自闭症谱系障碍（ASD）是一种早发、异质的遗传性神经精神障碍，其症状包括社交技能缺陷、交流能力受损和仪式性重复行为1,2ASD常见分子机制的一个假设是翻译控制发生改变，导致蛋白质合成过度三染色体4q中的遗传变异，包含EIF4E型基因座，在自闭症患者中有描述4,5重要的是，在自闭症中发现了一种罕见的单核苷酸多态性，这种多态性与EIF4E型基因6在这里，我们表明，通过遗传方式增加小鼠中eIF4E的水平7结果过度的cap依赖性翻译和反常行为会让人联想到孤独症，包括重复性/持续性行为和社交障碍。此外，这些自闭症样的行为伴随着内侧前额叶皮层、纹状体和海马的突触病理生理学。eIF4E转基因小鼠表现出的自闭行为可通过脑室内注射cap依赖性翻译抑制剂4EGI-1进行纠正。我们的研究结果表明，过度的cap依赖性翻译、突触功能障碍和与自闭症相关的异常行为之间存在因果关系。
eIF4E转基因小鼠7大脑各区域eIF4E水平增加()其他翻译控制蛋白水平无代偿性变化(). 我们研究了eIF4E是否优先与4E-BP或eIF4G结合，后者分别抑制和促进cap依赖性翻译的启动8,9。我们发现eIF4E转基因小鼠的大脑中eIF4E/eIF4G相互作用水平显著升高(和补充图1a)eIF4E和4E-BP之间的相互作用没有改变(、左侧和补充图1a). 为了证实eIF4E/eIF4G相互作用增加导致蛋白质合成增加，我们将嘌呤霉素注入空心小鼠的侧脑室，并使用SUnSET标记新合成的蛋白质10,11并观察到增加从头开始cap相关翻译(和补充图1b-g). 总的来说，我们的结果表明，eIF4E的过度表达导致eIF4E转基因小鼠大脑中过度的cap依赖性翻译。
eIF4E转基因小鼠表现出增加的eIF4E/eIF4G相互作用和过度的cap依赖性翻译一eIF4E转基因小鼠（4E-Tg）在多个脑区的eIF4E表达增加。n=4只小鼠/基因型*第页与野生型（WT）、学生型相比<0.05t吨-测试。b条，4E-Tg小鼠表现出其他翻译控制蛋白的正常表达。n＝4只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。c（c），4E-Tg小鼠表现出增加的eIF4E/eIF4G相互作用。eIF4E（左面板）和eIF4G（右面板）的免疫沉淀。n=3只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。d日，用SUnSET测量4E Tg小鼠的翻译增加（参见补充方法). 每个自动射线图的垂直线轨迹显示在右侧。n=3只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。–表示不含嘌呤霉素的对照样品。所有数据均显示为平均值±SEM。
然后我们确定eIF4E转基因小鼠是否表现出重复性和持续性行为，这是ASD诊断所需的行为域2eIF4E转基因小鼠在大理石掩埋试验中表现出重复挖掘行为12并加强自我打扮13与野生型室友相比(). eIF4E转基因小鼠在水基Y迷宫和改良版Morris水迷宫中也表现出认知灵活性14,15在这些任务的获得和记忆阶段的学习能力是完整的；然而，在逆转阶段，eIF4E转基因小鼠在定位新平台位置时受到损害(和补充图2e-h). 我们通过检测eIF4E转基因小鼠对线索恐惧条件反射的消退来测试另一种形式的行为不灵活，并发现它们在消退训练后的冷冻反应没有显著降低(). 这些实验表明，大脑中过度的帽依赖性翻译会影响抑制先前编码的反应模式的能力，以及形成新的行为策略以应对环境变化的能力。
