公共科学图书馆一号。2013; 8(1):e54146。
AAV视网膜下给药对新生小鼠视网膜的趋化作用及其在视网膜移植中的应用在体内发育性光受体障碍的抢救
,1,2,三,4 ,1,2,三 ,5 ,5 ,6和1,2,三,*
渡边佐治
1大阪大学蛋白质研究所分子与发育生物学实验室
2JST、CREST、Suita、大阪、日本
三日本大阪住田大阪生物科学研究所发育生物学系
4日本京都京都坂谷京都大学医学研究生院
Rikako Sanuki公司
1大阪大学蛋白质研究所分子与发育生物学实验室
2JST、CREST、Suita、大阪、日本
三日本大阪住田大阪生物科学研究所发育生物学系
上野信治
5日本爱知县名古屋昭和区名古屋大学医学研究生院眼科
小亚纯俊之(Toshiyuki Koyasu)
5日本爱知县名古屋昭和区名古屋大学医学研究生院眼科
长谷俊彦
6日本大阪茨城大阪大学超高压电子显微镜研究中心
高山武川(Takahisa Furukawa)
1大阪大学蛋白质研究所分子与发育生物学实验室
2JST、CREST、Suita、大阪、日本
三日本大阪住田大阪生物科学研究所发育生物学系
阿尔弗雷德·勒温,编辑器
1大阪大学蛋白质研究所分子与发育生物学实验室
2JST、CREST、Suita、大阪、日本
三日本大阪住田大阪生物科学研究所发育生物学系
4日本京都京都坂谷京都大学医学研究生院
5日本爱知县名古屋昭和区名古屋大学医学研究生院眼科
6日本大阪茨城大阪大学超高压电子显微镜研究中心
美国佛罗里达大学
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2012年7月14日收到;2012年12月6日验收。
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- 补充资料
GUID:F39B08E3-C776-4650-8CB1-D1EEF43E3AE0
摘要
背景
腺相关病毒(AAV)被公认为体内基因转移到哺乳动物视网膜。这种病毒不仅有望用于视网膜疾病的基因治疗,还有望用于体内视网膜基因的功能分析。以前的报告表明,AAV可以感染发育中的小鼠视网膜中的各种细胞类型。然而,尚未详细研究AAV在发育中视网膜的向性。
方法/主要发现
我们将7种AAV血清型(AAV2/1、2/2、2/5、2/8、2/9、2/10和2/11)的AAV-CAG-mCherry接种到P0小鼠视网膜下,并通过其在视网膜细胞中的感染程度定量评估每种血清型的倾向性。在出生后第0天(P0)小鼠视网膜下注射AAV后,不同类型的视网膜细胞被不同的AAV有效地转导。用AAV2/5高效转导感光细胞。AAV2/9能有效地转导视网膜细胞,但双极细胞和Müller胶质细胞除外。用AAV2/1、AAV2/2、AAV2/8、AAV2/9和AAV2/10有效地转导水平和/或神经节细胞。为了证实AAV介导的基因转移到P0小鼠视网膜的有效性,我们对锥杆同源盒基因敲除(Crx公司KO)小鼠,表现出外节段形成缺陷、平坦视网膜电图(ERG)反应和感光细胞退化。我们注射了一种表达Crx公司在Crx 2千字节新生儿促进剂Crx公司KO视网膜。我们发现AAV介导的Crx表达显著降低了Crx公司KO视网膜。
结论/意义
在目前的研究中,我们报告了合适的AAV向发育中的小鼠视网膜输送。通过在感光细胞中使用AAV2/5,我们证明了基因替换的可能性,以治疗由于缺乏Crx公司.
介绍
哺乳动物视网膜中表达的基因的功能分析对于理解人类视网膜发育和疾病的分子基础至关重要。利用微阵列和下一代测序技术对基因表达进行综合分析的最新进展使获得许多可能与视网膜发育和疾病相关的候选基因成为可能[1],[2].尽管体内使用转基因和/或敲除小鼠分析候选基因有助于揭示体内基因的功能,它仍然是昂贵的,耗时的,并且需要大量的技能。因此,一种快速方便的方法体内基因转移将有益于该领域。为了将基因导入小鼠视网膜,体内电穿孔和病毒介导的基因转移是目前最有效的方法。体内电穿孔是一种通过高压脉冲将质粒DNA并入视网膜组织的方法。这种方法可以有效地将DNA导入视杆感光细胞,但导入双极性、无长突和Müller胶质细胞的效率要低得多。此外,视锥感光细胞、水平细胞和神经节细胞几乎不能通过体内电穿孔[3]对于病毒介导的转导,逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)已被开发为视网膜基因转移的载体。特别是,AAV在视网膜基因转移方面具有许多优点,包括在非分裂细胞中的高效转导、长期转基因表达和低毒性。AAV是一种非致病性细小病毒,由衣壳蛋白覆盖的单链DNA组成。每个AAV血清型的衣壳结构不同,导致不同的嗜性和转导效率。目前已有12种血清型被用作体内基因转移(AAV2/1-AAV2/12)。根据发育阶段(新生儿或成人)的不同,AAV向包括视网膜在内的多个小鼠器官和组织的基因转导的取向不同[4],[5]先前对成年小鼠视网膜下注射AAV血清型向性的研究表明,视网膜色素上皮(RPE)细胞能有效地转导AAV2/1,RPE和感光细胞能有效转导AAV1/2、AAV2/5[6],[7],和AAV2/8[7]然而,尚未有详细的AAV向发育中的小鼠视网膜转导的研究报道。
