分化的体细胞可以被诱导产生功能类似胚胎干细胞（ESCs）的多能干细胞6这种重编程过程源于分化过程中保持的显著细胞可塑性。该过程可由一组已定义的ESC特异性转录因子Pou5f1（Oct4）、Sox2、Klf4和c-Myc的外源表达触发6-9构成控制多能性和自我更新的核心调控电路。这些重编程因子的强制表达产生低效且动力学缓慢的多能干细胞，表明该过程存在细胞和分子屏障10.
最近的研究表明，体细胞重编程和恶性转化之间存在相当大的机制重叠11促进重编程的细胞机制，包括细胞增殖和存活、逃避DNA损伤反应和细胞永生，长期以来被认为可以促进肿瘤发生三-5,12一些致癌基因和抑癌基因也充当重编程的基本调节器6,10,11值得注意的是，p53（最重要的肿瘤抑制因子之一）的失活显著增强了iPSC的生成1-5,13作为一种肿瘤抑制因子，p53的转录调控汇聚到多个靶基因上，这些靶基因共同介导其下游效应，包括细胞周期停滞、细胞衰老、细胞凋亡、DNA损伤反应和基因组稳定性14同样，p53在抑制重编程中的作用也可能通过多个靶点介导。迄今为止，细胞周期调节器p21是唯一在抑制重编程中发挥作用的p53靶点。然而，p21缺陷仅部分表现为p53缺陷1,三,15，表明p53通过尚未确定的机制和靶点抑制iPSC的生成。
以前的研究已经确定mir-34型miRNAs作为真诚地p53转录靶点，其过度表达以细胞类型和环境依赖的方式触发细胞周期阻滞或凋亡16-18miRNAs是一个小的非编码RNA大家族，主要通过与部分互补的mRNA靶点配对来抑制转录后基因表达19,20针对p53激活，诱导mir-34型miRNAs可以通过抑制特定靶点介导p53下游效应，包括细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E2、Cdk4、Cdk6、Bcl2、和c-Met公司21尽管p53的主要特征是其在转录激活中的作用，但它作为一种全局基因调节因子，既激活又抑制基因表达14直接转录抑制，以及通过miRNAs的间接转录后抑制，如mir-34型构成p53介导的基因抑制的两个主要机制。
这个mir-34型miRNAs属于进化上保守的家族，有三种哺乳动物同源物，miR-34a，b和c（c）定位于两个不同的基因组位点，mir-34a型和mir-34b/c型16.所有三个mir-34型当Sox2、Oct4和Klf4在c-Myc存在或不存在的情况下触发小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）重编程时，miRNAs显著诱导(，数据未显示）。在这两种情况下，mir-34型归纳法，就像第21页依赖于完整p53的激活()。因此，我们调查了mir-34型miRNAs是p53下游重编程调节电路的新成分。其中包括mir-34型miRNA，miR-34a型在重编程过程中表现出最高的诱导水平；虽然miR-34b型是最低的。因此，我们首先关注的是mir-34a型在iPSC诱导中。
miR-34 miRNAs缺乏增加重编程效率a。四个重编程因子触发p53依赖性诱导miR-34型miRNA。转导三天后，前-34a，成熟miR-34a型和第21页在未感染和四因子诱导的WT中测量p53基因-/-MEF公司。诱导前-34a依赖于完整的p53反应，与第21页.诱导pri-mir-34b/c，成熟miR-34b型和c（c）在WT中确定，mir-34a型-/-和mir-34b/c型-/-MEF公司。误差线、标准偏差，n个=3.b。mir-34a型缺陷显著增强了三因素诱导的MEF重编程。2500名三因子感染WT，mir-34a型-/-或p53基因-/-MEF通过具有特征ESC形态的AP-阳性集落进行重编程。