ml）一起重新悬浮在DMEM 10%FBS中的6孔板上。培养物保存14天，平板用水晶紫染色。每项实验一式三份。

体外运动试验

细胞迁移分析在24孔跨孔室中进行（纽约州科宁市）。无血清培养基中的细胞（1×10⁵每个孔的细胞数）添加到上腔。20小时后，计数通过膜迁移到下室的细胞数量。对于入侵分析，将基质凝胶（1:3，BD）添加到跨孔膜室中，培养4小时，并接种细胞。如前所述，72小时后对迁移至下室的细胞进行计数[26].

外科标本

从2006年在四川省人民医院（中国成都）接受手术切除的患者中收集了265例原发性大肠肿瘤和129例相应的相邻正常大肠粘膜。根据国际抗癌联盟肿瘤结节转移（TNM）分类系统对原发肿瘤进行分期[27]. 由经验丰富的病理学家根据Edmondson Steiner分级对肿瘤分化进行分级。进一步的临床病理学患者信息摘自临床笔记，详细的结直肠癌人口统计汇总见表1.在分析之前，获得了所有患者对组织采购的知情同意，该项目得到了四川大学机构伦理委员会的批准。

免疫组织化学染色

组织采用福尔马林固定，石蜡包埋，根据制造商的说明，使用Dako Envision System（Dako Cytomation GmbH，德国汉堡，丹麦）进行连续4μm厚切片的免疫组织化学分析。简单地说，石蜡切片脱蜡，再水化，在3%H中培养₂O（运行）₂在室温下黑暗中放置10min以阻断内源性过氧化物酶活性，并用高压灭菌器法在柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中检测抗原。随后，用PBS（pH 7.4）中稀释的正常胎牛或山羊血清在37°C下预孵育切片15分钟，然后在4°C下用一级抗体（兔抗CXCL14，稀释度1:50，Proteintech；兔抗CXCL14，稀释率1:200，Abcam；兔抗Ki67，稀释度1:200，Abcam）孵育过夜。在新鲜PBS中冲洗后，将载玻片与辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔抗体在37°C下孵育40分钟，然后用3,3染色^′-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液（Dako Cytomation GmbH），并用迈尔苏木精进行复染。使用与一级抗体稀释度相同的非免疫兔IgG作为阴性对照。

免疫组织化学染色评价

细胞质中有可见棕色颗粒的细胞被认为是阳性的。所有切片均由两名资深病理学家（Y.X.和D.D.）进行评估，不考虑患者结果和所有临床病理结果。根据CXCL14免疫染色的强度（弱=1，强=2）和阳性肿瘤细胞的密度（0%=反向，1-50%=1，51-75%=2，>76%=3）评估免疫组织化学染色[28]. 每个样本的最终得分乘以强度和密度，最终确定肿瘤为相反值：得分=0；低表达：得分≤3分；高表达：得分>3。如果评估结果不一致，则重新评估样本，然后根据观察员最频繁的评估结果进行分类。

CXCL14与CRC的几个临床病理因素相关

接下来我们分析了CXCL14在肿瘤组织中的表达与临床病理因素之间的相关性。该分析中的参数包括性别（男性、女性）、年龄（25-88岁）、TNM分期（I、II、III、IV期）、肿瘤侵袭（T1、T2、T3、T4）、组织分化（良、中、低分化）、淋巴结转移（N0、N1、N2）、肿瘤大小（<2、2-5、>5）和位置（结肠、直肠）。我们发现CXCL14表达水平与TNM分期呈正相关(P（P） < 0.001，图2安培，C；表2)与组织分化相反(P（P） = 0.002，图2B型，D；表2). 在226例CXCL14阳性的CRC患者中，8例处于I期（粘膜下层浸润），83例处于II期（浆膜下浸润），127例处于III期（淋巴结转移），8例位于IV期（远处转移）；高分化57例，中分化140例，低分化29例。此外，CXCL14表达水平与肿瘤大小呈正相关(P（P） = 0.001,P（P） = 早期（I/II）大肠癌和晚期（III/IV）大肠癌分别为0.003，表三). 未观察到CXCL14表达与其他临床因素之间的明显相关性（表三). 这些分析表明，结直肠癌细胞中CXCL14的上调与肿瘤进展相关。

在单独的窗口中打开

图2

CXCL14的表达水平与TNM分期和组织分化程度显著相关。A、，与早期CRC相比，晚期CRC更容易出现强烈的免疫反应(P（P） < 0.001). 棒材，50μm。B、，低分化大肠肿瘤的CXCL14免疫反应性强于中分化和高分化大肠肿瘤(P（P） = 0.002). 棒材，25μm。C类和D、，根据TNM分期比较CXCL14免疫组化评分(C类)和组织分化(D类).

CXCL14与疾病复发相关

将早期（I/II）结直肠癌患者分为低CXCL14表达肿瘤组（n=69）和高CXCL14表达肿瘤组（n=22）。Kaplan-Meier方法分析显示，与CXCL14低表达患者相比，CXCL14高表达患者的无病生存率显著降低：36.4%五14.5%（对数秩P（P） = 0.018，图3A级). 通过单变量分析，CXCL14表达、淋巴结数量和肿瘤大小与疾病复发显著相关（表4). 为了确定CXCL14表达的预后价值是否独立于与结直肠癌临床预后相关的其他风险因素，使用Cox比例风险模型进行了多变量分析。结果表明，只有CXCL14仍然是早期结直肠癌患者无病生存的预后因素（风险比，2.92；95%可信区间，1.15-7.40；P（P） = 0.024; 表4). 在所有AJCC II期CRC患者中，21例样本中发现CXCL14高表达，而其他62例样本中CXCL14的表达相对较低。那些高表达CXCL14的肿瘤患者的无病生存率也明显较差（Log-rankP（P） = 0.03，图3B公司).

