Nox4抑制剂GKT137831抑制缺氧诱导的肺血管细胞增殖

摘要

肺动脉高压（PH）是一种进展性疾病，与显著的发病率和死亡率相关。尽管最近的治疗进展提高了PH患者的生存率，但预后仍然很差(1). PH的病理生物学很复杂，导致内皮功能障碍的因素与发病机制有关(2,三). 在这些因素中，产生活性氧（ROS）的NADP减少（NADPH）氧化酶有助于多种血管疾病的发展，如动脉粥样硬化(4)和系统(5)和肺动脉高压(6). NADPH氧化酶催化分子氧还原生成超氧物（O₂^.−)、过氧化氢（H₂O（运行）₂)，或二次氧化剂(7). 描述了非吞噬细胞NADPH氧化酶催化部分的七种亚型（Nox1-5，Duox1-2）。这些亚单位与原型吞噬细胞NADPH氧化酶Nox2（或gp91）的催化部分同源^{凤凰（phox）})但在细胞定位、组织分布、调节、激活和表达方面彼此不同(7,8). 例如，尽管Nox1和Nox4都在血管平滑肌细胞（VSMC）中表达，但它们定位于离散的细胞内位置，在生长因子和血管损伤的反应中受到不同的调节，并通过不同的机制被激活(9)。

实验证据表明Nox4参与PH的发病机制。Nox4是最丰富的gp91^{凤凰（phox）}内皮细胞和血管平滑肌细胞中鉴定的同源物(4,7)，其表达与肺血管重塑有关(10)、血管收缩(11)和增强血管壁细胞的增殖(8). Nox4在慢性低氧暴露小鼠的肺动脉和特发性肺动脉高压（IPAH）患者的血管病变中选择性上调(10). 此外，慢性低氧暴露可选择性增加小鼠肺部Nox4的表达体内(12)和Nox4 RNA干扰减弱低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）增殖在体外(13). 慢性缺氧诱导的Nox4增加也与核转录因子、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、HPASMC和人肺动脉内皮细胞（HPAECs）的表达减少有关(12). PPARγ，一种重要的脂质和葡萄糖代谢调节因子(14)调节内皮细胞的生长和增殖(15)和SMC(16). 用合成配体罗格列酮激活PPARγ减轻低氧诱导的小鼠肺Nox4表达增加体内(12)和在HPAEC中(12)和HPASMC(13)体外试验。罗格列酮还可减轻慢性缺氧暴露小鼠的右心室肥厚（RVH）、PH或肺血管重塑(12)或老鼠(17,18). 总之，这些研究表明缺氧增加Nox4的表达和活性有助于PH的发病机制，抑制Nox4表达或活性的治疗策略可能对PH有治疗潜力。

直到最近，还没有具有高选择性、效力和生物利用度的特定药理学NADPH氧化酶抑制剂(19,20). 目前的研究使用了GKT137831，这是一种最近描述的吡唑并吡啶二酮衍生物，可抑制Nox4和Nox1(21)为了进一步研究Nox4在低氧诱导的肺血管细胞增殖和PH变化中的作用。GKT137831[2-（2-氯苯基）-4-[3-（二甲氨基）苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6（2H，5H）-二酮]是一种抑制Nox4和Nox1亚型（K_我100–150 nM），使用由异源过度表达特定Nox亚型的细胞制备的膜进行ROS生成的无细胞分析。在无细胞试验中，GKT137831是Nox2的弱抑制剂，并没有显著抑制中性粒细胞氧化爆发。GKT137831没有自由基清除或抗氧化活性，也没有表现出显著性在体外170种不同蛋白质的非靶向抑制，表明高Nox特异性(21,22)。

我们的研究结果表明，GKT137831可减弱低氧诱导的肺血管细胞增殖、TGF-β1表达和PPARγ的减少在体外和体内减弱低氧诱导的RVH和肺血管重塑。这些发现提供了新的证据，证明Nox4在低氧诱导的肺血管壁细胞改变中起着关键作用，并表明直接靶向Nox4是PH的可行治疗策略。

