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细胞研究。2013年1月；23(1): 122–130.
2012年8月21日在线发布。 数字对象标识：2012.19年10月18日
预防性维修识别码：项目经理3541667
PMID：22907667

组蛋白H3K27me3去甲基酶KDM6A和KDM6B调节最终内皮层通过调节WNT信号通路与人胚胎干细胞分化

魏江,1中，2 金兆王,1中，2和张毅（音）1中，2,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

明确的内胚层分化对于产生呼吸和胃肠器官包括胰腺和肝脏。然而，无论表观遗传监管对这一过程的作用尚不清楚。这里，我们展示了H3K27me3去甲基化酶KDM6A和KDM6B在人内皮细胞分化中起重要作用ESC。敲除KDM6A或KDM6B会损害内胚层分化，这是可以挽救的采用WNT激动剂和拮抗剂序贯治疗。KDM6A和KDM6B为WNT3和DKK1在不同分化阶段的激活分别需要肠系膜和明确的内胚层分化。我们的研究不仅揭示了H3K27me3脱甲基酶在最终内皮层中的重要作用但也揭示了他们通过调节WNT来实现这一点信号通路。

关键词：KDM6A/KDM6B，明确的内胚层分化，WNT途径调控

介绍

胚胎干细胞（ESC）是细胞治疗的潜在来源多能性和无限的自我更新能力1明确的内胚层分化是产生呼吸道和胃肠道及其所有相关器官/组织，包括胰腺和肝脏2。内胚层与中胚层和外胚层的分离是第一个细胞发展中的命运决定。确定性内胚层诱导由进化上保守的Nodal/TGF-β信号通路2,三Activin A是关键诱导剂ESC分化为最终内胚层谱系的因素4,5此外，其他分子包括WNT、FGF、BMP和PI3K在内的信号通路也被证明有助于内胚层分化6。有趣的是，不同的人类ESC株也表现出不同的谱系特异性分化能力由于遗传和表观遗传的差异7。尽管生长因子，如激活素A，可以有效地诱导定形内胚层与人类ESCs的分化，潜在机制，尤其是表观遗传其机制在很大程度上尚不清楚。

组蛋白甲基化在包括转录8.尽管组蛋白甲基化Polycomb抑制复合物2在基因激活和抑制中都起作用（PRC2）介导的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）主要与转录抑制9。鉴于沉默ESCs中谱系特异性分化基因的H3K27甲基化H3K27me3标记可被脱甲基酶主动去除，H3K17me3脱甲基酶可能发挥作用在推动ESC分化方面发挥着重要作用。事实上，KDM6A（也称UTX）和KDM6B（也被命名为JMJD3）已被证明参与正常情况下的转录激活发展10,11,12,13最近，Kdm6a和Kdm6b也被证明发挥了重要作用在心脏中的作用14和M2巨噬细胞15分别进行开发。以前的研究有发现ESCs含有二价染色质结构域，它们都具有抑制性（H3K27me3）和活性（H3K4me3）标记以及这些二价结构域在保持自我更新和差异化之间的平衡16,17,18在这里，我们证明KDM6A和KDM6B有助于确定通过调节WNT信号通路实现内胚层分化。

结果和讨论

H3K27me3脱甲基酶KDM6A和KDM6B在最终内皮层上调区别

我们一致发现，最终内胚层基因的表达水平是激活素A治疗后，多能性基因显著增加，而多能性基因显著减少HUES8 ESC的(补充信息，图S1A-S1B型). 因为激活素A诱导的分化不产生均质细胞群(补充信息，图S1B级)，我们使用CD184（也称为CXCR4），这是一种众所周知的权威内胚层标记4,19,20,21，对细胞群进行分类并确认成功的内胚层RT-qPCR分析鉴别(补充信息，图S1C). 除CD184外，另一份报告20使用CD184和CD117（也称为c-KIT）来标记确定的内胚层细胞群。有趣的是，我们发现CD184+细胞在我们的分化系统中几乎总是CD117+(补充的信息，图S1D). 这些分析证实CD184可以作为人类胚胎干细胞分化中最终内胚层分化的标志物系统。

