国家生物技术。作者手稿；PMC 2013年7月1日提供。
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用于疾病多重泌尿监测的质谱合成生物标记物
,1,2 ,1,2,三 ,1,4 ,1 ,1 ,2,5 ,6 ,6 ,1,2 ,6 ,6,7和1,2,8,9,10
加布里埃尔·A·广
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
杰弗里·冯·马尔扎恩
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
Gayathree Murugappan公司
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
4美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
奥马尔·阿布达耶
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
史蒂文·莫
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
Ioannis A.Papayannopoulos公司
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
5美国马萨诸塞州麻省理工学院斯旺森生物技术中心
迪安娜·斯维尔德洛夫
6美国马萨诸塞州波士顿市贝斯以色列女执事医学中心和哈佛医学院胃肠病和肝病科
苏珊·B·刘
6美国马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院胃肠病和肝病科
安德鲁·沃伦
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州剑桥市，美国
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
尤里·波波夫
6美国马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院胃肠病和肝病科
Detlef Schuppan酒店
6美国马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院胃肠病和肝病科
7德国美因茨美因茨大学医学院医学一系分子和转化医学部
Sangeeta N.Bhatia公司
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
8美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院电气工程与计算机科学
9美国马萨诸塞州波士顿市百翰女子医院和哈佛医学院医学部
10美国马里兰州雪佛兰大通霍华德·休斯医学院
1哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术学院，马萨诸塞州坎布里奇，美国
2美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
4美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
5美国马萨诸塞州麻省理工学院斯旺森生物技术中心
6美国马萨诸塞州波士顿贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院胃肠病和肝病科
7德国美因茨美因茨大学医学院医学一系分子和转化医学部
8美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院电气工程与计算机科学
9美国马萨诸塞州波士顿市百翰女子医院和哈佛医学院医学部
10美国马里兰州雪佛兰大通霍华德·休斯医学院
三当前地址：VentureLabs，The Flagship Innovation Factory，Cambridge，MA，USA。
- 补充资料
1
GUID:23EF645A-7127-4853-9C7E-10B4AC635BDE
摘要
生物标记物在复杂疾病的临床管理中越来越重要，但由于我们对内源性分子的依赖，我们发现新生物标记物的能力仍然受到限制。在这里，我们描述了外源给药的“合成生物标志物”的开发，该生物标志物由与纳米颗粒结合的质量编码肽组成，利用人类疾病和生理学的内在特征进行无创尿液监测。这些蛋白酶敏感剂具有三种功能体内：疾病的靶点，对失调的蛋白酶活性进行采样，并向宿主尿液中发射大量编码的报告物，以便通过质谱进行多重检测。使用小鼠肝纤维化和癌症模型，我们表明，与临床使用的血液生物标记物相比，它们可以无创监测肝纤维化和消退，而无需进行侵入性核心活检，并且可以显著提高癌症的早期检测。这种工程化合成生物标记物用于多重泌尿监测的方法应广泛适用于其他病理生理过程和重点诊断。
生物标记物发现的动机是为了确定可靠的疾病指标，以便进行风险评估、早期检测、预测患者对治疗的反应以及监测复发性疾病1,2迄今为止，广泛的不同生物物种，如代谢物三，肽4，蛋白质2,5，无细胞核酸6、外泌体7和循环肿瘤细胞8已发展成为不同性能的生物标记物。然而，使用天然生物标记物来指示疾病受到基本技术和生物挑战的限制，因为生物标记物在循环中经常处于低水平8,9，在复杂的生物流体中难以分解5并且可以快速降解体内和离体10.
内源性生物标记物的另一种替代方法是系统性施用外源性药物以询问生物状态。这些方法提供了定制试剂的潜力，以利用宿主生理学或与疾病特异性分子过程的接口作为疾病的替代指标。例如，多糖菊糖用于评估肾小球滤过率，FDG-PET用于揭示葡萄糖代谢增加的区域，以及一套用于成像生物活性的分子和活性探针体内11–13。因为可以设计和测试这些代理在体外在临床前模型中，它们可以迭代优化，并且可以在显著高于生物背景的浓度下给药。这些方法的局限性包括，由于有限的多路复用能力和大量的基础设施，无法同时监测大型探测器系列体内分析，要求患者在现场（如PET、MRI），并排除远程数据或样本采集。
在这里，我们描述了一类工程纳米制剂，它们通过器官或疾病特异性血管窗（例如肝窦内皮或血管生成性肿瘤血管）从宿主循环被动积聚在病变组织中14,15在到达患病微环境后，它们被异常活跃的蛋白酶裂解，释放表面结合的、质量编码的肽底物到宿主尿液中，作为疾病的合成生物标记物，用质谱（MS）进行检测(). 因为失调的蛋白酶活性与广泛的人类疾病有关，包括癌症、纤维化、动脉粥样硬化、炎症、阿尔茨海默病和许多其他疾病16对异常蛋白酶活性的高度多重监测有可能区分不同的疾病状态。这里我们描述了这项技术在非侵入性监测肝纤维化中的应用17检测早期癌症18.