材料和方法

结果

GKT137831抑制缺氧诱导的HPAEC和HPASMC增殖体外试验

缺氧是一种有效的增殖刺激，可以通过Nox4介导的方式增强PASMC的增殖(13,24,25). 正如预期的那样，缺氧会增加HPAECs和HPASMC的增殖在体外(图1A和1B和E1A和E1B）。在最后24小时暴露期间，使用分级浓度的GKT137831进行治疗（“干预范式”图1A)正常毒性HPASMC中细胞增殖减弱，但对正常毒性HPAEC中细胞增殖无明显影响。低氧增加了HPASMC和HPAECs的增殖，通过20μM GKT137831的干预可使其减弱。同样，在常氧或缺氧暴露72小时期间服用GKT137831（“预防模式”图1B)在20μM浓度的常氧条件下，HPASMC增殖减弱，但对常氧HPAECs的增殖没有影响。在预防模式中，GKT137831在5和20μM时减弱低氧诱导的HPASMC和HPAEC增殖。测量PCNA表达或手动细胞计数的细胞增殖补充分析证实GKT137831减弱低氧诱导的肺血管细胞增殖（图E1A和E1B）。

在单独的窗口中打开

图1。

GKT137831抑制低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）和人肺动脉内皮细胞（HPAEC）增殖。HPAEC和HPASMC暴露于对照组（21%O₂)或缺氧（1%O₂)72小时。用载体或GKT137831（0.1–20μM）处理细胞最后24小时(A类)或整个72小时暴露(B类). 然后用MTT法测定增殖。每个酒吧代表平均值±SEM细胞增殖，表示为相对于对照样品的折叠变化(n个=3个HPAEC；n个=3个HPASMC）。^$P（P）<0.05与0-对照，⁺P（P）<0.01与0-对照*P（P）<0.001与0-对照，^#P（P）<0.05与0-缺氧，^##P（P）与0缺氧相比<0.01，以及^∧P（P）<0.001与0-缺氧。

Nox4 siRNA抑制低氧诱导的肺血管壁细胞增殖

为了更具体地证实Nox4在缺氧性肺血管细胞增殖中的作用，用Nox4 siRNA处理HPASMC和HPAECs。分级剂量的siNox4使Nox4蛋白水平降低50%，并以与GKT137831治疗后观察到的类似方式减弱低氧诱导的HPASMC及HPAEC增殖(图2A和2B)。

在单独的窗口中打开

图2。

Nox4 RNA干扰抑制低氧诱导的HPAEC和HPASMC增殖。用对照（−）或Nox4（+）siRNA转染选定的HPAEC和HPASMC，并传播96小时。(A类)对siNox4浓度进行滴定，以使目标蛋白表达降低50%。每个酒吧表示相对于对照样品表达的平均值±SEM Nox4蛋白(n个= 3). *P（P）<0.001与对照组。(B类)转染后，HPASMC和HPAECs暴露于常氧或缺氧条件下72小时，并通过MTT法测定增殖情况。每个酒吧代表平均值±SEM细胞增殖，表示为相对于正常毒性对照样品的折叠变化(n个=7 HPAEC；n个=3台HPASMC）*P（P）<0.001与（−）常氧；^#P（P）<0.001 vs.（−）缺氧。

GKT137831减轻缺氧诱导的H₂O（运行）₂HPAEC和HPASMC发电

H（H）₂O（运行）₂是Nox4激活的主要产物(26,27). 缺氧暴露增加H₂O（运行）₂肺血管壁细胞生成(三,13)和低氧诱导的HPASMC H增加₂O（运行）₂Nox4 siRNA抑制释放和增殖(13). 评估Nox4抑制对缺氧诱导的H₂O（运行）₂生成、分级浓度的GKT137831添加到HPAEC或HPASMC中，如图1。如所示图3A和3B、低氧诱导的HPAEC和HPASMC H₂O（运行）₂服用GKT137831以浓度依赖的方式减弱世代。GKT137831诱导的H减少₂O（运行）₂产量与Nox4蛋白水平的降低无关（数据未显示）。确认H₂O（运行）₂生成是GKT137831的关键靶点，聚乙二醇过氧化氢酶（PEG-CAT）被用作减少缺氧增加H的替代方法₂O（运行）₂水平。与Nox4 siRNA或GKT137831介导的低氧诱导HPASMC和HPAEC增殖抑制作用一致，PEG-CAT可抑制细胞增殖(图3C). 总之，这些研究证实了Nox4介导的H的重要性₂O（运行）₂肺血管壁细胞对缺氧的增殖反应。