在本研究中,我们通过视网膜下注射到P0小鼠视网膜中,检测了7种AAV血清型(AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV1/9、AAV2/10和AAV2/11)的向性。我们发现AAV可以将编码基因转导到发育中的小鼠视网膜的各种视网膜细胞类型中。此外,为了验证AAV介导的基因转移到发育中的小鼠视网膜中的有效性,我们对铬xKO小鼠。CRX是一种主要在感光细胞中表达的转录因子,对感光细胞成熟至关重要[8],[9],[10]。我们之前报告过Crx公司KO小鼠表现出完全缺乏外节形成,无暗视和明视视网膜电图(ERG),以及进行性光感受器变性[10]。我们的AAV介导的救援实验导致部分恢复了Crx公司KO视网膜。在人类中Crx公司与三种形式的视网膜变性相关,包括视锥和视杆营养不良(CORD)[11],[12],[13]、视网膜色素变性(RP)[13]和Leber先天性黑蒙(LCA)[13],[14]所有这些都会导致视力下降。因此,我们的结果也为基因治疗对人类视网膜发育障碍和退化的适用性提供了线索。
结果
七种AAV血清型对新生小鼠视网膜的趋化作用
为了检测AAV向视网膜下递送至P0小鼠视网膜的趋向性,我们生成了表达AAV2/1-、AAV2/2-、AAV1/5-、AAV2/8-、AAV2/9-、AAV/10-和AAV2/11的载体m樱桃色由无处不在的推广人驱动,CAG公司启动子(AAV-CAG-樱桃)(). 我们选择了六种血清型(AAV2/1、2/2、2/5、2/8、2/9、2/10),因为已知它们对哺乳动物中枢神经系统具有传染性(宾夕法尼亚大学基因治疗项目(http://www.med.upenn.edu/gtp网站/)),并且之前已经检查过视网膜下或玻璃体内转导到成年小鼠视网膜的取向性[6],[7],[15]由于最近发现了AAV2/11血清型[16],除了其他六种血清型外,我们还测试了该血清型。将七种被测AAV血清型中的每一种都注射到P0小鼠视网膜下。我们在注射后14天,即P14,当所有视网膜细胞完成生成时,采集注射的视网膜(). 我们观察到mCherry的表达均匀分布在注射了7种AAV-CAG-mCherri血清型的视网膜中(). 注射AAV2/5-和AAV2/9-的视网膜始终显示出强烈的mCherry信号,注射AAV2/2-、AAV2/8-和AAV1/10的视网膜显示出大量的mChery信号(). 用AAV2/1、AAV2/5、AAV2/9和AAV2/11有效转导光受体细胞(). 特别是,注射AAV2/5的视网膜显示mCherry主要在感光细胞中表达(). 注射AAV2/9的视网膜显示mCherry在整个视网膜中表达(). 用AAV2/1、AAV2/2、AAV2/8、AAV2/9和AAV2/10有效地转导水平细胞(). AAV2/1能有效转导Müller胶质细胞(). 此外,RPE在所有血清型中都得到了良好的转导().
七种AAV血清型在P0小鼠视网膜中的趋化性。(A) AAV-CAG-mCherry结构示意图。这种AAV在控制下驱动mCherry的普遍表达CAG公司发起人。(B) 在视网膜下注射PBS或七种血清型AAV-CAG-mCherry中的每一种后两周,在整个视网膜(感光细胞侧向上)中mCherri表达分布的荧光图像。(C–I)视网膜下注射AAV2/1-(C)、AAV2/2-(D)、AAV1/5-(E)、AAV2/8-(F)、AAV/9(G)、AAV2/10-(H)和AAV2/11-(I)、CAG-樱桃到P0小鼠视网膜两周后mCherry表达的荧光图像。比例尺表示1 mm(B)和50µm(C–I)。ITR:反向末端重复,RPE:视网膜色素上皮,ONL:外核层,INL:内核层,GCL:神经节细胞层。
七种AAV血清型的感染效率
为了定量评估七种AAV血清型在小鼠视网膜中的向性,我们测量了每种视网膜细胞类型的感染效率。感染效率由视网膜细胞特异性标记阳性细胞中表达mCherry的细胞百分比计算(). AAV2/1能有效地转导感光细胞和水平细胞(,杆:中部65.5±3.9%,锥:80.8±4.5%,水平:55.6±9.2%)。在7种血清型中,注射AAV2/1的视网膜对Müller胶质细胞的效率最高(, 47.9±5.8%). AAV2/2和AAV2/8的转导模式相似,水平细胞和神经节细胞主要以这些血清型转导(水平细胞分别为78.2±3.2%和76.6±12.2%;神经节细胞:分别为46.9±9.4%和40.7±0.1%)。AAV2/5对视杆细胞和视锥细胞的感染效率最高(,杆;中部和锥体84.5±10.3%;92.2±4.4%). AAV2/9能有效感染除双极细胞和Müller胶质细胞外的视网膜细胞,并且在7种血清型中,AAV2/9对水平细胞和神经节细胞的感染效率最高(,水平;92.7±0.6%与神经节;82.0±0.1%). AAV2/9在无长突细胞中的效率最高(为34.8±3.2%)。AAV 2/10有效靶向水平细胞和神经节细胞(水平细胞81.0±9.9%,神经节细胞72.1±0.1%)。AAV2/11在感光细胞中表现出高效感染(,杆:中部70.0±8.6%,锥:56.3±8.2%)。在所有分析的血清型中,双极细胞表现出极低的效率或未检测到感染().