eIF4E转基因小鼠表现出ASD样行为将eIF4E转基因小鼠（4E-Tg）与野生型（WT）同窝小鼠进行比较。一，大理石掩埋试验：n=21–22只小鼠/基因型***第页<0.001和*第页<0.05 vs WT，重复测量（RM）ANOVA[时间X基因型，F(2,46)=31.62,第页<0.001]然后进行Bonferroni-Dunn测试。b条，自我修饰测试：n=12只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。c（c），Y迷宫逆转任务：n=21-22只小鼠/基因型*第页<0.05和***第页<0.001 vs WT，RM方差分析[时间X基因型，F(5,138)=16.74,第页<0.001]然后进行Bonferroni-Dunn测试。d日，Morris水迷宫（MWM）逆转学习：n=12-13只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，RM ANOVA[时间X基因型，F(3,92)=6.1,第页<0.001]然后进行Bonferroni-Dunn测试。e（电子），线索恐惧记忆消失（15 CS/天，表示为3 CS/块）：n=6只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT，RM ANOVA[第1天：时间X基因型，F(4,40)=5.73,第页< 0.001; 第2天：时间X基因型，F(4,40)=4.81,第页<0.01]，然后进行Bonferroni-Dunn测试。f、 克社交行为测试：与陌生老鼠互动的时间（f），或在腔室中克n=6只小鼠/基因型*第页<0.05和°第页<0.05 vs.WT，RM方差分析[（f）：刺激X基因型，F(1,10)=6.04,第页< 0.05;克：刺激X基因型，F(1,10)=6.12,第页<0.05]，然后进行Bonferroni-Dunn试验。小时，交互社交任务：n=6只小鼠/基因型*第页<0.05 vs WT控制，学生t吨-测试。所有数据均显示为平均值±SEM。
社交技巧异常是自闭症患者表现出的另一种行为缺陷2.在测试中检查社交行为16–18，与新型无生命物体相比，eIF4E转基因小鼠对非特异性陌生人没有表现出偏好(). 此外，eIF4E转基因小鼠与自由移动的陌生小鼠的相互作用减少()进一步证明了社会行为缺陷。eIF4E转基因小鼠的社交行为缺陷不太可能是由普遍的焦虑增加引起的(补充图2c、2d和2j). 此外，eIF4E转基因小鼠表现出轻度多动(补充图2a和2b)，但在运动协调、运动学习和感觉运动门控方面无损伤(补充图2i和2k，2l). 综上所述，我们对eIF4E转基因小鼠的行为分析表明，大脑中cap依赖性翻译增加会导致与ASD一致的明显行为异常模式。
以前的研究表明，ASD症状，如认知缺乏灵活性和社交行为缺陷，是由前额叶和/或纹状体回路异常引起的19与这一观点一致，内侧前额叶皮层（mPFC）参与调节社交行为和社交技能20而ASD男孩的运动、社交和沟通障碍与纹状体解剖异常有关21因此，我们接下来检查eIF4E转基因小鼠在mPFC和纹状体中是否表现出特定的突触病理生理。
在eIF4E转基因小鼠中，对急性mPFC切片2/3层的自发突触“迷你”事件的检查显示兴奋性事件的频率增加，但幅度没有增加（mEPSC；)以及抑制事件的振幅增加，但频率没有增加（mIPSC；). 在第5层中未观察到任何变化(补充图3a、3b). 因此，我们的数据表明，第2/3层锥体神经元对抑制事件的兴奋性输入和突触后敏感性增强，这与自闭症可能由兴奋性和抑制性突触传递之间的不平衡引起的假设一致22.