在单独的窗口中打开

图3。

缺氧诱导的HPASMC和HPAEC H增加₂O（运行）₂GKT137831抑制了产物的产生，过氧化氢酶抑制了细胞增殖。HPAEC(A类)和HPASMC(B类)暴露于对照组（21%O₂)或缺氧（1%O₂)72小时。在最后24小时的暴露中，用载体或GKT137831（0.1、5或20μM）处理细胞。H（H）₂O（运行）₂产量通过Amplex红试验测定。每个酒吧代表H的平均±SEM浓度₂O（运行）₂表示为相对于对照样品的折叠变化(n个= 3). *P（P）<0.001与对照组相比；^#P（P）与缺氧相比，<0.05。(C类)在缺氧或常氧环境暴露的最后24小时内，用聚乙二醇过氧化氢酶（1000 U/ml）处理HPASMC和HPAECs，并用MTT法测量增殖。每个酒吧表示平均值±SEM增殖，表示为相对于常氧对照样品的折迭变化(n个=3个HPAEC；n个=5 HPASMC）*P（P）<0.01与常压；^#P（P）与缺氧相比，<0.05。

低氧诱导的HPAEC和HPASMC PPARγ表达减少通过GKT137831治疗而减弱

缺氧72小时后，HPAECs和HPASMC中PPARγ表达显著降低(图4A和4B). GKT137831，是否在缺氧暴露的最后24小时内服用(图4A)或在整个72小时缺氧暴露期间（图E2A），HPAEC PPARγ表达的缺氧减少减弱。同样，在过去24小时内服用GKT137831(图4B)或在缺氧暴露开始时（图E2B），HPASMC PPARγ表达的缺氧减少以剂量依赖性的方式减弱。为了进一步证实低氧诱导Nox4表达增加和PPARγ表达减少的相关性，如前所述，在从对照组或IPAH患者分离的肺动脉内皮细胞裂解物中检测这些靶点的表达(23). 在IPAH患者的肺动脉内皮细胞中，与对照组相比，Nox4 mRNA水平增加了近2.5倍，而PPARγmRNA水平显著降低(图4C和4D)。

在单独的窗口中打开

图4。

GKT137831治疗可减弱HPASMC和HPAECs过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ表达的低氧降低。HPAEC和HPASMC暴露于对照组（21%O₂)或缺氧（1%O₂)72小时。选定的HPAEC(A类)和HPASMC(B类)然后，在最后24小时的暴露期间，用载体或GKT137831（5–20μM）进行处理。然后收集细胞，分离蛋白质用于PPARγ和CDK4的蛋白质印迹分析。每个酒吧表示PPARγ带相对于CDK4的平均±SEM密度，表示为相对于对照值的折迭变化(n个= 4–6). *P（P）与对照组相比<0.05。(C类和D类)从对照组或特发性肺动脉高压（IPAH）患者的肺部分离出肺动脉内皮细胞。对已鉴定的Nox4裂解物进行实时定量PCR(C类)和PPARγ(D类). 每个酒吧代表相对于9S表达的Nox4和PPARγmRNA的平均±SEM(n个= 3). *P（P）与对照组相比<0.05。