进近示意图(一)合成生物标记物库由与纳米虫纳米粒子结合的质量编码串联肽组成。(b)活体动物静脉注射后疾病组织中的NW积聚。失调蛋白酶从NW中裂解肽，使片段过滤到尿液中。(c（c）)通过紫外线照射从尿液裂解碎片中回收拍照质量报告物，并通过液相色谱-串联质谱法进行定量。
结果
尿监测用蛋白酶敏感纳米粒
为了开发蛋白酶传感平台，我们首先着手鉴定与肝纤维化和癌症有关的蛋白酶的肽底物。~50个候选肽底物的荧光素标记衍生物19–23与聚乙二醇涂层的长循环氧化铁纳米虫（NW）纳米粒子结合24(补充图1a、b、c)与通常在疾病中过度表达的重组蛋白酶（例如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织蛋白酶）以及血源性蛋白酶培养，以评估交叉反应性（FXa、组织因子（TF）、凝血酶）。每种蛋白酶-底物组合的相对底物活性是通过监测肽水解导致的样品荧光增加来确定的，肽水解允许先前的同猝灭荧光团在溶液中自由发射(). 在热图中编辑初始反应速度以进行比较分析()其中10个肽底物（S1–S10，)选择具有广泛蛋白酶敏感性的肽-NW文库。
尿液检测体内肽-NWs的蛋白酶活性(一)显示了用重组蛋白酶处理后肽-NW的代表性活化特征。特定蛋白酶底物组合导致样品荧光快速增加。(b)根据活性和特异性分组的不同基质-蛋白酶组合的解理速度的热图比较。(c（c）)荧光体内静脉注射VivoTag-680标记的Glu-fib肽后DDC治疗和对照动物的图像(d日)无肽NW或(e（电子）)肽结合NW。
表
10-plex合成生物标记物库研究中使用的合成生物标记物（G1–G10）、蛋白酶底物（S1–S10）和等压质量报告物（R1–R10）列表。
| 合成生物标记库[a] ，[b]（G1–G10） | 基板（S1–S10） | 等压质量代码[c] ，[日]（R1–R10） | 年6记者 | [年]6+H（H）+] |
|---|
| e（电子）+3G公司+6VndneeGFfsAr-X-K（FAM）GGPQGIWGQC-NW | PQGIWGQ公司 | e（电子）+3G公司+6VndneeGFfsAr公司 | GFfsAr公司 | 683.4 |
| e（电子）+2G公司+6Vndnee公司+1GFfsAr-X-K（FAM）GGLVPRGSGC-NW | LVPRGSG公司 | e（电子）+2G公司+6Vndnee公司+1GFfsAr公司 | +1GFfsAr公司 | 684.4 |
| e（电子）+1G公司+6Vndnee公司+2GFfsAr-X-K（FAM）GGPVGLIGC-NW | PVGLIG公司 | e（电子）+1G公司+6Vndnee公司+2GFfsAr公司 | +2GFfsAr公司 | 685.4 |
| 如+6Vndnee公司+2全球金融基金+1Ar-X-K（FAM）GGPWGQGC-NW | PWGIWGQG公司 | 如+6Vndnee公司+2全球金融基金+1应收账 | +2全球金融基金+1应收账 | 686.4 |
| 如+5VndneeGFfs公司+4Ar-X-K（FAM）GGPVPLSLVMC-NW | PVPLSLVM公司 | 如+5VndneeGFfs公司+4应收账 | 全球金融基金+4应收账 | 687.4 |
| e（电子）+3G公司+1Vndnee公司+1全球金融基金+4Ar-X-K（FAM）GGPLGLRSWC-NW | PLGLRSW公司 | e（电子）+3G公司+1Vndnee公司+1全球金融基金+4应收账 | +1全球金融基金+4应收账 | 688.4 |
| e（电子）+3GVndneeG公司+6FfsAr-X-K（FAM）GGPLGVKC-NW | PLGVRGK公司 | e（电子）+3GVndneeG公司+6FfsAr公司 | G公司+6FfsAr公司 | 689.4 |
| e（电子）+2GVndneeG公司+6Ffs公司+1Ar-X-K（FAM）GGf（Pip）RSGGGC-NW | f（Pip）RSGGG | e（电子）+2GVndneeG公司+6Ffs公司+1应收账 | G公司+6Ffs公司+1应收账 | 690.4 |
| e（电子）+1GVndnee公司+2G公司+6FfsAr-X-K（FAM）GGfPRSGGC-NW | fPRSGG公司 | e（电子）+1GVndnee公司+2G公司+6FfsAr公司 | +2G公司+6FfsAr公司 | 691.4 |
| eGVndnee公司+3G公司+6FfsAr-X-K（FAM）GGf（Pip）KSGGGC-NW | f（皮普）KSGGG | eGVndnee公司+3G公司+6FfsAr公司 | +3G公司+6FfsAr公司 | 692.4 |