eIF4E转基因小鼠表现出突触功能、树突状棘密度和突触可塑性的改变一，eIF4E转基因小鼠（4E-Tg）表现出mEPSC频率增加和b条增加2/3层mPFC锥体神经元的mIPSC振幅。n=27–30个神经元/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。c、 d日4E-Tg小鼠第2/3层mPFC锥体神经元的树突状棘密度增加。高清晰度图像c（c）并对野生型（WT）和4E-Tg小鼠的棘突树突进行了量化。n=12个神经元/基因型*第页<0.05 vs WT，学生t吨-测试。比例尺=2µm。e（电子），4E-Tg小鼠表现出增强的纹状体LTD。n=13片，来自8只小鼠/基因型。（f），4E-Tg小鼠表现出增强的海马mGluR-LTD。n=15片，来自8只小鼠/基因型。g、 小时，4EGI-1使4E-Tg小鼠显示的增强纹状体LTD正常化小时，不会影响WT小鼠的LTD克n＝来自9只小鼠的18个切片/基因型/治疗。所有现场记录均采用重复测量ANOVA进行分析。箭头表示高频刺激（HFS）的传递。实心条表示DHPG（10µM，10分钟）和4EGI-1（100µM（45分钟）的镀液涂敷时间。HFS之前（黑色）和之后60分钟（红色）显示fEPSP的代表性轨迹（右侧面板）。所有数据均显示为平均值±SEM。
为了确定自发mEPSCs频率的增加是否是由于突触接触次数增加所致，我们使用双光子激光扫描显微镜对树突棘进行成像(和补充图3c，3d). 我们发现eIF4E转基因小鼠的脊椎密度显著增加（约12%），并且与野生型同窝小鼠相比，其脊椎体积显著减小（WT=0.123±0.004μm三和4E Tg=0.110±0.004 um三，p=0.01 vs.WT，学生t吨-测试）。
接下来，我们研究了eIF4E表达增加是否也导致纹状体的突触病理生理学。我们使用高频刺激（HFS）在急性纹状体切片中诱导长期抑郁（LTD）23并发现eIF4E转基因小鼠与野生型同窝小鼠相比表现出更强的LTD(,补充图3e、3f). 我们假设eIF4E转基因小鼠中LTD的增强会导致纹状体信息存储和处理效率的改变，最终导致无法形成新的运动模式和/或脱离先前学习的运动行为。
为了确定eIF4E转基因小鼠中描述的突触改变是否对额纹状体回路有选择性，我们检测了海马的突触可塑性24。我们发现eIF4E转基因小鼠与野生型同窝小鼠相比表现出更强的mGluR-LTD(,补充图3g，3h)与之前的研究一致，研究表明，大脑蛋白质合成的变化伴随着海马mGluR-LTD的改变（增强或减少）25,26因此，与eIF4E在大脑中的表达普遍增加一致，eIF4E转基因小鼠在与ASD相关的行为异常相关的多个大脑区域（mPFC、纹状体和海马）中显示出突触功能和可塑性改变。
最后，我们询问过度的cap依赖性翻译是否与eIF4E转基因小鼠的突触改变和ASD样行为有关。我们利用了4EGI-1，一种eIF4E/eIF4G相互作用的抑制剂8,11，以阻止eIF4E表达增加的突触和行为后果。浴敷4EGI-1使eIF4E转基因小鼠纹状体LTD增强正常化()，表明夸大了纹状体LTD()是eIF4E与eIF4G绑定增加的直接结果(补充图3i-k).
接下来，我们使用4EGI-1的亚阈值剂量11使eIF4E转基因小鼠的行为异常正常化，而不损害其野生型同卵鼠。用4EGI-1处理的eIF4E转基因小鼠在大理石埋葬任务期间的重复行为减少，埋葬任务从第四天开始，持续到第五天(). 此外，我们发现4EGI-1维持了在大理石花纹任务中观察到的行为效应(补充图4a和4b). 我们还发现，阻断eIF4E/eIF4G与4EGI-1的相互作用可以显著提高eIF4E转基因小鼠在Y迷宫试验逆转阶段的表现(). 这些发现表明，用4EGI-1对eIF4E转基因小鼠进行长期治疗可以逆转其重复性和持续性行为。我们还发现，注射4EGI-1可以缓解eIF4E转基因小鼠在三室竞技场试验中表现出的社会行为缺陷，因为与新物体相比，它们对非特异性陌生人的偏好增加().