每种视网膜细胞类型中七种AAV血清型的感染效率。(A) 感染效率量化方法示意图。视网膜下注射两周后,用视网膜细胞类型特异性标记物的抗体对视网膜进行免疫染色(Rod:RHODOPSIN(RHO),Cone:S-OPSIN,Horizontal:CALB1,Bipolar:CHX10,Amacrine:PAX6,Ganglion:BRN3B,Müller:S100β)。根据视网膜细胞类型,计算标记阳性细胞和标记/mCherry双阳性细胞的数量,以计算感染效率(三只不同小鼠的n=3)。计算视网膜中央区域的细胞数以计算视锥感光细胞、双极细胞和Müller胶质细胞的感染效率,计算视网膜中央、中部和外围区域的视杆感光细胞和无长突细胞的感染率。感染效率的计算公式如下:(B–H)AAV2/1-(B)、AAV2/2-(C)、AAV1/5-(D)、AAV2/8-(E)、AAV-9/(F)、AAV2/10-(G)和AAV2/11-(H)的感染效率,CAG-樱桃。误差条表示三个视网膜平均值的SD。ONH:视神经头。
禽流感病毒介导的救援实验Crx公司KO视网膜
为了验证AAV介导的基因转移到发育中的小鼠视网膜的有效性,我们进行了一项AAV介介导的拯救实验Crx公司KO小鼠。CRX是一种转录因子,通过光感受器基因的反式激活在光感受者成熟中起关键作用[1],[8],[9],[10]。我们生成了一个表达Flag-tagged的AAV2/5载体Crx公司cDNA在Crx 2千字节在光感受器细胞中驱动特异性表达的启动子(AAV2/5-Crx2kb-Flag-Crx=AAV Crx)[17],[18](). 我们在视网膜下注射AAV-CrxCrx公司KO视网膜在P0。要确认Crx标志在视网膜中表达,我们在注射后三周使用来自整个视网膜的RNA进行RT-qPCR分析。我们观察到Crx标志信使核糖核酸Crx公司AAV-Crx治疗KO视网膜(). 我们使用抗FLAG抗体通过免疫印迹法进一步分析了对照组和AAV-CRX治疗组视网膜中FLAG-CRX的表达。我们在经AAV治疗的病毒中检测到38kDa的FLAG-CRX带铬xKO视网膜裂解物(). 为了确定FLAG-CRX是否在感光细胞中表达,我们对对照组进行了免疫染色Crx公司KO和AAV-Crx注入Crx公司带有抗FLAG抗体的KO视网膜。在AAV-Crx治疗的患者中,FLAG信号主要在感光细胞中检测到Crx公司KO视网膜(). 在对照组和AAV-Crx治疗组的RPE和INL的血管中也检测到非特异性信号铬xKO视网膜。这很可能是由于RPE的自身荧光和血管中抗小鼠二级抗体对内源性小鼠抗体的反应(). AAV-Crx介导的FLAG-Crx表达在整个AAV-Crx-治疗的Crx公司KO视网膜().