GKT137831治疗在体内减轻慢性缺氧诱导的右心室肥大、肺血管重塑和增殖，但不增加RVSP

确定Nox4表达增强对缺氧诱导PH发展的贡献体内将C57Bl/6小鼠暴露于常氧或缺氧条件下3周，并在最后10天内给予GKT137831。因为我们之前已经证明，用PPARγ配体罗格列酮治疗可降低慢性低氧暴露小鼠肺部的Nox4表达，并减弱RVSP和RVH的增加(12)罗格列酮被列为治疗药物，用于比较目的。与我们之前的研究一致，慢性缺氧暴露小鼠RVSP和RVH显著增加(图5A和5B). 服用GKT137831（30或60 mg/kg/d）未能减轻低氧诱导的RVSP增加，但显著减轻了RVH。与此相反，罗格列酮治疗减轻了先前报道的肺Nox4表达、RVSP和RVH的缺氧增加(12). 如所示图6A和6BGKT137831（60 mg/kg/d）可减轻缺氧诱导的血管壁厚度增加。缺氧增加了肺中α-SMA阳性血管，但GKT137831和罗格列酮对这种增加均无显著影响(图6C). 相反，GKT137831（30或60 mg）和罗格列酮可减轻慢性缺氧诱导的增殖体内在小鼠肺部(图6D). 这些结果表明，所使用的GKT137831方案足以减少该模型中的增殖和血管壁厚度，但不足以减少α-SMA染色的小血管数量。

在单独的窗口中打开

图5。

GKT137831减弱了低氧诱导的右心室肥厚增加，但没有减弱右心室收缩压（RVSP）升高。小鼠暴露于缺氧（10%O₂)或常氧（对照，21%O₂)持续3周。在最后10天的暴露中，每天口服溶媒罗格列酮（Rosi，10 mg/kg/d）或GKT137831（GKT，30或60 mg/kg/d。(A类)通过将压力传感器推进右心室测量RVSP。每个酒吧表示平均RVSP±SEM，单位：mm Hg(n个= 4–8). *P（P）与常氧对照小鼠相比，<0.05；^#P（P）与正常毒性对照小鼠相比，<0.01。(B类)心脏被解剖成右心室、左心室加间隔。每个酒吧表示右心室重量与左心室加隔膜重量的平均±SEM比值(n个= 8). *P（P）与常氧对照小鼠相比<0.05；^#P（P）与低氧对照组小鼠相比，<0.05。

在单独的窗口中打开

图6。

GKT137831或罗格列酮减弱低氧诱导的血管重塑和增殖细胞核抗原表达体内小鼠暴露于缺氧（10%O₂)或常氧（21%O₂)持续3周。在最后10天的暴露中，每天口服溶媒对照（Veh）、罗格列酮（Rosi，10mg/kg/d）或GKT137831（GKT，30mg/kg/d或60mg/kg/d）。用α-SMA抗体对小鼠肺组织切片进行染色，并测量直径小于100μm的血管的血管壁厚度和血管密度。(A类)酒吧表示相对于常氧对照样品的平均±SEM血管壁厚度(n个= 3–4). ***P（P）<0.001与正常氧；^#P（P）<0.001与缺氧。(B类)展示了暴露于常氧或缺氧条件下的α-SMA染色血管的代表性显微照片，包括或不包括GKT137831。显示标记（C，对照；C+GKT，对照+GKT137831；H，缺氧；H+GKT，缺氧+GKT137831），以及比例尺每幅图像中=50μm。(C类)酒吧表示每毫米α-SMA染色血管的平均±SEM数²相对于常氧对照样品(n个= 3–4). **P（P）<0.01与常压车辆相比*P（P）<0.05与常压车辆相比。（GKT-30=GKT-300 mg/kg；GKT-60=GKT-60 mg/kg；Rosi=罗格列酮；Veh=载体）。(D类)分离全肺裂解物进行PCNA和CDK4的Western blot分析，以确定细胞增殖。每个酒吧表示PCNA条带相对于CDK4的平均±SEM密度，表示为相对于对照值的折迭变化(n个= 8). *P（P）与对照车辆相比<0.05；^#P（P）与低氧车辆相比，<0.05。