在单独的窗口中打开

图3

累积性疾病-CXCL14高或低表达的CRC患者的自由和总体生存率。A类和B、，Kaplan-Meier无病生存曲线评估AJCCⅠ/Ⅱ期CRC患者的生存率(A类)和AJCC II期CRC患者(B类).C类和D、，Kaplan-Meier总生存曲线评估AJCC III/IV期CRC患者的生存率(C类)和AJCC III期CRC患者(D类). 比较CXCL14高表达组和CXCL14低表达组。图形线上的标记表示经过审查的样本。P（P）值是指双边对数秩检验。

CXCL14与总生存率相关

135例晚期（III/IV）结直肠癌患者的原发性结直肠癌标本中CXCL14的表达水平将这些肿瘤分为67例高表达和68例低表达的肿瘤。135例结直肠癌患者的总体生存分析表明，CXCL14表达水平与患者术后生存时间呈负相关。CXCL14强表达患者的总体生存率显著降低。采用Kaplan-Meier方法构建总体生存曲线，并使用对数-秩检验（Log-rank test）进行分析P（P） = 0.003，图3C公司). 为了确定CXCL14作为晚期结直肠癌患者总生存率预测因子的预后意义，进行了单变量和多变量分析。通过单变量分析，包括年龄、淋巴结转移和CXCL14表达在内的临床因素与总生存率显著相关（表4). 多变量模型中包括了在单变量分析中具有显著性并显示出显著性趋势的因素。结果表明，CXCL14表达可作为结直肠癌患者总体生存的预后因素（风险比3.087；95%可信区间1.866-5.107；P（P） < 0.001; 表4). III期CRC患者分为低CXCL14表达肿瘤组（n=66）和高CXCL14表示肿瘤组（n=61）。通过单变量分析，CXCL14的表达（低表达与高表达）在所有III期CRC患者中仍然存在显著差异（Log-rankP（P） < 0.001，图三维).

CXCL14上调与大肠癌高增殖相关

为了探讨CXCL14是否与结直肠癌细胞增殖相关，细胞增殖标志物Ki67的水平[29]在118例结直肠癌切除标本中进行了分析，这些标本也用CXCL14抗体进行了检测（图4A级). CXCL14和Ki67水平相互对照，使用Spearman相关性检验的统计分析显示这些参数之间存在显著相关性(P（P） < 0.01; 图4B类). 这些结果表明CXCL14可能在诱导结直肠癌增殖中起因果作用。

在单独的窗口中打开

图4

CXCL14表达对人结直肠癌细胞增殖的影响。A、，使用CXCL14和Ki67抗体对人类大肠肿瘤切片进行免疫组织化学染色。棒材，25μm。B、，CXCL14和Ki67表达水平的相关性（n=118；P（P） < 0.01，双尾斯皮尔曼检验系数：0.502）。C、，采用半定量RT-PCR和Western blotting检测了几种结直肠癌细胞系内源性CXCL14 mRNA和蛋白水平。D、，CXCL14在SW620亚克隆（克隆1和克隆2）中稳定过表达。E类-G、，用BrdU掺入法比较稳定表达CXCL14或模拟载体的SW620细胞的增殖(E类)，MTT检测(F类)和菌落形成分析(G公司)分别是。H、，shCXCL14转染HCT116细胞可抑制CXCL14的表达。我-K、，BrdU法检测shCXCL14或shNC转染HCT116细胞的增殖(我)，MTT分析(J型)和菌落形成分析(K（K）)分别是。误差线代表±标准偏差。学生t吨测试用于统计分析，P<0.05；**，P<0.01。

CXCL14对大肠癌细胞体外增殖的影响

为了探讨CXCL14对结直肠癌细胞增殖的影响，我们研究了CXCL14 mRNA和蛋白在四种不同结直肠癌癌细胞系HCT116、SW620、RKO和LoVo中的表达水平（图4摄氏度). 结果表明，SW620只具有较低水平的内源性CXCL14表达，因此将人CXCL14 cDNA转染到细胞系中，用G418进行克隆形成。选择CXCL14升高的两个克隆（克隆1和克隆2）进行进一步研究。与模拟对照组相比，半定量RT-PCR和Western blotting证实CXCL14稳定过表达（图4天). MTT分析和BrdU掺入分析表明，这两个亚克隆的生长速度明显快于对照细胞（图第四版，F）。我们在6孔板中进行了菌落形成分析。正如预期的那样，结果表明，与对照细胞相比，这两个亚克隆产生了更多的菌落（图4G网络). 此外，用rhCXCL14蛋白治疗可以促进SW620细胞增殖（附加文件2：图S2A-C）。而shRNA介导的对HCT116细胞CXCL14表达的抑制导致细胞增殖显著下降（图4小时-K） ●●●●。总之，这些数据确定了以前未被识别的CXCL14对结直肠癌细胞的生长刺激作用。