在五个独立实验中显示了一个具有代表性的图像和定量分析，比较了母鼠控制的WT和mir-34a型-/-MEF（左**P（P）<0.01），以及WT和p53基因-/-MEF（右**P（P）< 0.01). 误差线、标准偏差，n个=4.c。以每孔一个细胞的密度培养单分类、四因子感染的MEF。4周后，对具有典型iPSC形态的AP-阳性菌落进行WT评分，mir-34a型-/-和p53基因-/-iPSC。四项独立实验证实了这一发现*P（P）WT和mir-34a型-/-MEF公司。误差栏、标准误差、，n个=使用独立MEF线进行的实验。d。mir-34a型缺陷显著增强MEF重编程10月4-Gfp记者表情。三或四因子感染WT和mir-34a型-/-携带10月4-Gfp等位基因分别以2500个细胞/孔和1000个细胞/井的密度进行分类。通过GFP阳性克隆量化重编程效率。的图像10月4-Gfp左侧显示阳性iPSC。由四个因素触发的重新编程效率的定量分析（左**P（P）<0.01）或三因素（右*P（P）<0.02）。比例尺，100μm。误差线、标准偏差，n个=3.OSKM、Oct4、Sox2、Klf4和Myc；OSK，10月4日，Sox2和Klf4。e、。miR-34a，b、和c（c）协同调节体细胞重编程。以下方面的不足mir-34a型或mir-34b/c型单独显著促进了体细胞重编程，但总体上缺乏mir-34型miRNAs进一步增加。两个独立的实验证实了这一发现。误差栏、标准误差、，n个=独立MEF实验。所有P值均基于双尾Student’st吨-测试。
我们生成了mir-34a型使用C57BL/6 ESCs的敲除小鼠()，证实了目标等位基因的生殖系传播()并验证了mir-34a型通过表达研究().mir-34a型-/-小鼠以预期的孟德尔比率出生，在12个月内没有明显的发育或病理异常。然而，当我们诱导mir-34a型-/-MEF用于重编程，我们观察到重编程效率显著提高(,第1节a)。三因素感染mir-34a型-/-MEF显示具有典型iPSC形态的碱性磷酸酶（AP）阳性菌落增加了约4.5倍()，虽然受四个因素影响mir-34a型-/-MEF增长了约4倍(图S1a)。此外，当我们将受感染的MEF以每孔一个细胞的密度镀入96 well板时，mir-34a型缺乏导致具有典型iPSC形态的AP-阳性菌落数量增加().
的生成mir-34a型和mir-34b/c型敲除MEF答：。内源性图表mir-34a型和mir-34b/c型基因结构和敲除结构。通过重组，我们设计了mir-34a型靶向载体在5'和3'端均具有~6kb同源臂，侧翼为Kozak序列lacZ公司cDNA和FRT-新-FRT钱箱。这个mir-34b/c型靶向载体两端包含一个~6kb的同源臂mir-34b/c型基因和一个Neo选择盒液氧磷网站。b。验证的种系传输mir-34a型和mir-34b/c型使用Southern分析的目标等位基因。假定WT，mir-34a型+/-和mir-34a型-/-通过Southern blot分析来自三个独立靶向ES系的动物，使用5'或3'到同源臂的探针（左）。对WT进行了类似验证，mir-34b/c型+/-和mir-34b/c型-/-动物（右）。c。确认损失mir-34型中的表达式mir-34a型和mir-34b/c型敲除MEFs。轻型控制WT，mir-34a型+/-和mir-34a型-/-通过实时PCR分析MEF，以量化mir-34a型虽然WT MEF表现强劲miR-34a型文化应激诱导，否miR-34a型在中检测到表达mir-34a型-/-MEF公司。这个miR-34a型水平于mir-34a型+/-MEF约为WT MEF的一半。对进行了类似验证mir-34b/c型-/-MEF公司。误差线、标准偏差，n个=3.