服用GKT137831或罗格列酮减轻缺氧诱导的PPARγ减少和TGF-β1表达增加在体内

因为缺氧降低了HPAECs和HPASMC中PPARγ的表达在体外对缺氧3周的动物肺进行PPARγ表达检测。慢性低氧暴露显著降低小鼠肺PPARγ表达(图7A). 服用GKT137831或罗格列酮减轻肺PPARγ表达的低氧降低(图7A). 转化生长因子（TGF）-β1有助于缺氧介导的Nox4表达和活性以及HPASMC增殖(24,28——30)和PPARγ配体已被证明调节肺中TGF-β1信号(31——33). 因此，我们研究了GKT137831抑制Nox4对低氧诱导的肺TGF-β1表达的影响。正如预期的那样，低氧增加了小鼠肺中TGF-β1的表达，而GKT137831或罗格列酮治疗可减弱低氧诱导的TGF-(图7B). 为了更好地定义Nox4、H之间的信号交互₂O（运行）₂，和TGF-β1，我们检测了GKT137831或PEG-CAT对缺氧增加TGF-β1的影响在体外低氧刺激TGF-β1表达(图7C). 在缺氧暴露的最后24小时内给予GKT137831或PEG-CAT可减弱TGF-β1表达的增加。这些结果表明Nox4-derived H₂O（运行）₂刺激TGF-β1增加和PPARγ表达减少。

在单独的窗口中打开

图7。

GKT137831或罗格列酮减轻PPARγ的低氧改变体内和TGF-β1体内和在体外动物暴露于缺氧（10%O₂)或常氧（21%O₂)持续3周。对照组（溶媒）、罗格列酮（罗西，10 mg/kg/d）或GKT137831（GKT，30或60 mg/kg/d。从全肺匀浆中制备蛋白质用于Western blot分析。每个酒吧表示PPARγ的平均±SEM密度(A类)或TGF-β1(B类)相对于CDK4的谱带表示为相对于对照样品的折叠变化(n个= 8). *P（P）<0.05，与正常对照肺相比；^#P（P）与缺氧车用肺相比，<0.05。(C类)HPAEC暴露于缺氧72小时，在过去24小时内给予或不给予GKT137831（20μM）或聚乙二醇（PEG）过氧化氢酶（1000 U/ml）。每个酒吧代表相对于对照样品的平均值±SEM TGF-β1 mRNA表达(n个= 3). *P（P）<0.01与（–）常氧**P（P）<0.001与（–）常氧；^#P（P）<0.01 vs.（–）缺氧。

讨论

Nox4是低氧诱导的肺循环紊乱的重要介导物，有助于PH的发展(10,12). 本研究的目的是进一步明确低氧诱导的Nox4改变对HPAEC和HPASMC增殖的作用，并探讨Nox4特异性抑制在调节PH发病相关增殖途径中的益处。我们的主要结论在体外研究表明，新型Nox4抑制剂GKT137831可减轻缺氧诱导的1)HPASMC和HPAEC增殖，2)H（H）₂O（运行）₂生成，三)TGF-β1表达，以及4)HPAEC和HPASMC中PPARγ水平的降低。我们的体内研究表明，GKT137831还可减弱慢性缺氧诱导的RVH、血管重塑、肺细胞增殖以及缺氧引起的肺PPARγ和TGF-β1表达的改变。

作为血管平滑肌细胞和内皮细胞中主要的Nox亚型，Nox4是PH治疗的一个有吸引力的靶点。然而，直到最近，还没有NADPH氧化酶的特定药理抑制剂。例如，二苯碘铵通常用作合成NADPH氧化酶抑制剂(34). 然而，二苯碘铵非特异性地抑制多种黄素蛋白脱氢酶的作用(35). 罗布麻素是另一种常用的NADPH氧化酶抑制剂，通过干扰p47和活性酶复合物的组装来抑制NADPH氧化酶(36). Apocynin在血管内皮细胞和平滑肌细胞中也起到抗氧化作用，血管内皮细胞与平滑肌细胞缺乏激活Apocyni所必需的髓过氧化物酶活性(37). 最近，吡唑并吡啶衍生物被报道以高效能和对Nox1和Nox4亚型的特异亲和力抑制NADPH氧化酶(38,39). 吡唑并吡啶衍生物GKT137831是一种一流的、有效的、经口生物利用的Nox4和Nox1抑制剂(21). GKT137831因其特异性抑制Nox4亚型的能力而被用于当前研究，该亚型已被证明在缺氧时选择性上调(10)与低氧诱导的HPASMC增殖有关(13,24)血管重塑和PH(10,12)。