探讨H3K27me3相关酶在最终内胚层中的潜在作用分化，我们询问这些酶是否富含纯化的决定性物质内胚层细胞。RT-qPCR分析证明了两者KDM6A系列和KDM6BCD184阳性细胞的水平显著高于CD184-阴性细胞群(图1A,P（P）<0.05). 相比之下EZH1型或EZH2型在这两个细胞群之间检测到(图1A). 与潜在角色一致KDM6A系列和KDM6B在内胚层分化中，我们发现两者都上调（>KDM6B为20倍，KDM6A为～3倍）(图1B)。

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KDM6A和KDM6B有助于从人类胚胎干细胞中分化出明确的内胚层。（A）分化后4天，CD184阳性最终内皮细胞和分析CD184阴性细胞以比较H3K27me3的基因表达水平甲基转移酶(EZH1型和EZH2型)和去甲基酶(KDM6A系列和KDM6B). 这个P（P）值是从三个独立的实验。CD184-阴性细胞的表达水平设为1。（B）的相对表达水平KDM6A系列和KDM6B在6天活动期间A诱导最终内胚层分化。未分化细胞的表达水平人类ESCs设置为1。（C）代表性流式细胞术数据显示对照组和KDM6A或KDM6B击倒ESCs的CD184阳性细胞百分比4天最终内皮分化。（D）量化对照组CD184阳性细胞群和KDM6A或KDM6B在4天时击倒ESCs明确的内胚层分化。统计值为#P（P）>0.05;*** P（P）< 0.001.（E）内胚层表达水平的RT-qPCR分析对照组和KDM6A或KDM6B中的标记在4天确定后击倒人类ESC内胚层分化。（F）野生型小鼠Kdm6b的强制表达，但不是其催化突变体，可以挽救KDM6B的内胚层分化缺陷击倒。上面板显示野生型和突变体Kdm6b；下部面板显示KDM6B敲除中CD184阳性细胞的百分比4天后转染对照、野生型或催化突变小鼠Kdm6b的细胞激活素A治疗。统计值为#P（P）> 0.05;** P（P）< 0.01;*** P（P）< 0.001.

KDM6A或KDM6B基因敲除损害最终的内胚层分化

为了探讨KDM6A和KDM6B在内胚层分化中的潜在作用，我们产生的慢病毒shRNA敲除构建靶向KDM6A系列或KDM6B建立了稳定的KDM6A和KDM6B敲除细胞系。RT-qPCR分析表明，我们在这些细胞系中实现了60%-70%的敲除(补充信息，图S2). 评估是否敲除KDM6A或KDM6B会影响最终的内胚层分化KDM6A或KDM6B击倒细胞株以进行激活素A治疗。FACS分析表明KDM6A或KDM6B敲除细胞系CD184阳性率较低单元格与控件进行比较(图1C-1D)指示内皮分化受损。RT-qPCR分析显示内胚层标记基因表达减少，如FOXA2公司,GATA6协议,GSC公司,国家编目局和SOX17标准，KDM6A或KDM6B击倒时(图1E). FACS分析和免疫荧光染色KDM6A或KDM6B敲除后证实内皮分化受损(补充信息，图S3). 为了证明击倒效应是特定的，并评估H3K27me3脱甲基酶KDM6的活性是有效的内胚层分化所必需的，我们试图野生型和催化突变小鼠修复内胚层分化缺陷丹麦马克6b。结果如所示图1F证明这一点野生型，但不是催化突变型，Kdm6b部分拯救了内胚层分化缺陷。这一结果不仅证实了敲除的特异性，而且也表明KDM6的去甲基化酶活性对内胚层很重要区别。

内胚层分化缺陷与WNT信号缺陷有关

KDM6A或KDM6B缺失会损害定形内胚层分化提示我们询问缺陷是否是由ESC维护缺陷引起的。KDM6A或KDM6B击倒ESC的特征表明它们表现正常人类ESC形态，并表达多能性标记，如NANOG、SOX2、SSEA4和华侨城4号(补充信息，图S4A和S4C系列). RT-qPCR分析表明多能性基因或三种生殖层谱系标记的表达水平不是KDM6A或KDM6B敲除细胞发生显著改变(补充信息，图S4B). 与最近的报告一致证明Utx基因敲除不会影响小鼠ESC多能性14这些研究表明KDM6A或KDM6B不影响人类ESC维护。然后我们询问KDM6A或KDM6B敲除影响对内胚层分化重要的信号通路。