基因表达分析Crx公司用AAV-Crx治疗KO视网膜。(A) AAV2/5-Crx2kb-Flag-Crx结构示意图。(B) 的表达式分析Crx公司使用从对照组和AAV处理的RNA进行RT-qPCRCrx公司KO视网膜(对照Crx公司KO视网膜:来自三只不同小鼠和AAV治疗的n=3Crx公司KO视网膜:来自四只不同小鼠的n=4)。(C) 对照组和AAV处理组FLAG-CRX的Western blot分析Crx公司分别来自三只不同小鼠的KO视网膜。用抗FLAG抗体检测FLAG-CRX。使用ACTB(β-肌动蛋白)作为负载对照。(D–F)免疫染色Crx公司使用抗FLAG抗体用AAV-Crx或PBS治疗KO视网膜。FLAG-CRX在对照组和AAV-CRX处理组中的表达分布Crx公司KO视网膜(E,F)。中白色方框(a-c和d-f)中的放大图像分别是。比例尺表示50µm(D)和1 mm(E,F)。(G–Q)治疗三周后11个与人类视网膜疾病相关的基因的表达分析(对照组Crx公司KO视网膜:来自三只不同小鼠和AAV治疗的n=3Crx公司KO视网膜:四只不同小鼠的n=4)。视紫红质(G) ,格纳特1(H) ,S-视蛋白(一) ,M-视蛋白(J) ,Pde6克(K) ,Slc24a1系列(五十) ,第12路(M) ,第1页(N) ,编号(O) ,电缆4(P) 、和Fscn2号机组(Q) ●●●●。对照视网膜注射PBS(载体)。卢比4用于归一化。qPCR引物列于表S1误差条表示三个对照视网膜和四个治疗视网膜的平均值。**
第页<0.01,*
第页<0.05. ITR:反向末端重复,RPE:视网膜色素上皮,ONL:外核层,INL:内核层,GCL:神经节细胞层。
的表达式分析Crx公司KO视网膜使用微阵列确定了一些在视网膜中下调的光感受器基因Crx公司KO视网膜参与光传导、睫状体功能、感光基因转录调控和突触发育[10],[19]在人类中,某些基因同源物的突变会导致视网膜疾病,包括视网膜退化、色盲和夜盲(RetNet:https://sph.uth.tmc.edu/retnet/). 这些基因的下调可能是Crx公司KO视网膜。因此,我们对光感受器基因的表达进行了分析,这些基因在Crx公司AAV-Crx治疗的KO视网膜及其与人类视网膜疾病的关系Crx公司KO视网膜。我们对以下11个基因进行了RT-qPCR分析:视紫红质(光转导、RP和先天性静止性夜盲症(CSNB)),Gnat1型(光转导,CSNB),S-视蛋白,M-视蛋白(光传导、色盲),Pde6克(光转导,RP),Slc24a1系列(光转导,CSNB),Rdh12型(视觉周期、LCA和RP),第1页(睫状体功能、LCA和CORD),编号(转录调节,RP),电缆4(突触功能,CSNB,LCA),以及Fscn2号机组(细胞骨架调节、RP和黄斑营养不良)。在AAV中-Crx公司-处理过的Crx公司KO视网膜,我们观察到S-视蛋白,M-视蛋白、和Fscn2号机组()并适度上调视紫红质,格纳特1,Pde6克,Slc24a1系列,第12路,第1页,编号、和电缆4().
免疫组织化学Crx公司AAV-Crx治疗KO视网膜
我们进一步分析了RHODOPSIN、GNAT1、S-OPSIN和M-OPSIN在AAV-Crx治疗组中的表达Crx公司KO视网膜免疫染色。注射AAV-Crx后RHODOPSIN蛋白水平略有增加Crx公司KO视网膜()而GNAT1信号显著增加(). 同样,S-OPSIN和M-OPSIN信号显著增加(). 与中所示的RT-qPCR分析结果一致,AAV-Crx处理后这些分子的水平也增加Crx公司KO视网膜。此外,GNAT1、S-OPSIN和M-OPSIN信号似乎定位于注射AAV-Crx的外节段Crx公司KO视网膜(). RHODOPSIN和GNAT1定位于杆外段,S-OPSIN与M-OPSIN定位于锥体外段。这个Crx公司KO视网膜缺乏外段形成[10],[20]免疫组化数据表明Crx公司通过视网膜下注射AAV-Crx,KO视网膜部分恢复Crx公司KO视网膜。
组织学分析Crx公司用AAV-Crx转导KO视网膜。(A–P)免疫染色Crx公司用杆感光细胞(A-H)和锥感光细胞的外节段标记物(I-P)治疗AAV-Crx三周后KO视网膜。比例尺表示20µm(A–P)。(Q-S)AAV-Crx治疗15周后视网膜的透射电镜分析。(Q和R)在对照视网膜中,未观察到感光细胞(Q)。在AAV-Crx治疗的视网膜中,观察到一些外节结构(R)。(S) AAV-Crx治疗视网膜外节的放大图像。箭头表示包含椎间盘片的外节。比例尺表示7.5微米(Q和R)和5微米(S)。RPE:视网膜色素上皮,ONL:外核层,OPL:外丛状层,INL:内核层,GCL:神经节细胞层。OS:外段,IS:内段。
我们进一步检查了对照组外节段的形态Crx公司KO和AAV-Crx注入Crx公司AAV治疗后15周通过透射电镜详细观察KO视网膜(). 我们在对照视网膜中没有观察到感光细胞,因为在视网膜中感光细胞严重退化Crx公司KO视网膜(). 相反,在注射AAV-Crx的患者中观察到含有椎间盘的外节段Crx公司KO视网膜(). 这些数据表明,AAV-Crx的视网膜下递送进入P0Crx公司KO视网膜部分恢复了Crx公司KO小鼠。