使用带有10月4-Gfp敲除报告基因等位基因22，我们确认了miR-34a型在促进重新编程方面，根据内源性对完全重新编程的iPSC进行评分10月4日GFP表达。一直以来，在mir-34a型-/-;10月4-gfp/+三或四因子转导后的MEF()。重编程显著增加10月4-gfp使用锁定核酸（LNA）抑制剂也可以获得阳性菌落miR-34a型(图S1b)。尤其是，mir-34a型缺陷既提高了iPSC生成的整体效率，又导致了更快速的重编程动力学。在四因子转导的野生型（WT）MEF中，小iPSC-like菌落在感染后7天首次出现，但早在感染后5天mir-34a型-/-MEF公司。
自miR-34b型和c（c）分享miR-34a型种子序列和在重编程期间被类似地诱导()，它们也可能调节iPSC的生成。我们生成了mir-34b/c型基因敲除小鼠()。与miR-34a型缺乏，mir-34b/c型仅敲除基因就促进了体细胞重编程，尽管程度较低()。有趣的是，这三个MEF都不足mir-34型miRNAs在iPSC生成中表现出更大的增加()这表明这些基因之间存在协同作用，尽管这种协同作用的确切分子和细胞机制仍不清楚。自从mir-34a型-/-;mir-34b/c型-/-MEF没有完全进行现象学检查p53基因-/-MEF，其他机制可能作用于p53下游，以调节重编程抑制。
以前的研究已经确定p21是p53抑制重编程的重要介体1,12.mir-34型和第21页都展出了p53基因-重编程过程中的依赖性诱导().第21页在mir-34a型-/-MEF公司()。MEF不足mir-34a型单独或第21页仅iPSC的生成量就有相当的增加，两者的MEF都不足mir-34a型和第21页表现出合作性增加，重述了p53效应的重要部分()。鉴于三者在功能上的相似性mir-34型miRNAs之间的合作效应第21页以及所有mir-34型miRNA可能更大。因此mir-34型miRNAs，连同第21页，构成p53的重要下游效应器，介导重编程抑制。
miR-34a型和第21页合作抑制iPSC的产生a。第21页诱导于mir-34a型-/-体细胞重编程期间的MEF。逆转录病毒转导四种重编程因子三天后第21页mRNA（左）和p21蛋白（右）在WT和mir-34a型-/-MEF公司。这种增加与p53蛋白水平升高密切相关（右）。α-管蛋白（Tub）用作负荷控制。误差线、标准偏差，n个=3.b。第21页-/-MEF的扩散速度比mir-34a型-/-MEF公司。在母鼠控制的WT和mir-34a型-/-MEF（左），WT和第21页-/-MEF（右）。与WT对应物相比，第21页-/-MEF表现出增强的细胞增殖率，而mir-34a型-/-MEF显示几乎没有差异。误差线、标准偏差，n个=3，对于每个时间点的三次重复测量*P（P）< 0.05; **P（P）每种基因型两个MEF系之间的比较均<0.01。c。miR-34a型和第21页合作抑制iPSC的生成。比较WT、，mir-34a型-/-，第21页-/-，密尔-34a-/-;第21页-/-和p53基因-/-MEF使用三个（右）或四个（左）重编程因子。以下方面的不足mir-34a型或第21页仅此一项就将重编程效率提高到了可比较的水平。两者都存在缺陷mir-34a型和第21页提高了重新编程的效率。在电镀后2周（四因素诱导重编程）或3周（三因素诱导重程序），使用免疫荧光分析对Oct4-阳性菌落进行定量分析。误差线、标准偏差，n个=3.OSKM、Oct4、Sox2、Klf4和Myc；OSK，10月4日，Sox2和Klf4；MW，分子量。所有P值均基于双尾Student’st吨-测试。
p21主要通过抑制细胞增殖来抑制重编程效率12.尽管miR-34a型和p21抑制重编程效率相似()，它们对细胞增殖的影响截然不同。细胞增殖增加第21页-/-MEF非常重要()但在我们重新编程实验的时间范围内，mir-34a型-/-MEF在第6段之前几乎没有增加。我们不能完全排除以下可能性：mir-34a型-/-MEF增殖有助于增加重编程。然而与p21不同，p21对重编程的影响主要归因于其抑制细胞增殖12,miR-34a型可能主要通过独立于细胞增殖的独立机制发挥作用。这两种不同的机制可能是通过miR-34a型和第21页。