WNT、BMP和FGF信号通路在调节内胚层分化6.确定这些信号通路中的一条与由以下因素引起的内胚层分化缺陷有关KDM6A或KDM6B基因敲除，我们询问是否可以克服分化缺陷通过这些途径的激动剂治疗。我们发现WNT激动剂，但不是BMP或FGF激动剂部分挽救了内胚层分化缺陷表型(图2A)，表明WNT途径可能相关。与这一概念一致，对之前ChIP-seq结果的分析16,17属于人类胚胎干细胞中富含H3K27me3的基因表明WNT信号通路富含H3K27me3(补充信息，图第5章,P（P）=0.00007），使WNT途径的基因可能相关KDM6A或KDM6B法规的目标。因此，我们将注意力集中在WNT上通路。

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KDM6A/KDM6B通过调节WNT促进最终内皮分化信号通路。（A）KDM6A或KDM6B敲除导致的内胚层分化可以通过添加生长因子Wnt3a（10和50）来部分挽救缺陷而不是bFGF（2和10 ng/ml）或BMP4（5 ng/ml分化程序。统计值为* P（P）< 0.05;** P（P）< 0.01;*** P（P）< 0.001.（B）KDM6A或KDM6B击倒型内胚层添加WNT激动剂Wnt3a（50 ng/ml）可以挽救分化缺陷在第一个2天分化或添加WNT拮抗剂Xav939（1μM）时基于激活素A的晚期2天分化内胚层分化。4天后测量CD184阳性细胞的百分比分化并在各种处理中呈现。统计值为#P（P）> 0.05;* P（P）< 0.05;** P（P）< 0.01;*** P（P）< 0.001.

KDM6A/KDM6B通过调节促进最终的内胚层分化WNT途径

在人类ESCs中，Wnt/β-catenin信号的激活促进了自我更新能力的丧失并推动中胚层谱系分化22。此外，Wnt3a在第一天被用于促进肠系膜的分化但在后期被移除23.这些研究表明，肠系膜分化需要WNT信号，但该途径的持续激活将导致中胚层分化。一致因此，我们发现抑制WNT信号也可以促进确定从人类ESC衍生肠系膜的内胚层分化（见以下数据）。鉴于WNT信号在肠系膜和进一步明确的内胚层分化中的作用，我们被问及在不同分化阶段操纵WNT信号是否可以挽救KDM6A/KDM6B基因敲除引起的内胚层分化缺陷。FACS分拣激活素A诱导CD184阳性细胞群的定量不同WNT激动剂（Wnt3a）或拮抗剂（Xav939）下的内胚层分化处理表明，KDM6A或KDM6B敲除引起的分化缺陷可以通过在早期分化阶段使用WNT激动剂来挽救(图2B，比较A-A和AW-A治疗）或部分WNT拮抗剂在分化后期的拯救作用(图2B，比较A-A和A-AX治疗）。在这种情况下WNT激动剂和拮抗剂的序贯治疗缺陷完全修复(图2B，将A-A与AW-AX处理）。这些结果表明，KDM6A和KDM6B在内胚层分化在很大程度上是通过WNT信号通路介导的。

WNT3是KDM6A/KDM6B靶点，参与内胚层早期发育区别

结果显示于图2B证明消耗KDM6A或KDM6B在分化早期损害WNT信号，但在分化后期增强WNT信号传导，这表明KDM6A/KDM6B靶基因可能介导早期和晚期分化效应，分别是。因为KDM6A和KDM6B去除了H3K27me3抑制标记，它们很可能基因激活功能。考虑到WNT激动剂在早期分化期和WNT拮抗剂在分化后期可以部分救援受损的最终内胚层分化表型，很可能是KDM6A/KDM6B早期上调WNT激活物，晚期上调WNT阻遏物内胚层分化阶段。