为了建立从尿液中远程探测疾病微环境的潜力，我们接下来研究了体内每个系统成分（即肽和NW）的行为。在这里，我们选择了一种异种小鼠肝纤维化模型，在该模型中，喂食3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可立定（DDC）的FVB/NJ小鼠由于慢性胆管损伤而发展为进展性肝病25导致肝纤维化和局部MMPs上调(,补充图8b). 首先，为了确定肽清除到尿液中的效率，我们选择肽谷氨酸纤维蛋白肽B（Glu-fib，EGVNDNEEGFFSAR）作为原型尿标志物，因为其内源性衍生物（纤维蛋白肽B）具有生物惰性，在凝血过程中释放时可自由过滤到尿液中26正如预期的那样，静脉注射荧光标记的Glu-fib在纤维化动物和健康动物的尿液中迅速清除，没有证据表明疾病部位有肝脏摄取(). 相比之下，无肽NW主要局限于肝脏()但无法过滤到尿液中，符合无机纳米粒子的肾脏清除阈值~5nm27（NWs ~ 40 nm，补充图1a)以及我们之前与NW的药代动力学研究28注入与底物S1–S10的荧光衍生物共轭的肽-NW()通过对裂解肽片段的肾过滤，导致纤维化动物肝脏强烈摄取并引起显著的尿反应(). 总的来说，这些研究证明了NW将肽导向疾病部位的能力，以促进尿生物标记物的产生。
DDC治疗小鼠肝纤维化的尿液生物标志物及其消退(一)DDC和Marimastat治疗的时间表。(b)G1-G10给药后α-FITC免疫沉淀法测定的尿生物标志物水平（ANOVA***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01). (c（c）)诱导纤维生成和解决时间表。(d日)通过羟脯氨酸分析定量肝总胶原蛋白。DDC治疗导致第3周肝胶原增加约3倍(***P（P）<0.001），第7周至第11周减少约30%(*P（P）<0.05）仍高于预处理值(*P（P）<0.05）（单向方差分析，Tukey后验，n=3，s.e.m.）。(e（电子）)所示为代表性肝脏切片的天狼星红染色，表明在第3周存在来自门静脉三联体的纤维化延伸，持续至第7周，并在11周后逆转。（比例尺=50μm）(（f）)在0周、3周、7周和11周时，单个iCORE峰值强度的盒形图和晶须图绘制为对照组的DDC(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01; 重复测量方差分析，Tukey后验；n=8–10）。(克)交叉验证G7作为尿纤维化的生物标志物Mdr2公司−/−老鼠。羟脯氨酸分析法定量测定肝胶原(*P（P）<0.05，n=3）。(小时)IVIS荧光体内尿反应成像马里兰州2−/−NW输注后的小鼠。(我)服用G7导致尿液荧光升高，而G8没有出现纤维化(**P（P）< 0.01).
质谱分析蛋白酶活性
尽管大量编码具有多重优势，但MS检测蛋白酶活性的一个挑战是复杂蛋白水解酶环境中的肽底物可以被杂乱的蛋白酶在多个位点切割，并被外源蛋白酶截断29,30产生不同的定义不清的碎片池，混淆了大量分析。在这里，我们开始创建定义明确的大规模报告器来编码我们的底物库。鉴于Glu-fib具有良好的肾脏清除特性，我们选择将富含d-异构体的Glu-fab衍生物附加到每个蛋白酶底物的N末端，作为蛋白酶抗性大规模报告物，并在底物裂解和从NW释放时促进肾脏滤过。这些串联肽被进一步修饰为内部光活性残基31通过光解从复杂的尿液切割片段中回收Glu-fib肽体内蛋白质水解。为了测试这一结构，我们合成了一个模型的感光串联肽（化合物I，). 与先前发表的关于硝基苯基的报告一致，化合物I的暴露（三次充电，881.7 m/z；,顶部面板)紫外光触发肽裂解，导致出现双电荷、端乙酰氨基的Glu-fib（785.4 m/z；,底部面板).
通过LC-MS/MS对蛋白酶活性进行多重分析的光刻iCORE库(一)含有内部紫外线敏感连接物的串联肽（化合物I）的结构。光解后生成的游离Glu-fib（化合物II）的结构（~350 nm）。(b)前化合物I的LC-MS光谱(顶部，三次充电m/z:881.7）及之后(底部，双电荷m/z:785.4）暴露于紫外线下。(c（c）)源自Glu-fib（R1–R10）的10-plex等压肽库。(d日)等摩尔10-plex iCORE混合物（789.80–789.90 m/z）的萃取离子色谱图。整个多重组在色谱上无法区分。(e（电子）)碰撞诱导分离后的iCORE MS/MS谱。单个报告者通过独特的y6报告离子（683.3–692.3 m/z）进行鉴定，每个报告离子都可以通过单个质量单位进行区分。(（f）)iCORE MS/MS光谱，在10复合物、iCORE编码的肽-NW混合物与重组MMP9孵育后。
为了设计蛋白酶底物库的可扩展编码策略，我们采用了等压质量编码原理32,33从Glu-fib产生一个大众记者家庭。等压编码策略的显著特点是，报告者家族中的个体成员共享一个母质量，以便于MS高效收集肽，但随后可以通过独特的MS/MS离子在片段化后进行识别。观察到Glu-fib碎片成C端y型离子(补充图2a)，我们以y为中心构造了10个质量码6离子（GFFSAR），用重氨基酸富集六聚体，产生每个差异1 Da的变体(补充图2b). 然后通过剩余残基中的同位素富集（EGVNDNEE）来平衡这种引入的质量转移，以产生具有相同母体质量但不同y的肽6碎片离子。我们称这种编码方法为“我荞麦面一氧化碳日期重新搬运工”（iCORE）。为了验证这种方法，我们分析了等摩尔10-plex iCORE库（R1–R10，)通过LC-MS/MS，发现整个肽库最初显示为单个未解析峰（提取离子色谱，789.95±0.5 m/z，)但在碎裂后，如预测的那样分解为10个峰值的光谱，没有碎裂偏差（683.4–692.4 m/z，补充图3,). 通过收集以前体离子为中心的1 m/z窗口的iCORE肽，消除了天然同位素（例如13C）的混淆峰重叠(补充图4a)将天然同位素的信号降至母峰的~5%(补充图4b). 因此，在以规定比率（1:2:3:5:10:10:5:3:2:1）加入报告者的样品中，我们观察到未修正分析和峰减分析中的峰强度和化学计量之间存在线性相关性（n=3，R2=0.99和R2分别=0.99，补充图5a、b、c). 随后的所有样品都进行了峰值调整，以反映天然同位素的贡献。