帽依赖性翻译抑制剂4EGI-1逆转eIF4E转基因小鼠表现出的ASD样行为一，用4EGI-1治疗eIF4E转基因小鼠（4E-Tg）可减少大理石花纹行为n=6只小鼠/基因型/治疗**第页< 0.01, *第页<0.05 vs.4E Tg+载体，双向重复测量（RM）方差分析[治疗X基因型，F(1,20)= 4.21,第页<0.05]，然后进行Bonferroni-Dunn试验。b条，4EGI-1提高了Y迷宫测试中4E-Tg小鼠的认知灵活性。n=6–7只小鼠/基因型/治疗**第页< 0.01, *第页<0.05 vs.4E Tg+载体，双向RM方差分析[治疗X基因型，F(1,21)=4.61,第页<0.05]，然后进行Bonferroni-Dunn试验。c（c）在三室竞技场试验中，4EGI-1改善4E-Tg小鼠的社会行为。n=6只小鼠/基因型/治疗*第页<0.05和°第页<0.05 vs.4E Tg+载体，双向RM方差分析[治疗X基因型，F(1,20)=6.26,第页<0.05]，然后进行Bonferroni-Dunn试验。d日，4EGI-1减少4E-Tg小鼠中增强的eIF4E/eIF4G相互作用。纹状体中eIF4E的免疫沉淀（IP）。n=4只小鼠/基因型*第页<0.05和°第页与车用野生型（WT）和4E Tg相比，分别<0.05，双向方差分析，然后进行Bonferroni-Dunn测试。e（电子），4EGI-1使用SUnSET测量的4E-Tg小鼠中过度的cap依赖性翻译正常化。最后一个WT样本代表不含嘌呤霉素的对照组*第页<0.05和°第页与车用WT和4E Tg相比，分别<0.05，双向方差分析，然后进行Bonferroni-Dunn测试。所有数据均显示为平均值±SEM。
在用4EGI-1完成行为研究时，我们进行了联合免疫沉淀实验，证实4EGI-1减少了eIF4E转基因小鼠表现出的增加的eIF4E/eIF4G相互作用(和补充图4c-e). 此外，新合成蛋白质的嘌呤霉素标记降低到野生型水平，表明4EGI-1可以有效地减弱eIF4E转基因小鼠中cap依赖性翻译增加(和补充图4f和4g). 总之，这些结果表明，用4EGI-1反复治疗eIF4E转基因小鼠可以逆转eIF4E与eIF4G结合增加、帽子依赖性翻译过度以及ASD样行为的逆转。
在此，我们已经证明，eIF4E表达增加，从而导致小鼠蛋白质合成起始阶段翻译控制失调，导致出现突触功能障碍和与ASD一致的异常行为。根据我们的观察结果，我们假设eIF4E转基因小鼠和FXS模型小鼠的cap依赖性蛋白合成增加27,28导致特定mRNA子集的翻译增强。因此，这些mRNA和顺式-负责eIF4E依赖性蛋白合成的5'UTR中的作用元件及其可能与脆性X智力迟钝蛋白靶mRNA重叠将是未来研究中的重要研究。
总之，我们对eIF4E转基因小鼠的研究表明，大脑中过度的cap依赖性翻译可以诱导ASD样行为。此外，我们证明了eIF4E转基因小鼠表现出的异常重复、持续和社交行为可以通过减少eIF4E/eIF4G相互作用来逆转，从而恢复翻译稳态。因此，我们的发现在过度的cap依赖性翻译和自闭症相关行为之间建立了因果关系。最后，我们的研究结果表明，过度的cap依赖性翻译导致的行为缺陷也发生在FXS中29,30这是一种ASD发病率高的疾病，并不是不可改变的，可以在成年后得到很好的纠正。
方法
住房
βT的生成-Eif4e标准转基因小鼠（eIF4E转基因小鼠）已在前面描述过7.
在所有的实验中，我们使用了来自杂交杂合子的同卵双胞胎。将小鼠回交到C57BL/6J小鼠的N10代。总的来说，eIF4E转基因小鼠是活的、可繁殖的，并且在本研究所用的年龄范围内没有出现大体解剖异常。eIF4E转基因小鼠及其野生型窝鼠被分为每组笼中3-4只动物，并定期进行12小时的光/暗循环（早上7:00点亮灯）。有食物和水随意.