为了在早期识别KDM6A/KDM6B的靶基因，我们分析了其表达人类胚胎干细胞中富集H3K27me3的14个WNT配体基因(补充信息，图S5). 在这些基因中，只有有7个是可检测的。其中，WNT3号机组在1天内表现出最高的上调分化的(图3A). 与概念一致那个WNT3号机组是一个重要的KDM6A/KDM6B目标，击倒KDM6A或KDM6B向下调节WNT3型表达式(图3B). 在此外，ChIP分析表明，H3K27me3水平WNT3号机组基因启动子KDM6A或KDM6B击倒后增加，而H3K4me3水平不显著改变，与KDM6A/KDM6B的H3K27me3脱甲基酶活性一致(图3C). 重要的是，当WNT3号机组击倒ESCs(补充信息，图S6，左侧面板）是经过内胚层分化，他们表现出内胚层分化缺陷类似于KDM6A或KDM6B击倒ESC(图3D). 这个分化缺陷可以通过WNT激动剂治疗来挽救，支持WNT3在内胚层分化中的作用(图3D)。总的来说，这些结果表明WNT3号机组是重要的KDM6A/KDM6B在内胚层早期介导KDM6A/KDM6B功能的靶点区别。

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WNT3是KDM6A/KDM6B靶点，有助于早期内胚层分化。（A）7个富含H3K27me3的WNT配体基因表达的RT-qPCR分析明确的内胚层分化。WNT2型,WNT2B型,WNT5B型,WNT6系列,WNT9B、WNT10A和WNT16型无法检测到。表达式级别与第0天相关。提供的数据是三个数据的平均值用误差棒进行独立实验。（B）RT-qPCR分析证明下调WNT3号机组KDM6A或KDM6B击倒时的表达。（C）ChIP分析显示H3K27me3水平增加，但H3K4me3水平没有增加WNT3型KDM6A或KDM6B敲除后的基因启动子。进行了分析分化开始时。（D）激活素A诱导的内胚层WNT3基因敲除损害了分化，而WNT3的敲除可以通过添加来挽救WNT激动剂Wnt3a。通过量化衡量分化效率基于激活素A的内胚层4天后CD184阳性细胞群的表达区别。

DKK1是KDM6A/KDM6B靶点，对后期内胚层起作用区别

使用类似的策略，我们分析了4个WNT拮抗剂基因的表达模式人类胚胎干细胞中H3K27me3富集(补充的信息，图S5). 我们发现只有DKK1（丹麦克朗）展示了一个分化后期的显著上调(图4A级). 与以下概念一致：DKK1（丹麦克朗）是一个重要的KDM6A/KDM6B目标，击倒KDM6A或KDM6B将导致DKK1（丹麦克朗）下调监管(图4B). 此外，ChIP分析表明H3K27me3液位DKK1（丹麦克朗）基因增强子（扩增子#1），但不是其转录起始位点（扩增子#2）在KDM6A或KDM6B敲除后增加，而H3K4me3水平没有显著改变(图4摄氏度)与KDM6A/KDM6B的H3K27me3脱甲基酶活性一致。重要的是，当DKK1（丹麦克朗）击倒ESC(补充的信息，图S6，右面板）受到内胚层的影响分化，表现出类似KDM6A或KDM6B的内胚层分化缺陷击倒ESC(图4D). 这种分化缺陷可以晚期通过外源性WNT拮抗剂Xav939治疗获救分化(图4D). 总的来说，这些结果证明这一点DKK1（丹麦克朗）是一个重要的KDM6A/KDM6B靶点，介导KDM6A/KDM6B在内皮分化后期的功能。

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DKK1是KDM6A/KDM6B靶点，有助于晚期内胚层分化。（A）RT-qPCR分析H3K27me3富集的WNT拮抗剂基因在明确的内胚层分化。SFRP4系统无法检测到。表达式级别与第0天相关。给出的数据是三个独立实验的平均值带有误差条。（B）RT-qPCR分析显示DKK1（丹麦克朗）KDM6A或KDM6B击倒时的表达。（C）ChIP分析表明H3K27me3水平增加，但H3K4me3水平没有增加DKK1（丹麦克朗）基因KDM6A或KDM6B击倒时的增强型。分析是在分化的第二阶段。（D）激活素A诱导的内胚层DKK1基因敲除损害了分化，可以通过添加WNT拮抗剂Xav939在分化后期。差异化过程包括激活素A和Wnt3a的2天治疗，然后用或不带Xav939。分化效率通过量化分化4天后CD184阳性细胞群。