为了测试iCORE报告员监测肽裂解的能力，蛋白酶底物S1–S10通过光敏氨基酸用iCORE质量标记R1–R10延伸，并与NW偶联以产生合成生物标记物G1–G10(). 用重组MMP9处理G1–G10等摩尔混合物后，通过尺寸过滤分离裂解产物，并暴露于紫外线下，释放报告物R1–R10用于MS/MS定量。集体底物活动表现为不同的iCORE景观6MMP9底物偏好对应的峰值强度(). 我们将这个库应用于其他几种蛋白酶(补充图6a)并发现根据Pearson的相关性分析（即MMP2、MMP9、MMP12和凝血酶；补充图6b)，说明iCORE编码的NW同时监测多个蛋白酶底物组合的能力。
监测肝纤维化的发生和消退
肝纤维化是对慢性肝损伤的伤口愈合反应，导致瘢痕组织沉积，从而导致肝硬化、肝衰竭和癌症17细胞外基质（如胶原）积聚的动力学主要由活化的肝星状细胞和基质重塑蛋白酶（如MMPs及其抑制剂）驱动。目前监测这一过程的金标准是穿刺活检，然后进行组织学分析；然而，这项技术具有侵入性，被高采样异质性所混淆，并发症的风险有限，不能根据需要经常进行（例如用于评估抗纤维化治疗）34非侵入性检测，包括超声成像、弹性成像和血清生物标记物，由于其准确性低和预后效用有限而受到限制35因此，迫切需要非侵入性生物标记物来取代基于生物病理学的监测，以促进新抗纤维化药物的识别和验证，并支持临床决策36在这里，我们试图确定具有监测肝纤维化和消退能力的合成生物标记物，并将我们的DDC模型扩展到包括疾病的两个方面().
我们首先评估了NWs的潜在毒性，以确定是否可以安全地进行连续监测。NW由经FDA批准用于人体的氧化铁核心组成（Feridex®）；然而，我们试图进一步研究纤维化肝脏是否对纳米材料毒性敏感。为了研究纳米材料的安全性，我们每周（第0、7和14天）给喂食DDC或对照食物的动物施用肽NWs（1 mg/kg）或PBS，连续3周(补充图7a)发现与PBS注射动物相比，NWs不会加剧纤维化、减轻体重或诱导肝毒性(补充图7b–e). 如果前几次给药后残留的尿液报告物未得到充分清除，连续NW输注也可能会产生实验伪影。最后一次NW注射后（第14天）的尿液样本分析表明，残留荧光和大量报告物在5天内（第19天）被清除(补充图7f，g). 总之，这些实验表明，NW在所选剂量下耐受性良好，需要5天才能完全清除。
接下来，我们通过测试尿对MMPs药物抑制的敏感性，研究尿反应是否由纤维素酶相关蛋白酶（如MMPs）特异性产生(). 然而，将我们的10-plex iCORE编码的NW鸡尾酒（G1–G10）输注于给予DDC食物3周的动物中，与对照组相比，整体尿液荧光显著增加（方差分析***P（P）< 0.001,)在G1–G10给药前两天，经口灌胃给予广谱MMP抑制剂Marimastat的小鼠的尿反应显著减弱，导致报告水平抑制70%以上(**P（P）< 0.01,). 为了确定NW对纤维化部位的可及性，肝脏切片的免疫荧光分析显示，大多数NW自由浸润到实质中，并进一步渗透到活动性纤维化的门脉周围区，逃避常驻巨噬细胞的隔离(补充图8a). 与对照组相比，这些区域显示出MMP9的显著上调，MMP9是一种典型的纤维炎相关MMP(补充图8b、c). 用DQ明胶基质处理的纤维化切片中出现类似的点状图案(补充图8d)确认胶原蛋白降解蛋白酶（例如MMP2/9）的酶活性。这些结果表明，基质金属蛋白酶在纤维化过程中上调，具有蛋白水解活性，并在很大程度上负责尿液反应。
接下来，我们通过iCORE质量分析监测纤维化和溶解的过程，以确定除尿液中的集体荧光外，单个生物标记物的反应。短暂给予DDC治疗3周的小鼠，随后恢复不含DDC的食物，出现明显的活动性纤维化和消退窗口（分别为0-3周和7-11周，)通过肝切片的天狼星红胶原染色和羟脯氨酸定量进行宏观验证(). 使用该治疗方案，在DDC治疗3周后，肝胶原水平比预处理水平增加了约3倍，在首次去除DDC后的第3-7周持续存在，在持续停药后的第7-11周显著下降（方差分析*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.005，n=3）。因此，为了监测纤维化和疾病缓解之间的转变，我们在0、3、7和11周时给DDC治疗和年龄匹配的对照动物注射NW，然后进行iCORE MS/MS分析。
十种合成生物标志物的活性结果显示出明显不同的动力学(). 相对于预处理基线，生物标记物G3和G4均显著增加，尽管分别在第7周和第3周交错出现，但在第11周达到稳定。G5和G6表现出相反的动力学，在逐渐恢复到预处理强度（G5）或持续到第11周（G6）之前的第3周显著下降。G7跟踪DDC治疗的动力学，在第3周急剧上升，然后在第7周快速逆转。所有剩余的生物标记物（G1、G2、G8、G9和G10）均未偏离初始预处理活性（G1–G10*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，重复测量ANOVA，Tukey后验，n=10）以及对照动物的所有生物标记物(补充图9).