目前的研究表明，Nox4可以靶向调节肺血管壁细胞的缺氧增殖。研究结果如所示图1,​,2,2、和​和3三证明减弱缺氧诱导H₂O（运行）₂使用Nox4 siRNA、GKT137831或PEG-CAT持续抑制增殖，强调Nox4衍生H的重要作用₂O（运行）₂肺血管壁细胞对缺氧的反应。Nox4-derived ROS通过成熟的途径促进细胞增殖，包括激活上游激酶（例如c-SRC、ERK 1/2、MAPK、Akt），增加促生长转录因子的表达和活性（例如c-福斯，c-jun，c-myc）和蛋白酪氨酸磷酸酶的失活(40,41). 如在线补充所示，检测低氧暴露的HPAEC或HPASMC凋亡或坏死的研究表明，低氧或GKT137831治疗均未显著改变这些条件下肺血管壁细胞的命运。

目前的研究结果和以前的报告表明，PPARγ是Nox4-derived H的重要靶点₂O（运行）₂也是Nox4表达的关键上游调控因子。例如，目前的研究和其他研究表明，缺氧显著降低肺中PPARγ的表达(17)以及在血管壁细胞中(12). 结合缺氧选择性上调肺部Nox4的证据(10)Nox4生成H₂O（运行）₂(26,27)和H₂O（运行）₂降低内皮细胞中PPARγ的表达(42)这些发现表明，Nox4-derived ROS介导低氧时PPARγ的降低。与此假设一致，GKT137831可减弱低氧诱导的PPARγ表达和HPAEC及HPASMC增殖的减少在体外在当前研究中。PPARγ缺失与SMC增殖、迁移和血管重塑相关(43). Nox4降低PPARγ的机制可能与H₂O（运行）₂–介导转录因子AP1的激活，负调节PPARγ(42). 此外，IPAH患者的肺血管组织显示PPARγ降低(15)Nox4表达增加(10). 目前的研究通过证明与对照组相比，从IPAH患者分离的肺动脉内皮细胞中PPARγmRNA水平降低，Nox4 mRNA水平升高来扩展这些发现(图4). 据我们所知，这些发现首次证明在IPAH的同一肺血管细胞室中Nox4和PPARγ的表达同时紊乱。这些结果为缺氧诱导的PPARγ和Nox4的改变与IPAH的病理生物学相关性提供了额外的证据。

一些证据表明，PPARγ表达的缺失会导致肺血管功能的显著改变。内皮细胞中PPARγ的靶向缺失(44)或平滑肌细胞(45)与PH的自发发展有关。在当前的研究中，慢性低氧暴露降低了小鼠肺中PPARγ的表达体内，并且这些PPARγ水平的降低被GKT137831给药抑制(图7A). 此外，GKT137831、罗格列酮或PEG-CAT可减轻TGF-β1水平的低氧升高(图7B和7C). 通过减弱Nox4衍生活性氧下游靶点的表达变化，如PPARγ或TGF-β1，GKT137831抑制Nox4提供了一种新的策略，可以减弱PH肺血管壁细胞的增殖反应。

另一方面，越来越多的证据表明PPARγ在调控Nox4表达中起着重要的上游作用。我们证明，合成PPARγ配体罗格列酮治疗可减轻缺氧性PH、RVH、肺血管重构，并增加缺氧性PH-小鼠模型中Nox4的表达(12). 其他人报告了PPARγ配体在其他PH模型中的类似治疗作用(12,17,18,46,47). PPARγ诱导抑制Nox4的分子机制部分源于PPARγ抑制NF-κB与Nox4启动子结合和激活的能力(13). 总之，这些发现表明PPARγ不仅调控Nox4的上游转录表达，而且调控Nox4-derived H₂O（运行）₂还调节PPARγ水平和功能。PPARγ和Nox4之间的这些关系在在线补充中进行了图解说明（图E3）。