在本研究中，我们证明H3K27me3脱甲基酶KDM6A和KDM6B有助于从人类胚胎干细胞到最终的内胚层分化。事实上WNT激动剂和拮抗剂治疗可挽救内皮分化缺陷由KDM6A或KDM6B敲除引起的结果表明KDM6A和KDM6B参与了内胚层通过调节WNT信号通路分化。进一步分析表明KDM6A和KDM6B在WNT3和DKK1的早期激活和内胚层分化的晚期。与以下概念一致：KDM6A和KDM6B在调节WNT信号通路中起重要作用，敲除KDM6A/KDM6B还干扰了其他WNT靶基因在对内胚层分化的反应(补充信息，图S7). 这些结果使我们能够提出一个工作模型来解释KDM6A/KDM6B如何参与内胚层分化过程(图5). 看来人类的低KDM6A/KDM6B水平ESCs通过抑制WNT3的表达，帮助维持WNT3在基础水平的表达将H3K27me3标记为低水平。当用激活素A等内胚层诱导剂治疗时，KDM6A和KDM6B上调，导致H3K27me3抑制标记去除导致上调WNT3号机组基因表达。WNT3上调原因WNT通路的激活，促进肠系膜细胞分化激活素A的存在。在最终内胚层分化的晚期，WNT拮抗基因，如DKK1（丹麦克朗）KDM6A/KDM6B在类似的抑制肠系膜到最终内胚层WNT信号通路的方式微分(图5). KDM6A/KDM6B耗竭损伤WNT3和DKK1的激活导致最终内皮分化受损。未来的研究应揭示KDM6A/KDM6B如何实现WNT3的精确时间控制和DKK1法规。

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解释KDM6如何促进最终内胚层形成的假设模型区别。激活素A治疗人胚胎干细胞会激活KDM6A和KDM6B，可以靶向并消除H3K27me3抑制标记，导致WNT3.WNT3增加导致WNT途径激活并促进肠系膜区别。在内皮分化后期，WNT拮抗基因DKK1型KDM6A和KDM6B以类似方式激活以抑制WNT肠系膜到最终内胚层分化的信号通路。我，肠系膜；DE，明确的内胚层。

最终内胚层承诺主要由TGF-β超家族控制成员，Nodal/activin A，激活SMAD2/3和SMAD4转录复合物驱动靶基因表达三。它已经最近报道，激活素A治疗导致KDM6B的募集内胚层期间SMAD2/3靶位点H3K27me3减少区别24。在这里我们扩展了这个通过揭示WNT基因作为KDM6A和KDM6B的靶标最终内胚层分化的调控。事实上，击倒了KDM6A/KDM6B靶向WNT3和DKK1，即使激活素A信号仍处于激活状态表明KDM6A/KDM6B介导WNT信号的激活对内胚层分化很重要。我们的研究不仅揭示了一个新的功能KDM6A/KDM6B在内胚层分化中的作用分化过程。

材料和方法

生成可拆卸的人类ESC线路

人类ESC株HUES8（第40-60代）在Matrigel-coated培养皿中培养mTeSR1介质符合手册（STEMCELL Technologies）。慢病毒载体该系统来自NIH艾滋病研究和参考试剂项目。老鼠将U6-shRNA盒插入pTY转导载体。19-nt siRNA靶向针对人类KDM6A或KDM6B的位点如下：KDM6A-KD1，GGAAATTCATTTACGACTT；KDM6A-KD2，GGAGTCTGTAATTTCAAA；KDM6B-KD1，GCATCTATCTGGAGAGCAA；KDM6B-KD2，关贸总协定；KDM6B-KD3，GCTCTGGAACTTCATACT公司；控制-KD，ggaacttattagcaactt。WNT3号机组和DKK1（丹麦克朗）击倒从Open Biosystems购买载体并进行验证（克隆ID:TRCN000003381和TRCN000003382用于WNT3号机组; TRCN000003385用于DKK1（丹麦克朗）). 慢病毒感染后转染后，用2μg/ml嘌呤霉素筛选稳定的敲除细胞在含有耐嘌呤霉素盒的结构上。