在DDC的背景下，我们已经确定了一组公认的肝纤维化生物标志物，接下来我们试图在Mdr2公司−/−小鼠，一种机制不同的肝纤维化模型。在不参与假设生成的独立队列中交叉验证生物标志物反应对于消除近交系小鼠使用中潜在的模型特异性伪影以及数据过度拟合至关重要37.Mdr2公司−/−小鼠缺乏稳定胆汁所需的关键磷脂转运蛋白，并且从出生起就由于胆汁漏入门脉而发生慢性肝损伤38.
8周龄时，Mdr2公司−/−与年龄匹配的野生型动物相比，动物表现出门脉周围纤维化以及MMP9的显著上调(,补充图10a、b). 从我们的10个探针库中，我们选择了G7进行交叉验证，因为在我们的DDC研究中，G7对肝纤维化具有高度特异性，可以跟踪纤维化的发生并在纤维化消退后下降(). 与我们最初的观察结果类似，我们在8周内检测到尿荧光显著升高Mdr2公司−/−啮齿动物过度控制(). 相比之下，G8，一种在我们的DDC研究中显示无反应的生物标记物，并没有显示出监测肝纤维化的潜力Mdr2公司−/−动物(). 总之，这些结果进一步证实了G7追踪肝纤维化的能力，并强调了用不同的分子病因监测纤维化发生的潜力。
为了探索通过使用多个生物标记物可以获得的疾病分类的潜在改进，我们使用受体操作特征（ROC）曲线进一步分析了我们在DDC研究中的生物标记物反应。ROC曲线通过返回曲线下面积（AUC）作为基准AUC为0.5的指标来表征生物标记物的预测能力，基准AUC代表随机生物标记物分类器（虚线，补充图11-13). 在0–3周的纤维生成窗口内，生物标记物G4、G5、G6和G7分别以0.83–0.96（n=10，补充图11)和组合面板，如最佳双（G5+G7）和三生物标志物（G5+G6+G7）组合导致预测性提高（分别为0.98和1.0，补充图13). 相反，在纤维化消退过程中，在双重（G1+G9，AUC=0.9）或三重生物标记物组合（G1+G17+G9、AUC=0.91）中，候选生物标记物追踪疾病（如G1（AUC=0.73））的能力有所提高(补充图13).
总的来说，这些实验表明，不同的合成生物标记物集合揭示了肝纤维化和肝纤维化的消退，并且多重组合能够实现最高的诊断性能，这表明了该平台能够无创地阐明肝脏疾病演变中其他难以进入的方面。
结直肠癌的早期检测
当在系统性播散之前诊断时，许多原发性肿瘤可以通过常规临床干预进行有效治疗39然而，大多数生物标记物从肿瘤中脱落的速率低得令人望而却步，而且不容易扩增40，有效阻止早期检测9,18因此，血液生物标记物检测到的最小肿瘤（>2–5 cm）与治疗效果最佳的肿瘤大小（<1–5 mm）之间存在明显的不匹配，导致检测延迟，药物反应率低，患者总体存活率降低。在这里，我们假设，因为纳米颗粒可以被动地靶向肿瘤，通过开窗的血管生成肿瘤血管采集蛋白酶15肿瘤特异性蛋白酶可以通过持续酶促释放合成尿生物标记物来放大肿瘤检测。
为了探索这一假设，我们选择将癌胚抗原（CEA）（一种临床上用于结直肠癌（CRC）的血液生物标志物）与我们的NWs进行比较。由于CRC患者的血浆CEA水平高度可变，我们首先从24个已建立的人类CRC株系中汇编了ATCC-记录的CEA产生率（另有14株系未经特征化），发现率范围远远超过4个对数单位，中值为1.65 ng/106细胞/10天(补充图14). 我们选择细胞株LS174T来代表能够产生CEA的大肠肿瘤，接近最大观察速率（约为中位数的100倍），并验证其分泌CEA的能力在体外ELISA检测限为~0.1 ng/ml(补充图15a、b). 为了充分捕获大多数侵袭性肿瘤共有的基质重塑蛋白酶的广谱活性，我们将我们的生物标记物集合（G1−G10）注入携带LS174T侧翼肿瘤的小鼠体内()并检测到尿中荧光显著升高。切除肿瘤的荧光成像和组织切片分析证实了NW渗入肿瘤实质(补充图16a、b). 为了测试尿反应是否是通过MMPs的蛋白水解特异性产生的，在G1−G10给药前两天用Marimastat治疗一组单独的肿瘤动物。MMPs的药理抑制导致尿信号几乎消失，信号强度降低约73%().