视网膜功能的改善Crx公司AAV-Crx治疗KO视网膜
为了评估AAV-Crx注射对视网膜功能的影响,我们进行了视网膜电图(ERG)记录。Crx公司KO小鼠在P30表现出平坦的暗视和明视ERG反应,这是由于外节的形成缺陷和细胞内光导分子的大量丢失所致Crx公司KO小鼠[10]在AAV治疗后6周和15周,我们测量了三只对照眼和三只AAV-Crx治疗眼的ERG反应。用于ERG记录的小鼠是在两个时间点之间独立准备的。我们首先试图以传统方式记录AAV治疗小鼠眼睛的暗区ERG反应[21],[22],但未检测到阳性反应。因此,我们随后用100次1.0 log cd-s/m频闪测量了明视ERG响应2在这些条件下获得的ERG响应主要反映锥体光感受器功能。与我们之前的观察一致[10],所有对照眼在AAV治疗后6周和15周均表现出完全平坦的反应(顶部,). 相反,在AAV治疗后6周和15周,三只接受AAV-Crx治疗的眼睛中有两只出现了明显的明视a波和b波(底部,). 经AAV-Crx处理的其中一种Crx公司KO小鼠没有表现出可检测的ERG感光反应。尽管这只小鼠的眼睛广泛表达FLAG-CRX,但它的眼睛比其他两只小鼠的眼睛小得多,并且在组织学上受到严重损伤(数据未显示),可能是由于视网膜下注射损伤导致的生理功能障碍。这一结果表明,视网膜下注射AAV-CrxCrx公司KO视网膜部分恢复了铬xKO感光细胞。
功能和形态的恢复Crx公司用AAV-Crx治疗KO视网膜。(A) AAV-Crx治疗后第6周和第15周记录的代表性ERG。ERG响应平均值为100 1.0 log cd-s/m2刺激。用于ERG记录的小鼠是在两个时间点之间独立准备的。在AAV治疗后的第六周和第十五周,来自不同小鼠的所有三只对照眼均无ERG反应,而来自不同老鼠的三只治疗眼中有两只表现出显著反应。(B) AAV-CRX治疗后15周视网膜FLAG-CRX免疫染色。(C和D)活性蛋白酶-3和FLAG-CRX的免疫染色Crx公司AAV-Crx治疗三周后KO视网膜(C)。三种不同小鼠和AAV治疗后的活性半胱氨酸-3-阳性细胞(D,对照视网膜:n=3Crx公司KO视网膜:四只不同小鼠的n=4)。箭头表示活性天冬氨酸酶-3阳性细胞。比例尺代表50µm。误差条表示三个对照视网膜和四个治疗视网膜的平均值。*
第页<0.05. RPE:视网膜色素上皮,ONL:外核层,INL:内核层,GCL:神经节细胞层。
表1
对照组和AAV-Crx治疗组眼ERG振幅的定量分析。
| a波振幅 | b波振幅 |
对照眼(6周) | | |
1 | 0 | 0 |
2 | 0 | 0 |
三 | 0 | 0 |
AAV治疗眼(6周) | | |
1 | 4.3 | 9 |
2 | 1.4 | 12.1 |
三 | 0 | 0 |
对照眼(15周) | | |
1 | 0 | 0 |
2 | 0 | 0 |
三 | 0 | 0 |
AAV治疗眼(15周) | | |
1 | 4 | 13 |
2 | 3.4 | 11 |
三 | 0 | 0 |
进行性光感受器变性也见于Crx公司KO小鼠[10]。我们通过使用抗FLAG抗体进行免疫染色,检测了AAV治疗后15周视网膜中的光感受器变性(). 尽管在对照组和AAV-Crx治疗组中都有大量感光细胞死亡Crx公司KO视网膜,AAV-Crx治疗Crx公司KO视网膜的外核层比对照视网膜的外核层厚(顶部面板)。值得注意的是,经AAV-Crx处理的大多数存活感光细胞Crx公司KO视网膜表达FLAG-CRX(底部面板)。该观察结果表明,不表达FLAG-CRX的光感受器细胞死亡,AAV-CRX抑制了Crx公司KO视网膜。为了证实这一结果,我们在AAV治疗三周后,用抗活性天冬氨酸酶-3抗体(一种凋亡标记物)进行了免疫染色(). 我们观察到AAV-Crx治疗后凋亡细胞数量显著减少Crx公司KO视网膜(). 这些结果表明,视网膜下注射AAV-Crx在一定程度上可以防止视网膜光感受器细胞死亡Crx公司KO视网膜。
讨论
本研究的主要目的是建立一种将AAV介导的视网膜基因转移到发育中视网膜的方法,用于体内分析视网膜基因并将该方法应用于视网膜变性的抢救。通过将AAV-CAG-mCherry转导到发育中的小鼠视网膜,我们发现不同类型的视网膜细胞在七种血清型AAV中的转导不同。我们定量分析了这些AAV血清型的感染效率。此外,我们证明了AAV转导到发育中的小鼠视网膜对挽救视网膜变性的有效性Crx公司KO小鼠。这些结果将对执行体内使用AAV分析视网膜基因。
我们在P0小鼠视网膜下注射7种血清型AAV。我们选择P0,因为这个阶段的视网膜仍在发育中,可以通过视网膜下注射进行手术治疗。血清型AAV2/5和AAV2/9表现出显著而有效的感染。用AAV2/5选择性高效地转导感光细胞。AAV2/9能有效地转导视网膜细胞(Müller胶质细胞和双极细胞除外)。我们观察到AAV2/1、AAV2/2、AAV2/8、AAV2/9和AAV2/10有效地转导到水平和/或神经节细胞。这些数据表明体内通过将AAV视网膜下注射到小鼠视网膜中进行基因转移,使我们能够分析难以或不可能被转导的视网膜细胞类型中的基因功能体内电穿孔(视锥细胞、水平细胞和神经节细胞)[3]为了对视网膜中的特定细胞类型进行专门分析,未来需要为每种细胞类型开发长度相对较短的细胞类型特异性启动子。