手术和药物输注
将小鼠麻醉[氯胺酮（100 mg/kg）和木聚嗪（10 mg/kg）]并安装在立体定向仪上。将插管（26号）单侧植入以下坐标（前后侧-0.22 mm，内侧+1 mm，背侧-2.4 mm）31手术后允许小鼠恢复一周。
如前所述进行eIF4E/eIF4G抑制剂4EGI-1的输注11将溶于100%二甲基亚砜中的4EGI-1在载体[0.5%（2-羟丙基）-β-环糊精和ACSF中的1%二甲基亚磺酸]中稀释。在1分钟（0.5µL/min；哈佛仪器）内注入4EGI-1（20µM）或载体。在治疗的最后一天，在4EGI-1输注之前，小鼠接受4EGI-1单独输注或嘌呤霉素（0.5µL中25µg）输注。所有行为和组织剥离均发生在4EGI-1输注后1小时。
行为
如前所述，对雄性eIF4E转基因小鼠及其野生型同窝仔（2-6个月大）进行了以下行为测试：新颖性诱导的运动活性32，开放字段33、高架加迷宫33，旋转木马34，脉冲前抑制33、大理石埋设14、社会行为16，直接社交35,36y迷宫和莫里斯水迷宫7,35.
对于所有实验，在行为训练前30分钟，将小鼠驯化到测试室，并在每次试验之间用30%乙醇清洁所有行为器具。实验者在执行和评分所有行为任务时，对基因型和药物治疗一无所知。所有行为测试都是从最不厌恶的任务开始（运动活动），以最厌恶的任务结束（水基迷宫或恐惧记忆消失）。
蛋白质印迹
小鼠在注射4EGI-1或4EGI-1和嘌呤霉素后1小时断头处死。快速解剖纹状体和前额叶皮层，将其放置在冰冷的表面上，并在1%SDS中超声处理并煮沸10分钟。使用BCA（二辛可宁酸）检测试剂盒（Pierce，Thermo Scientific，Rockford，USA）将匀浆的等分试样（2µl）用于蛋白质测定。将每个样品的等量蛋白质（20µg）加载到10%的聚丙烯酰胺凝胶上。蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并隔夜转移至聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-Psq，Millipore Corporation，Billerica，USA）。用抗eIF4E（1:1000）、eIF4G（1:1000。使用抗β-肌动蛋白和微管蛋白的抗体（1:5000，Cell Signaling Technology，MA，USA）估算蛋白质总量。检测基于HRP结合二级抗体（美国威斯康星州Promega）和化学发光试剂（ECL或ECL plus；英国白金汉郡GEHealthcare），并使用柯达4000MM成像仪进行可视化，以获得感兴趣波段的像素密度值（美国纽约州Carestream）。所有图像均使用最大灵敏度设置获得，无需分格（0–65 K信号范围）。没有分析的图像显示感兴趣波段的饱和信号（>65 K灰度值）。根据样品中检测到的相应β-肌动蛋白或微管蛋白的数量，对每个蛋白质的数量进行标准化。
免疫沉淀
组织在含有40 hepes（pH7.5）、150 NaCl、10焦磷酸、10甘油磷酸、1 EDTA和0.1%CHAPS、蛋白酶抑制剂II、磷酸酶抑制剂混合物I、II（Sigma-Aldrich，MO，USA）的冰溶免疫沉淀缓冲液中均质。用抗eIF4G（2.5µg）或eIF4E（2.5µ）（美国德克萨斯州贝蒂尔实验室）孵育清洁的匀浆（500µC），并在4°C下轻轻摇晃过夜。抗体/裂解液混合物与与琼脂糖结合的75µL IgG孵育（美国伊利诺伊州赛默科学公司）。珠/样品浆液在4°C下摇晃过夜。取下并保存上清液，在裂解缓冲液中洗涤免疫沉淀物三次，在洗涤缓冲液中清洗一次（50 mM hepes pH 7.5，40 mM NaCl，2 mM EDTA）。将SDS/PAGE缓冲液添加到洗涤的免疫沉淀物中，然后将其在4到12%的梯度凝胶上溶解。免疫沉淀的效率是通过检查从柯达4000MM成像仪获得的图像中获得的上清液和洗涤液部分来确定的（参见Western Blots）。共免疫沉淀eFI4E、eIF4G和4E-BP的带密度值归一化为免疫沉淀eIF4G或eIF4E。
SuNSET公司
如前所述，使用SuNSET方法进行蛋白质合成分析11使用小鼠单克隆抗体12D10（1:5000，来自5 mg/mL储备）在印迹上鉴定纯化霉素处理过的样品。因为只有一小部分脑蛋白被标记，所以使用ECL-Advance（英国白金汉郡GEHealthcare）从印迹中识别出信号。
电生理学
如前所述，准备用于电生理学的海马（400µm）、前额和纹状体切片（300µm24.