因为PPARγ配体罗格列酮先前被证明可以减弱肺中Nox4表达和活性的缺氧增加，并减少RVH、PH和血管重塑(12)，我们在当前研究中使用罗格列酮臂进行比较。用GKT137831抑制Nox4可减轻慢性缺氧诱导的RVH，但不会增加RVSP(图5A和5B). 这些结果令人惊讶，因为我们曾预计RVH的衰减将通过肺血管阻力和RVSP的降低来介导。我们考虑了这些看似不一致的观察结果的两种潜在机制。

首先，先前对低氧诱导PH大鼠模型的研究描述了类似的情况，其中治疗干预减弱了低氧诱导的RVH增加，但由于持续性rho激酶介导的肺动脉血管收缩，RVSP没有降低(18). 我们的研究结果表明，缺氧导致肺血管重构，血管壁增厚小于100μm，α-SMA阳性血管数量增加。尽管我们研究中使用的GKT137831方案足以完全减弱观察到的血管壁增厚和细胞增殖标记物（PCNA），但它们并没有显著减弱α-SMA阳性血管数量的增加。综上所述，我们的研究结果表明，GKT137831对Nox4介导的活性氧的抑制作用可能足以克服有助于血管重塑和RVH的增殖信号，但不足以抵消促进持续缺氧血管收缩的完整氧化还原敏感信号通路。

观察到的GKT137831介导的RVH低氧增加减少（而非RVSP）的第二个潜在机制可能是GKT137.831对右心室的直接影响。活性氧有助于心脏肥大、致病性心室纤维化和重塑的发展(48). 例如，在实验性压力超负荷模型中，Nox4是主动脉缩窄导致心肌肥厚的重要介质(49). 然而，对于Nox4在RV功能障碍中的作用知之甚少。我们的研究结果表明，GKT137831可能抑制Nox介导的ROS在右心室的潜在肥大诱导作用。Nox4在PH右心室功能障碍中的潜在作用仍然是我们实验室积极研究的领域。

与PPARγ一样，我们的结果表明TGF-β1是Nox4信号的上游和下游。GKT137831或PEG-CAT抑制了低氧TGF-β1表达的增加，表明Nox4-derived ROS在低氧TGFβ1诱导中的作用。另一方面，TGF-β1是一种上游介质，在正常氧环境下刺激Nox4表达并促进HPASMC增殖(29)和缺氧(24)环境。通过防止PPARγ功能丧失，GKT137831可能保留PPARγ途径减弱Nox4表达和TGF-β1信号的能力。总之，我们的研究结果表明，用GKT137831抑制Nox4活性可以通过减少PPARγ、TGF-β1和其他介导缺氧增殖的途径的改变来减弱肺血管细胞增殖、血管重塑和缺氧反应的RVH。

由于活性氧可以调节生理和病理过程，未来的翻译研究应评估系统性Nox4抑制对细胞信号、分化和基因表达的潜在不利影响。GKT137831继续在糖尿病并发症（包括肾病和视网膜病）和心血管疾病方面进行实验研究，并于2010年被EMA和FDA授予孤儿药物地位，用于治疗特发性肺纤维化(50). 我们的研究结果强调了GKT137831在减弱PH增殖途径方面的潜在益处，并支持继续研究其作为治疗PH的口服生物可利用药物的用途。我们的研究结果还表明，在实验模型和从IPAH患者分离的内皮细胞中，Nox4和PPARγ表达的改变模式类似。这些发现突出了我们在体外发现并支持针对Nox4的治疗作为PH的新治疗方法的持续研究。未来的研究应确定GKT137831治疗剂量和持续时间是否可以优化，以提高其在PH管理中的安全性和疗效。

补充材料

致谢

脚注

工具书类