在当前的研究中,尽管AAV2/1有效地靶向Müller胶质细胞,但在所有测试血清型中,AAV对双极性和Müler胶质细胞的感染效率均较低。这两种视网膜细胞在发育的最新阶段进行分化[21]相反,在胚胎期或出生后早期产生的视网膜细胞(感光细胞、水平细胞、无长突细胞和神经节细胞)被转导给所有分析的血清型。这些结果表明,本研究中检测的AAV血清型对分化的视网膜细胞的感染性高于对视网膜祖细胞或分化细胞的感染。自100多种AAV血清型被分离以来[22]未来可能会发现能够有效感染双极性和米勒胶质细胞的AAV血清型。我们在当前研究中观察到AAV在发育中视网膜的向性,这可能会扩大AAV在体内对视网膜细胞类型的转导,如锥状光感受器、水平细胞和神经节细胞,这些细胞几乎不通过体内电穿孔。本研究中显示的AAV向性与之前报告中成年小鼠视网膜的不同。在视网膜下转导到成人视网膜中,AAV2/1主要靶向RPE细胞,AAV2/2、2/5和2/8主要靶向视网膜色素上皮细胞和感光细胞[6],[7]然而,根据我们使用P0小鼠的结果,每个AAV血清型都针对几种视网膜细胞类型。该观察结果与Surace报告的结果一致等.[5]其中,他们显示了AAV2/1-、2/2-和2/5-CMV-EGFP转导到胎儿、新生儿和成人视网膜的取向差异。有两种可能的解释可以解释AAV在发育期视网膜和成熟期视网膜之间的向性转变。首先,宿主视网膜细胞中AAV受体的表达或丰度可能在视网膜发育过程中发生变化。第二,由于P0视网膜的较小尺寸和视网膜发育过程中的动态细胞迁移,注射的病毒颗粒可能更容易扩散到视网膜。新生小鼠和成年小鼠在主动脉、肝脏和肾脏中也观察到AAV嗜性的差异[4]这表明AAV载体在发育过程中的转导时间点对于适当地将基因转移到感兴趣的细胞类型非常重要。
我们附上了Crx 2千字节AAV载体的启动子,用于Crx公司KO视网膜。我们以前曾报道过该启动子在发育成熟的视杆细胞和视锥细胞中指导特异性基因表达[17],[18]RT-qPCR和免疫组织化学的表达分析显示,两种杆状特异性基因的表达均有改善(视紫红质和格纳特1)和共同特异性基因(S-视蛋白和M-视蛋白)AAV-Crx处理Crx公司KO视网膜(和). 这表明Crx 2千字节发起人成功推动铬x在视杆细胞和视锥细胞中均有表达。因此Crx 2千字节该启动子可与AAV一起用于驱动光感受器细胞中的特异性表达。
AAV-Crx适度但显著改善了明视ERG反应,但我们无法检测到AAV治疗眼的暗视ERG响应。为了检测AAV-Crx治疗后相对较弱的ERG反应Crx公司KO眼睛,我们用100次频闪刺激小鼠眼睛(1.0 log cd-s/m2). 然而,在这些条件下,很难测量暗视ERG反应,因为间歇重复闪烁的灯光会消除暗视ERG记录所必需的暗适应。由于这些技术困难,我们在目前的研究中实际上无法测量暗视ERG反应。AAV-Crx还部分恢复了Crx公司KO小鼠。这一结果不仅证实了AAV转导到P0视网膜是一种有效的治疗方法体内视网膜基因转移同时也提示基因治疗对人类视网膜疾病造成的影响Crx公司突变是可能的。此外,这是关于AAV介导的对一种调节光感受器发育的转录因子突变的小鼠进行拯救的第一份报告,该转录因子突变与人类光感受者退化有关。编号,编号2e3、和其他2通过感光基因的转录调控,在感光细胞发育中也起着关键作用[1],[23],[24],[25]人类中这些基因的突变与几种类型的视网膜变性有关(RetNet:https://sph.uth.tmc.edu/retnet/home.htm). 我们目前的结果表明,由这些转录因子突变引起的人类视网膜退化可以通过AAV介导的基因治疗恢复。这种可能性将在未来通过AAV介导的对具有这些基因突变的小鼠的拯救来检验。
材料和方法
动物
用于评估AAV的向性体内,我们使用ICR小鼠(Charles River)。这个Crx公司KO小鼠是按照我们之前的研究中的描述生成的[10]所有程序均符合ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明,且这些程序已获得重组DNA实验机构安全委员会和大阪生物科学研究所动物研究委员会(批准号10-401)和蛋白质研究所的批准,大阪大学(批准号24-05-0)。老鼠被关在一个温度控制的房间里,光/暗周期为12小时。任何时候都有淡水和啮齿动物的饮食。
质粒结构
为了生产AAV-CAG-mCherry和AAV2/5-Crx2kb-Flag-Crx,我们构建了pAAV-CAG-樱桃和pAAV-Crx2kb-Flag-Crx病毒分别是。这个CAG公司本研究中使用的启动子先前已有描述[26].生产pAAV-CAG-樱桃,我们最初建造pCAGGS-樱桃.我们切pAAV-U6-shLhx2-CMV-m樱桃色