在早期癌症检测中，合成尿生物标记物优于血清CEA(一)IVIS荧光体内成像显示LS174T大肠肿瘤释放的合成生物标记物在尿液中积聚。(b)使用（+）和不使用（−）Marimastat治疗的尿液荧光定量（ANOVA**P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05). (c（c）)LS174T和HCT-15大肠肿瘤的生长动力学（n=5，s.d.）。(d日)ELISA法分析肿瘤植入后第三天循环CEA水平(**P（P）<0.01，双向方差分析，Tukey后验）。箭头表示NW注入。(e（电子）)人类大肠肿瘤的早期检测。分别在第10天和第13天给LS174T和HCT-15荷瘤动物注射NW后，尿反应显著升高（双尾配对T检验*P（P）< 0.05). (（f）)在第10天，集合尿生物标记物面板和血清CEA之间的AUC比较（n=10）。
接下来，我们试图直接比较合成尿生物标记物和CEA在早期癌症检测中的作用。在植入LS174T细胞后，我们通过ELISA每3天定量血清CEA水平来无创监测肿瘤生长，当平均肿瘤体积达到330mm时，到第13天发现疾病三(**P（P）<0.01，双向方差分析，n=5，). 同时，我们通过在第0天和第10天注射G1−G10（~130 mm）来监测肿瘤生长三). 而CEA无法检测到肿瘤负荷<330 mm三，与肿瘤前样本相比，第10天的整体尿液反应显著升高，允许检测比CEA小2.5倍的肿瘤（130对330 mm三,). 为了进一步表征这两种方法的区分敏感性和特异性，对血清CEA和尿生物标志物水平进行ROC分析。与CEA对早期检测的有限预测能力（AUC=0.61）相比，集合尿荧光具有高度的区分性，产生的集合AUC为0.94（n=10，). 为了确定驱动集合预测性的潜在生物标记物，对单个探针的响应进行量化并绘制为ROC曲线(补充图17,18). 通过表现最佳的单个探针（G1、G2和G3，AUC=0.78–0.81）进行疾病分类，并没有完全重述多重组合集，但在双重（G1+G2，AUC=0.88）或三重生物标记物面板（G1+G2+G3，AUC=0.89）中得到了改善(补充图19). 后一个观察结果强调了使用不同系列探针进行最灵敏检测的价值。
在建立了生物标记物扩增用于早期癌症检测的潜力之后，我们在一个独立的CRC小鼠队列中寻求交叉验证。鉴于CEA分泌率的高度可变性，我们假设我们的探针集成库可以检测到分泌生物标记物的低速率肿瘤。我们选择了HCT-15细胞，这是一种遗传上不同的CRC细胞系，其分泌CEA的速率比中值低三倍(补充图14). 正如与LS174T肿瘤相比，CEA生成显著减少（约300倍）所预期的那样，即使到第29天，当平均肿瘤负担测量到约1300 mm时，血清分析也无法检测到HCT-15肿瘤的生长三()，达到该啮齿动物模型的最大允许限值。相比之下，通过NW输注和第13天的尿液分析（~150 mm）很容易鉴别HCT-15肿瘤三,)，至少比CEA提高了9倍以上（150毫米对1300毫米三分别）。总的来说，这些结果表明，与传统的血液生物标记物相比，合成尿生物标记物具有更早检测癌症的潜力，尤其是在肿瘤分泌生物标记物的速度较慢时，其显著增强。
讨论
理想的生物标志物应在相对天然背景的高水平下分泌，在检测前保持稳定或持续循环，易于从成分简单的宿主液体中获得，并以高灵敏度和特异性鉴别疾病。在实践中，这些参数往往难以改善或控制天然生物标记物，因此，许多有希望的生物标记物在临床翻译的严格评估中失败。在这里，我们设计了一个合成生物标记物系统，该系统具有以下能力：（i）通过靶向异常蛋白酶活性的底物转换来放大生物标记物水平，（ii）释放稳定的、富含二聚体的大规模报告物，其设计是出现在一个没有宿主分子的狭窄质量窗口内，（iii）触发报告者从血液中清除到尿液中，以降低基质复杂性并促进提取，以及（iv）同时监测候选合成生物标记物库体内识别并验证主要生物标志物。
我们平台的一个有利特性是使用纳米支架来引导肽的流量体内虽然游离肽通常通过尿分泌物从循环中迅速清除，但我们发现NW结合肽具有较长的循环时间，允许通过多孔血管系统运输到疾病组织中，并且仅在疾病相关蛋白酶从NW释放后才出现在尿中。一些报告强调了将肽底物应用于患者血清样本，然后进行质谱分析以揭示疾病特异性活性特征的潜力4,29,30,41然而，如果没有交付机制，在体外血清分析无法对存在于疾病微环境中的细胞膜上表达的蛋白酶进行采样（例如，肝纤维化中的巨噬细胞表达MMP9）。与血液生物标记物类似，分泌蛋白酶在循环中被显著稀释，检测上述高含量血浆蛋白通常具有挑战性5、样品采集期间激活的有效蛋白水解级联（例如凝固）和血浆中的泛蛋白酶抑制剂（例如α2-巨球蛋白）。在这里，我们选择NW作为伴侣，因为氧化铁纳米颗粒对人体来说是安全的，但包括蛋白质和糖（例如白蛋白和右旋糖酐）在内的广泛无毒支架也适用于肽递送。考虑到纳米材料、靶向配体和增强型给药策略在纳米医学中的累积财富，我们希望这项工作可以转移到许多其他配方中，以获得不同器官、血管类型和组织深度的信息42,43.