维护切片的解决方案
切割溶液（CS；单位：mM）：110蔗糖、60 NaCl、3 KCl、1.25 NaH2PO4、28 NaHCO3、0.5 CaCl2、7 MgCl2、5葡萄糖、0.6抗坏血酸。人工脑脊液（ACSF；单位：mM）：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、25 NaHCO3、25 D-葡萄糖、2 CaCl2和1 MgCl2。切片在室温下培养，然后放置在记录室中，在33°C下额外恢复60分钟。
细胞外记录
如前所述，记录细胞外场EPSP23,24在所有实验中，在长期抑郁（LTD）诱导前至少20分钟监测基线突触传递。使用三组高频刺激（持续时间3秒，频率100 Hz，间隔20秒）在纹状体切片中诱导LTD23而用DHPG（50µM）孵育10分钟，在海马脑片中诱导mGluR-依赖性LTD24fEPSP斜率表示为LTD诱导前基线平均值的百分比。
细胞内记录
使用安装在固定显微镜上的x60浸水物镜（BX61-WI，Olympus，Center Valley，PA）对内侧前额叶锥体细胞进行照明和可视化，并使用电荷耦合设备摄像头（哈马松，Bridgewater，NJ）在视频监视器上显示图像。记录由多灯700B放大，并由Digidata 1440（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）数字化。使用电极拉拔器（P-97，Sutter Instruments，Navato，CA）从硼硅酸盐玻璃移液管（3–5 MΩ）中拉拔记录电极，根据特定的实验要求填充内部溶液，并将其修补到胞体上。Rs得到约70%的补偿，并在每次实验前重新调整。通过调节移液管偏移量来校正测量的液体连接电位。所有电压灯记录均在10 kHz下进行低通滤波，并在50 kHz下采样。
mEPSC的内溶液（单位：mM）：120甲烷磺酸铯、10 HEPES、10 EGTA、4 MgCl2、0.4 NaGTP、4 MgATP、10磷酸肌酸、5 QX-314（用CsOH将pH调节为7.3，290 mOsm）。将荷包牡丹碱50µM和河豚毒素（TTX）1µM（Tocris，Ellisville，MI）添加到外部ACSF浴溶液中。
mIPSC的内溶液（单位：mM）：140 CsCl，10 EGTA，10 HEPES，2 MgCl2，2.0 Mg-ATP，4 Na2-ATP，0.4 Na2-GTP，5 QX-314（用CsOH将pH调节为7.3，290 mOsm），因此产生约2 mV的氯离子电流的氯离子反转电位。向ACSF镀液中添加40µM 6,7-二硝基喹啉-2,3-二酮（DNQX）、50µM 2-氨基-5-戊酸磷酸（D-AP-5）和1µM TTX。
在这些条件下，将mEPSC和mIPSC分别记录在电压钳中，电压为−70 mV，测量时间为120秒或60秒。
树突棘形态
如前所述进行了树突状脊柱密度实验37,38简单地说，双光子成像是使用定制显微镜完成的，整个细胞的树突状片段的高分辨率堆栈（x=0.13µm，y=0.13μm，z=0.2µm/体素）在NeuronStudio中进行形态学分析。使用光线爆发算法计算脊柱头部体积。在体积测量之前，使用MATLAB（Mathworks）编写的自定义例程对图像进行去卷积。