mir-34a型-/-iPSC类似于WT iPSC和ESC，表现出ESC样形态(,第1节c)表达多能性的关键分子标记。检测到高水平的Oct4、Nanog和SSEA1(,第1天).mir-34a型-/-将多能干细胞注射到免疫功能低下的裸鼠体内产生分化畸胎瘤，其中包含来自所有三个胚层的最终分化细胞类型(,第1节)。此外，四因素诱导的三条独立线mir-34a型-/-iPSC均产生健康成年嵌合体小鼠，iPSC贡献率高(,1克,表S1)。综上所述，mir-34a型缺乏可以提高iPSC的生成效率，而不会损害自我更新和多能性。
mir-34a型-/-iPSC在功能上类似于WT iPSCa。衍生自WT和mir-34a型-/-MEF在培养中表现出ES-like形态学，AP表达强烈。比例尺，左面板20μm，中面板和右面板100μm。b。WT和mir-34a型-/-iPSCs表达多潜能标记，包括核素放大的Oct4和膜定位的SSEA1。比例尺，20μm；c、 d。通配符和mir-34a型-/-iPSC均产生分化性畸胎瘤。源自四因子诱导的WT的畸胎瘤（左）和mir-34a型-/-（右）皮下注射4-6周后，从裸鼠体内获取iPSCs。H&E染色(c（c）)以及免疫荧光染色(d日)，揭示了来自所有三个胚层的最终分化细胞类型。比例尺输入c、，25微米；在里面d日，50微米。e、。四因素诱导mir-34a型-/-iPSCs可有效促进成年嵌合小鼠。我们注入了第七段的三行独立的代码10月4-Gfp/+，mir-34a-/-iPSCs进入白化的C57BL/6/cBrd/cBrd/cr囊胚。iPSC对成年嵌合体小鼠的贡献通过毛色色素沉着来确定。
尽管p53基因缺陷诱导的重新编程比mir-34a型缺陷p53基因-/-iPSC表现出受损的自我更新和分化能力1,4山中社也报道过1，我们观察到四因素诱导p53基因-/-iPSCs在培养5-6代后失去ESC样形态，并且不能产生高分化畸胎瘤。相比之下，四因素诱导mir-34a型-/-iPSCs在第26代以后保持稳定，与野生型iPSCs相比，自我更新没有显著差异(图S1f)。此外，健康成人嵌合体的产生p53基因-/-iPSC很难。百分比p53基因-/-iPSC的贡献很低，大多数嵌合体在7周前死于肿瘤发生1相反，mir-34a型-/-iPSCs表现出功能性多能性：所有三种四因子诱导mir-34a型-/-经测试的iPSC系产生了健康的成人嵌合体，iPSC的贡献率很高(,1克,表S1)，在6个月内保持无肿瘤状态（到编写稿件时）。
与这些差异一致，我们观察到四个因素诱导的p53基因-/-iPSC，但不是mir-34a型-/-或WT iPSCs未能沉默逆转录病毒转基因，因此相应的内源性基因水平较低(图S3a-S3c)。重编程因子的外源性表达，尤其是c-Myc公司(图S3e)，可能导致自我更新和分化受损(图S3d)促进肿瘤发生1相反，多能性很容易在mir-34a型-/-通过内源性转录因子回路的iPSC，使外源转基因对于维持多能性是可有可无的。
类似mir-34a型-/-iPSC，mir-34a型-/-;mir-34b/c型-/-多能干细胞还表现出强大的自我更新和分化能力，具有典型的胚胎干细胞形态、关键的多能干标记物以及生成分化畸胎瘤的能力(图S2a-S2c)。然而，他们产生嵌合体的能力仍有待确定。
重组效率的提高和多能性的降低p53基因-/-MEF可能由异常凋亡和DNA损伤反应引起4然而，mir-34a型在重编程过程中，该缺陷未能保护细胞免受细胞凋亡或DNA损伤反应的影响(图S4a-S4c)。因此，在mir-34a型-/-MEF可能反映了一种基本上独立于细胞凋亡和DNA损伤反应的机制。这些发现与mir-34a型特异性肿瘤细胞过度表达引发凋亡17,18.这些mir-34a型对凋亡的影响可能是细胞类型依赖性的，不同于原代成纤维细胞16和特定的癌细胞系17,18.细胞缺乏mir-34a型在重编程以外的条件下可能会出现凋亡缺陷。在重编程过程中缺乏凋亡保护也是可能的mir-34a型-/-MEF反映了miR-34b型和c（c）.