[27]具有NheI公司和不是我并插入m樱桃色分成碎片pCAGGS公司消化的限制酶和不是我使用NheI公司/限制酶链接器。最后,为了生产pAAV-CAG-樱桃,我们获得了CAG-樱桃切割碎片pCAGGS mCherry公司具有SalI公司和BglII公司,并将其片段插入pAAV-IRES-hrGFP病毒(安捷伦科技)不是我和BglII公司使用不是我/SalI公司链接器DNA。生产pAAV-Crx2kb-Flag-Crx病毒,我们最初建造pCRX(2K)-标志Crx-βgal
[17]. The标志-房屋Crx碎片是通过切割获得的pcDNA3-Flag-Crx公司
[28]具有XhoI公司和XbaI公司。我们将其插入pCRX(2K)-β加仑用…消化肯尼亚卢比和NheI公司使用XhoI公司/SalI公司连接器DNA并获得pCRX(2K)-标记Crx-βgal.我们接下来建造pCRII-钝化-Crx2kb-Flag-Crx。我们首先获得了Crx2kb-Flag-Crx公司切割碎片pCRX(2K)-标记Crx-βgal具有SalI公司和XhoI公司。我们将其插入pCRII-钝t用…消化XhoI公司,并获得pCRII-钝化-Crx2kb-Flag-Crx最后,生产pAAV-Crx2kb-Flag-Crx病毒,我们切pCRII-钝化I-Crx2kb-滞后-Crx具有不是我和XhoI公司,并使用不是我/BglII型链接到pAAV-IRES-hrGFP病毒(安捷伦科技)不是我和BglII公司.
AAV生产
AAV通过AAV载体质粒、腺病毒辅助质粒和AAV辅助质粒的三重转染产生(pAAV2/1型,pAAV-RC病毒[安捷伦科技],pXR5型,pAAV2/8型,pAAV2/9型,pAAV2/rh10型、和第2页,共11页)通过磷酸钙法将其导入AAV-293细胞。转染72小时后收集细胞,并通过四个冻融循环进行裂解。通过离心收集上清液,并用苯甲酸酶核酸酶(Novagen)处理,以消除细胞DNA/RNA和多余的质粒DNA。这种病毒制剂用于视网膜下给药。使用SYBR GreenER Q-PCR Super Mix(Invitrogen)和Thermal Cycler Dice Real Time System Single MRQ TP870(Takara)通过qPCR测定每个AAV的滴度(在载体基因组(VG)/mL中)。AAV滴定所用的引物列于表S1.本研究中使用的所有血清型AAV-CAG-樱桃的滴度调整为约2×1012VG/mLCrx公司KO救援实验为2.6×1012VG/毫升。
视网膜下注射
如别处所述进行视网膜下注射AAV[3],[29]将P0小鼠置于冰上冷冻麻醉,沿着融合的连接上皮切开眼睛,两个眼睑在此处汇合,并用30号针头在角膜连接处附近的巩膜上做一个小切口。在解剖显微镜下,使用Ito微型注射器(Ito Corporation)和33 gauge钝头针头,通过切口将0.4µL AAV制剂注入视网膜下间隙。将最终浓度为0.1%的固绿染料添加到AAV制剂中作为示踪剂,以确认AAV制剂已注射到视网膜下间隙[29]对于组织学分析,我们只使用了AAV制剂中的染料被证实均匀分布的视网膜,并且没有因注射过程而引起的严重损伤。
免疫染色
对于免疫组织化学,将14µm厚的视网膜切片在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗两次,并用0.1%Triton X-100(wt/vol)在PBS中渗透,然后用含有4%驴血清(vol/vol)的PBS孵育1小时以封闭样品。样品在4°C下与一级抗体孵育过夜。用PBS清洗后,将这些样品与次级抗体在25°C下孵育1小时。在本研究中,我们还使用了以下主要抗体:抗RHODOPSIN抗体(1∶10000,O4886,Sigma)作为视杆细胞标记,抗S-OPSIN(1∶500,sc-14363,Santa Cruz)作为视锥细胞标记,抗CALB1抗体(1:1000,PC253L,Sigma1)作为水平细胞标记,抗CHX10抗体(1∶200,MBL)作为双极细胞标记,抗PAX6抗体(1∶100,DSHB)作为无长突细胞标记,抗BRN3B抗体(1∶100,sc-6026,Santa Cruz)作为神经节细胞标记,抗S100β抗体(1∶100,S-2532,Sigma)作为Müller神经胶质细胞标记,抗GNAT1抗体(1∶3000,sc-389,Santa Cruz),抗M-OPSIN抗体(1:500,AB5402,Chemicon)和抗FLAG抗体(1:1000,F1804,Sigma)。还使用了以下二级抗体:Alexa Fluor 488-结合抗鼠IgG(1∶300,A11001,Invitrogen)、Alexa Fluor 488结合抗兔IgG,和Cy3-结合抗兔IgG(1∶300,705-165-147,Jackson)。为了对整个视网膜进行免疫染色,将每个视网膜从巩膜上轻轻剥离,用PBS冲洗,并用4%多聚甲醛(wt/vol)在PBS中固定1.5小时。视网膜通过在0.1%Triton X-100在PBS(PBST)中孵育30分钟来渗透。在PBST中清洗后,用4%驴血清在PBST内封闭样品1小时。然后在4℃下过夜,用抗mCherry的一级抗体(1∶1000,632496,Clontech)对视网膜进行免疫染色。在PBST中洗涤后,在4°C下与Cy3-结合的抗兔IgG二级抗体反应过夜。