我们的等压质量标签库用于跟踪10个肽的反应体内提供了一种目前难以通过分子和基于活动的成像探针实现的多路复用水平11–13这些方法中的绝大多数都使用在蛋白水解裂解后发出荧光信号的改良蛋白酶底物。因此，衬底复用受到发射重叠以及需要在近红外窗口（600–900 nm）发射以最小化组织吸收的信号衰减的限制，从而限制了大多数研究仅限于单个探针。相反，我们的工作表明，合成生物标记库的生成比现有最先进的基于活性的探针多5–10倍，比商业等压标签（例如8-plex iTRAQ）和额外的母肽更有利，可扩展到数百个正交质谱码。
除了其侵袭性外，肝纤维化核心活检的一个主要局限性是组织标本仅代表约1/50000第个成人肝脏的大小导致采样变化，从而导致诊断或分期不准确以及重复活检。在这里，我们展示了纳米颗粒如何均匀地积聚在肝脏中，毫无偏见地渗透到活动性纤维化区域，以释放尿液生物标记物作为疾病负担的综合衡量指标。我们在两种具有不同诱导机制的纤维化模型（即外源性与遗传性）中的工作表明了生物标志物G7在监测纤维化方面的价值。这些结果反映了纤维化是对各种慢性肝病（如病毒性肝炎、酗酒、脂肪性肝病等）的保守组织反应，并表明生物标记物G7可能有助于监测不同基础病理学引起的纤维化。展望未来，未来研究的一个重要领域是阐明最终负责释放个别记者的生物学机制。例如，这可以通过将缺乏特定蛋白酶（如MMP9−/−）的动物的尿液特征与其野生型对应物进行比较来实现，或者使用氯膦酸盐脂质体来耗尽肝巨噬细胞，以确定追踪细胞炎症的报告子。
阻止癌症早期检测的一个主要因素是，当肿瘤细胞释放到体循环中时，会经历大量的稀释生物标记物。Gambhir及其同事最近的计算估计18研究表明，实体肿瘤可能在10–12年内无法被检测到，并且在生物标记物水平升高到足以指示疾病之前，其球形直径可能会达到>2.5cm。在这里，我们的系统的优点是能够通过利用酶的周转来放大肿瘤反应（即一个蛋白酶的单一拷贝每小时可以裂解100个肽底物），以及肾脏系统清除血浆肽并将其浓缩到尿液中的天然能力（即从约5升血液到300毫升孔隙体积）。我们的研究表明，蛋白酶扩增和肾脏浓度的联合作用可以产生有希望的结果，例如检测小肿瘤，即使在我们的动物模型中允许的最高肿瘤负荷下，CEA也无法区分小肿瘤。由于许多肿瘤不能以足够的速率（或根本不能）分泌用于检测的生物标志物，靶向肿瘤蛋白酶应能在早期发现更广泛的癌症，因为蛋白酶在肿瘤侵袭和转移过程中一致参与。将该平台扩展到多种癌症将受益于癌症类型特异性测试的开发，这些测试可以通过为每种癌症识别独特的生物标记物面板来完成44相反，当原发肿瘤已知时，由一组不同探针组成的高度敏感的泛癌检测在临床上很有用，例如监测原发肿瘤手术切除后的复发或转移。
将该平台成功转化为人类需要进一步确认我们在患者中的主要生物标记物，并量化监测生物标记物面板相对于单个标记物的潜在益处。现有单一生物标记物检测的一个关键局限性是其相对较差的疾病特异性（例如，吸烟者的CEA升高）。这些分析可以通过多路复用（例如产前三重筛查）或在明确定义的临床环境中指定其用途来改进（例如，PSA现在建议用于复发监测，但不用于筛查）。同样，该平台区分蛋白酶驱动疾病（例如炎症与癌症）的能力将受益于高危人群的多重和系列测量。
最后，啮齿动物研究普遍关注的是用于假设测试和验证的动物数量相对较少。在本研究中，每个实验条件下选择的动物数量（n=5-10）允许基于正态分布合理估计平均值和方差。我们研究的统计能力进一步得到了两种疾病中观察到的显著效应大小（如大AUC）以及不同模型中一致的生物标记物反应的支持。尽管如此，展望未来，并根据最近专家关于生物标记鉴定的建议37，这项研究的结果将需要进一步的确认和严格的人体评估。
总之，我们相信这项研究为工程诊断试剂提供了一个框架，可以利用人类疾病和生理学的基本特征进行无创性尿液监测。未来将扩展并包括其他酶家族（例如脂肪酶、核酸酶、糖苷酶），特定组织的传递策略和更广泛的复用能力将为系统级疾病监测和阐明健康和疾病中的多酶网络提供机会。
方法
纳米材料合成
根据先前发布的协议合成了纳米虫。24肽在麻省理工学院（斯旺森生物技术中心）合成；同位素标记的Fmoc氨基酸购自Cambridge Isotopes，3-Nα-Fmoc-amino-3-（2-硝基苯基）丙酸购自Advanced Chemtech。胺终止的NW首先与Vivotag 680（Perkin Elmer）反应，以使体内成像，然后与SIA（Pierce）反应，引入巯基反应手柄。然后在室温下（分别为95:20:1摩尔比）将半胱氨酸肽和PEG-SH与NW混合过夜，并通过粒度过滤去除多余的肽。肽-NW储备溶液储存在4°C的PBS中。
体外蛋白酶测定
为了进行底物筛选，将Fl-肽-NWs（2.5μM肽）与重组MMP-2/8/9（研发系统）、MMP-7/14（AnaSpec公司）、凝血酶、组织因子、因子X混合一或Cathepsin B（血液技术公司），按照制造商的说明，在37°C的96 well板中，置于活性缓冲液中，并用微孔板阅读器（SpectroMax Gemini EM）进行监测。对于MS分析，等摩尔iCORE编码NW()在37°C下与蛋白酶孵育2.5小时。在UV处理（365 nm，CL-1000 UV交联剂，UVP）之前，通过尺寸过滤从NW中纯化裂解片段。然后用高速真空离心机对报告者进行干燥，并将其储存在4°C下。
体内成像
所有动物工作都得到了动物护理委员会的批准（麻省理工学院，方案号0408-038-11）。FVB/NJ小鼠（Jackson Labs）喂食0.1%w/w DDC（Sigma）啮齿类食物三周（研究饮食）。用VivoTag-680标记试剂对纤维化和年龄控制动物进行静脉注射，并通过IVIS成像（Xenogen）进行可视化。对于肿瘤异种移植物，LS 174T癌细胞系维持在10%FBS EMEM中并皮下接种。（5×106/侧翼）。