中增强的重新编程p53基因-细胞缺陷还归因于细胞永生化和细胞增殖增加1-5,12,15虽然细胞永生化大大促进了iPSC的生成p53基因-/-MEF公司5，增加细胞增殖是驱动随机重编程的关键机制p53基因杜兰特B细胞12.尽管mir-34型过度表达诱导原代成纤维细胞生长停滞和细胞衰老16，未观察到衰老反应缺陷mir-34a型-/-重新编程期间的MEF(图S4d和数据未显示）。如上所述，我们没有观察到由miR-34a型在我们重新编程实验的时间范围内删除。想必，miR-34a型通过一种与细胞增殖和衰老无关的机制来调节重编程效率。
为了更好地定义mir-34a型在重编程过程中，我们启动了对其靶点的搜索，特别是通过检测促进iPSC生成的基因miR-34a型结合位点。RNA22鉴定了一些预测的此类基因mir-34a型地点23(图S5d)。在所有测试的基因中，Nanog、Sox2和Mycn（N-Myc）是首选基因(,S5a系列)。三个都展出了mir-34a型-依赖性抑制(,S5c系列)，并且每一种都在促进重新编程方面有着强大的作用24,25.ESCs过表达miR-34a、miR-34b，或miR-34c型48小时内，Nanog、Sox2和N-Myc蛋白水平下降()，但mRNA丰度不变(图S5b)。Nanog、Sox2和N-Myc蛋白水平的降低不是由于ESC分化，因为Oct4（另一个多能性标记物）的水平在转染后48小时保持不变()。Sox2和Nanog蛋白水平在mir-34a型-/-iPSC和mir-34a型-/-; mir-34b/c型-/-iPSC与室友和通过控制的WT iPSC的比较()。我们还观察到mir-34a型-/-; mir-34b/c型-/-iPSC，尽管在mir-34a型-/-iPSC(和数据未显示）。实时PCR分析表明Sox2系统转基因mir-34a型-/-和mir-34a型-/-; mir-34b/c型-/-iPSC(图S3a以及未显示的数据）；因此，增加的Sox2水平纯粹是由于内源性Sox2的改变。由于WT中Oct4蛋白水平基本不变，mir-34a型-/-、和mir-34a型-/-; mir-34b/c型-/-iPSCs，我们的数据表明Sox2、Nanog和N-Myc的增加对mir-34型缺乏，而不是由于iPSC多能性的差异()。因此，当mir-34a型-缺陷细胞进行重编程，多个多能性基因的转录后去表达可能促进和加速多能性内源性调控回路的建立，从而提高重编程效率。
mir-34a型抑制Nanog、Sox2和N-Myc转录后表达a。的示意图Nanog、Sox2和N-Myc公司3’UTR和预测mir-34型结合位点。老鼠Nanog、Sox2和N-Myc公司3'UTR每个包含一个假定miR-34a型3’UTR内的结合位点。b。的强制表达式mir-34a、b和cESCs降低了Nanog、Sox2和N-Myc的蛋白质水平，但不降低Oct4的蛋白质水平。用miRNA模拟物转染无饲养者ESCsmiR-34a、miR-34b和miR-34c型和阴性对照siGFP。在转染后48小时，Western分析显示Nanog、Sox2和N-Myc的蛋白质水平显著降低，但Oct4没有降低。每个带的值表示由内部控制标准化的相对表达水平，即α-微管蛋白，在两个独立实验中取平均值，表示为平均值±标准差。c。Nanog、Sox2和N-Myc在mir-34型缺乏iPSC。在四种诱导因子中观察到Nanog和Sox2显著增加，但Oct4没有增加mir-34a型-/-iPSCs与传代匹配的、由同窝卵控制的WT iPSCs相比。对传代匹配、三因素诱导的WT和mir-34a型-/-;mir-34b/c型-/-双敲除iPSCs，观察到Nanog、Sox2和N-Myc的去表达。在这项西方分析中，每个谱带的定量由Quantity One软件进行，并根据其自身的内部微管蛋白控制标准化。每个基因型显示了三个独立iPSC系的标准误差，n个=3.d、 e、。mir-34a型缺乏的iPSCs在分化过程中表现出较慢的动力学。通配符和mir-34a型-/-iPSC都是通过在存在LIF的情况下退出LIF而触发分化的(e（电子）)或缺席(d日)RA治疗。顶部显示了每种分化状态两天后典型iPSC培养的图像(d日,e（电子）)以及对Nanog、Sox2和10月4日底部显示了对这些分化条件的反应转录本(d日,e（电子）)。误差栏、标准误差、，n个=3*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. 以d和e表示的比例尺，100μm。MW，分子量。