感染效率的量化
AAV-CAG-m樱桃注射的视网膜与上述每个视网膜细胞的细胞类型特异性标记物和抗m樱桃抗体共同免疫染色。我们根据细胞类型计算标记阳性细胞数和标记/mCherry双阳性细胞数,以计算感染效率。我们使用LSM 700(蔡司,20×或40×物镜)沿z轴(2.0µm)拍摄的视网膜切片的高分辨率共焦图像来计算细胞数量,并测量杆和锥感光细胞、双极细胞、米勒胶质细胞和无长突细胞的感染效率。由于共焦图像(20×)中的水平细胞和神经节细胞数量较少(<10个细胞),与其他细胞类型相比,很难准确计算这些细胞类型的感染效率。因此,我们计算了通过荧光显微镜看到的整个细胞数,以计算这些细胞类型的感染效率。我们使用三只不同小鼠的三只视网膜,计数了100-200个视杆感光细胞和无长突细胞标记阳性细胞,30-45个视锥感光细胞标记阳性电池,30-100个水平和神经节细胞标记阳性的细胞,40-140个双极细胞标记阳性电子,以及30-60个Müller胶质细胞标记阳性细胞,用于测量每种视网膜细胞类型的感染效率。为了表明AAV感染扩散到整个视网膜,计算了杆感光细胞在三个区域的感染效率,即未受注射损伤侧视神经头的中央、中部和外围区域。计算中心区域锥体感光细胞、双极细胞、无长突细胞和Müller胶质细胞的感染效率。计算水平细胞和神经节细胞在注射未损伤侧视网膜的感染效率。
蛋白质印迹分析
如前所述进行Western blot分析[27]将膜与抗FLAG抗体(1∶1000,F1804,Sigma)孵育。然后将膜与辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgG抗体(1∶10000,Zymed)孵育。为了进行二次免疫反应,PVDF膜与WB剥离液(Nacalai-Tesque)孵育以去除抗体,然后在TBS中用5%脱脂牛奶(wt/vol)再次封闭。使用抗β-肌动蛋白的小鼠抗体(ACTB,1∶5000,Sigma)进行进一步免疫印迹。
RT-qPCR
注射后3周采集并解剖小鼠视网膜。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从视网膜中分离出总RNA(1µg),并使用Superscript II逆转录酶(Invit罗gen)将其转化为cDNA。根据制造商的说明,使用SYBR GreenER Q-PCR Super Mix(Invitrogen)和Thermal Cycler Dice Real time System Single MRQ TP870(Takara)进行实时PCR。量化由Thermal Cycler Dice Real Time System软件2.0版(Takara)进行。用于qPCR的引物序列列于表S1.
ERG记录
用肌肉注射80 mg/kg氯胺酮和16 mg/kg甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉。用0.5%托吡卡胺和0.5%盐酸苯肾上腺素局部扩张瞳孔,并在ERG记录期间将小鼠置于加热垫上。用1%丁卡因麻醉的角膜上的金丝环记录ERG。将金丝电极放置在距颞缘1mm的巩膜上作为参考电极。将小鼠置于Ganzfeld碗中,100个1.0 log cd-s/m的频闪刺激2(PS33 Plus;Grass Telefactor)以1秒的重复率平均记录ERG。信号在1至1000 Hz之间进行放大和带通滤波(澳大利亚Castle Hill电力实验室;AD仪器)。a波和b波的振幅通过明视ERG反应进行量化。
透射电子显微镜
以以下方式制备用于透射电子显微镜的样品。麻醉小鼠的眼睛被摘除。去除眼前节后,用2%戊二醛和2%多聚甲醛将每个后眼杯固定在pH值为7.4的二甲氨基甲酸缓冲液中。在用1%四氧化锇固定90分钟后,通过分级系列的乙醇(50%–100%)和正丁基缩水甘油醚对视网膜进行脱水。最后,将其嵌入环氧树脂中。在超薄切片机上切割超薄切片(Ultracut E,Reichert-Jung,Vienna,Austria),并用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。通过透射电子显微镜观察视网膜(1200EX,JEOL,日本)。
统计分析
采用Student t检验计算统计显著性。值为第页<0.05具有统计学意义。数据以平均值±SD表示。
致谢
我们感谢J.JohnstonpAAV2/1型,pXR5型,pAAV2/8型,pAAV2/9型、和pAAV2/rh10型向量和S.Mori表示第2页,共11页矢量。我们感谢Y.Chérrase在生产AAV方面提供的帮助。我们感谢Y.Omori、A.Onishi、Y.Muranishi、T.Chaya和S.Irie的评论和技术建议,以及A.Tani、M.Kadowaki、A.Ishimaru、H.Tsujii、Y.Saioka、H.Abe和S.Kennedy的技术援助。
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