模型特征
对于就地酶谱分析，纤维化切片用90μl 0.5%w/v低熔点琼脂糖（Sigma）溶液覆盖在MMP活化缓冲液（50 mM Tris，150 NaCl，5 mM CaCl）中2，0.025%Brij 35，pH 7.5）和10μl DQ凝胶（1mg/ml，Invitrogen）以及37°C下的Hoechst染料。将载玻片在4°C下固化，然后在室温下孵育过夜，以促进组织蛋白酶的凝胶化蛋白水解。为了量化肝胶原蛋白，在110°C的5 ml 6 N HCl中水解右叶和左叶（250–300 mg）的组织16小时，然后进行前面描述的羟脯氨酸量化。38为了量化CEA，从肿瘤动物的血液中采集到Capiject微管（Terumo）中，在ELISA分析之前分离血清（Calbiotech）。为了进行免疫荧光分析，对纤维化FVB/NJ或荷瘤裸鼠给予等摩尔NW鸡尾酒（5μM/肽）。灌注后，将肝脏或肿瘤固定在4%的PFA中，冷冻切片，并对F4/80（AbD Serotec）、MMP-9（R&D Biosystems）、CD31（Santa Cruz Biotechnologies）和/或FITC（Genetex）进行染色，然后用荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti）进行分析。
尿肽采集
小鼠静脉注射200μl含有等摩尔NW鸡尾酒的PBS（每肽5μM）和不含EDTA-的蛋白酶抑制剂片（罗氏），以分离MMP活性。在NW输注之前，每天两次通过口胃灌胃给予Marimastat 100 mg/kg的0.45%甲基纤维素。小鼠被放置在96个被圆柱形套筒包围的平板上收集尿液。为了防止报告者进一步降解，收集后立即用EDTA+完全蛋白酶抑制剂（罗氏）对作废样品进行添加。为了量化尿液荧光，每个样品的2μL用涂有α-FITC抗体（Genetex）的磁珠（Dynal）在50μL结合缓冲液（100 nM NH）中培养4OAc，0.01%CHAPS）在37°C下1小时，用100 mM NH洗涤两次4OAc，用15μl 5%乙酸洗脱两次。样品用2 M Tris中和，并用微孔板荧光法定量。对于iCORE分析，样品在TCA沉淀（最终体积的20%）之前用紫外线照射30分钟，以去除蛋白质。可溶组分用于C18反相柱（Nest Group），并通过20%ACN增量在0.1%甲酸中的梯度洗脱。收集含有Glu-fib肽的60%ACN组分，并通过真空离心干燥。
LC MS/MS分析
肽样品在5%ACN和0.1%甲酸中重新配制，并在麻省理工学院或Taplin MS设施（哈佛医学院）进行分析。在麻省理工学院，使用含有0.1%甲酸的水-乙腈溶剂系统，以300 nL/min的流速从C18纳米流HPLC柱（内径75μm Magic C18 AQ，Michrome BioResources，Inc.）中捕获并洗脱肽。ESI质谱在QSTAR Elite Q-TOF质谱仪（AB Sciex）上进行。在哈佛大学，样品在2.5%ACN和0.1%甲酸中重新配制。在对LTQ-Orbitrap（Thermo Electron）进行质量分析之前，使用Famos自动采样器（LC Packings）将样品注入安捷伦1100 HPLC。为了解释尿液量和浓度的差异，在标准化之前，对单个报告者的峰值强度相对于其各自的总iCORE离子电流进行了缩放，以对照样品解释技术和年龄相关的变化。
统计分析
用MatLAB计算不同蛋白酶谱之间的皮尔逊相关系数。ANOVA分析使用GraphPad 5.0（Prism）进行计算。对于ROC分析，风险评分函数首先通过对单个生物标记物的逻辑回归进行估计，然后进行单个或生物标记物组合的ROC曲线分析（SigmaPlot）。
致谢
我们感谢R.Cook、N.Schiller和M.Brown（麻省理工学院斯旺森生物技术中心（SBC））的肽合成和组织切片，C.Whittaker（麻省理工学院SBC）的生物信息学见解，R.Tomaino（哈佛大学塔普林理工学院）的MS分析，F.Giammo和D.Kim（麻省理工学院）的初步探针工作和尿液纯化，S。Carr（麻省理工大学/哈佛大学博德学院）提供了MS专业知识，M.Sailor（加州大学圣地亚哥分校）、J.Park（加州大学圣保罗分校）和S.Friedman（西奈山医学院）提供了深入的讨论。这项工作由NIH（BRP:R01 CA124427）、Kathy和Curt Marble癌症研究基金资助给S.N.B.，并由Ruth L.Kirschstein NRSA（F32CA159496-01）资助U19 AI066313、1R21 DK075857给D.S.G.A.K。S.N.B.是霍华德·休斯研究所的研究员。
脚注
作者贡献G.A.K.、G.v.M.和S.N.B构思了这项研究并设计了实验。执行的G.v.M.和S.M在体外底物筛选和初始药代动力学研究；G.A.K.开发了质量编码方案；G.A.K.、G.M.和O.A.进行了纤维化实验；Y.P.、D.Y.S.、S.B.L.和D.S.开发并提供了纤维化进展和逆转方案的专业知识，并进行了纤维化定量分析；G.A.K.和A.D.W.进行了癌症实验；G.A.K.和I.A.P收集体内MS数据；G.A.K.、G.v.M.和S.N.B.撰写了手稿。
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