N-Myc公司是以前识别的miR-34a型神经母细胞瘤细胞系中的靶点，其下调通过miR-34a型3'非翻译区（UTR）内的结合位点26,27.确定是否miR-34a型直接以Sox2和Nanog为靶点，我们构建了包含这些基因的WT 3'UTR的荧光素酶报告子。两者都有Sox2系统和纳克3'UTR被外源性表达的miR-34a型在里面Dicer公司-HCT116细胞缺陷和WT ESCs(图S5c以及未显示的数据）；突变miR-34a型这些记者的结合位点严重受损miR-34a型-依赖性调节(图S5c)。这些结果表明miR-34a型直接目标Nanog、Sox2、和N-Myc公司从而阻碍iPSC的生成。有趣的是，纳克先前被鉴定为多种干细胞系统中p53介导的转录抑制的直接靶点28,29因此，p53介导纳克通过直接转录沉默和间接转录后沉默mir-34型.与角色一致miR-34a型负调控多个多能性基因，mir-34a型-/-当白血病抑制因子（LIF）退出触发iPSC分化时，无论是否存在视黄酸（RA）（–LIF和–LIF+RA），iPSC都表现出延迟的动力学。与ESC一样，WT iPSCs在–LIF或–LIF+RA条件下分化迅速，表现为细胞形态扁平化和Nanog，10月4日、和Sox2系统表达式()。相反，mir-34a型-/-iPSCs在分化过程中表现出明显的动力学延迟，表现为形态和多能性基因表达的缓慢变化()。在mir-34a型-/-多能干细胞，多能干转录因子的去表达可能会加强维持自我更新的调节电路，导致分化过程中自我更新程序的低效沉默。相反，多能性基因在mir-34a型-/-重编程过程中的MEF可以促进和加速多能性内源性调控回路的建立。我们的结果与最近的一项研究不同miR-34a型功能不影响ESC分化30这种差异可能反映了基于核苷酸的治疗效果有限miR-34a型抑制剂。
目前对多能性基因调控的研究主要集中在转录因子谱上。这种强调可能提供了一个不完整的画面，因为miRNAs的转录后基因调控可能会为这一过程增加强大和冗余的控制。miRNA的体积小，再加上它们不完美的靶点识别，使它们具有调节全球基因表达的巨大能力和多功能性31与转录因子一起，miRNAs已成为多能干细胞自我更新和分化的重要基因调节器32,33全球miRNA生物发生缺陷的ESCs表现出增殖和分化缺陷34此外，RNA结合蛋白LIN28通过抑制let-7生物成因8,35-37已被确定为人类重编程的主要因素。在旁边let-7miRNAs，许多miRNA在多能干细胞中特异性富集或缺失，并被证明调节自我更新和分化30,32,34,38-40在这里，我们确定miR-34型miRNA作为抑制p53下游重编程的新调节物，直接证明miRNA丰度的调节可能是建立多能性的关键步骤。由于miRNA功能可以由基于寡核苷酸的抑制剂或模拟物控制，我们的研究结果为通过操纵特定miRNA功能促进重编程提供了一个范例。
虽然p53直接调控数百个靶基因14,mir-34型miRNAs和p21是协同抑制iPSC生成的主要下游靶点。p53对重编程的影响反映了细胞增殖、永生化、凋亡和DNA损伤反应的变化4,5,12p21是p53的关键下游靶点，抑制细胞增殖。有趣的是，miR-34a型这种缺陷不是通过细胞增殖，而是至少部分通过转录后多能性基因的去表达来改变MEF重编程。因此，mir-34型miRNAs与包括p21在内的其他p53靶点共同通过多种关键细胞途径介导对体细胞重编程的抑制。