确定内胚层分化

为了明确的内胚层分化，将培养在Matrigel上的人胚胎干细胞进行清洗用DMEM/F12培养两次，然后在基础培养基（DMEM/F12,55μM2-巯基乙醇，1%（vol/vol）非必需氨基酸，0.5%（vol/vol）B27，无维生素A（Invitrogen），0.25%（vol/vol）N2（Invit罗gen）），补充100 ng/ml激活素A（PeproTech）和/或其他生长因子和化学物质。增长本研究中使用的因子和化学品包括小鼠Wnt3a（PeproTech，10-50 ng/ml），bFGF（PeproTech，2-10 ng/ml）、BMP4（研发，1-10 ng/ml）和XAV939（Tocris，0.5-1μM）。

流式细胞术

使用0.05%胰蛋白酶-EDTA或Accutase将细胞分离成单细胞悬浮液（干细胞技术）。为了标记细胞表面抗原，培养细胞带有一级抗体（APC结合小鼠抗人CD184 IgG，BD；PE结合小鼠抗人CD117 IgG，BD）或冰镇FACS缓冲液中的对照同型（2%（vol/vol）PBS中的FBS）清洗30-45分钟，然后清洗两次。然后分析细胞标记使用流式细胞仪FACSAria II和FACSDiva软件6.0版（BD Biosciences）并对阳性或阴性细胞进行分类，以便进一步实验。

RNA提取和定量RT-PCR

使用Qiashredder和RNeasy迷你试剂盒从细胞培养物中提取总RNA（Qiagen），并按照制造商的说明。逆转录总RNA（约1-2μg/20μl反应）使用SuperScript™II逆转录酶（Invitrogen）以随机六聚体寡核苷酸（Promega）。在CFX384上进行定量PCR根据制造商的说明。相对表达水平归一化为GAPDH和使用2计算-ΔCt方法。所有引物均已购买来自Invitrogen并在中列出补充信息，表S1（第一阶段）。

ChIP-qPCR

对于ChIP分析，未分化的人类ESCs或敲除的分化细胞或对照使用Imprint用于H3K27me3或H3K4me3或H3-ChIP®染色质免疫沉淀试剂盒（Sigma）符合制造商的说明。使用的抗体均为多克隆兔IgG，包括抗H3K27me3抗体（Millipore）、抗H3K4me3（Millipore）和抗H3（Abcam）。进行定量PCR如上所示。引物是根据公布的H3K27me3 ChIP-seq设计的数据16,17和在中列出补充信息，表S2。

更详细的方法如所示补充信息、数据S1（第一阶段）。

致谢

我们感谢我们实验室的同事：Jin He博士在慢病毒转染和提供小鼠Kdm6b cDNA和突变体构建物；山口申培博士图5; 金河博士和梁高阳博士批判性阅读手稿。这项工作得到了NIH U01DK089565的支持。YZ是霍华德·休斯医学院。

脚注

(补充信息已链接到联机论文的版本细胞研究网站。）

补充信息

补充信息，图S1

在人类胚胎干细胞系HUES8中成功诱导了确定性内胚层。

补充信息，图S2

RT-qPCR定量测定稳定KDM6A（左）和KDM6B的敲除效率（右）击倒HUES8细胞株。

补充信息，图S3

KDM6A/KDM6B敲除细胞在整个过程中表现出内胚层分化受损分化过程。

补充信息，图S4

KDM6A或KDM6B击倒不影响ESC维护

补充信息，图S5

大卫·凯格(网址：http://david.abcc.ncfcrf.gov“>）信号通路分析来自两份独立报告的人类ESCs中重叠的H3K27me3标记基因（Pan等人。2007; Zhao等人，2007年）。

补充信息，图S6

RT-qPCR定量测定稳定的敲除效率WNT3号机组（左）和DKK1（丹麦克朗）（右）击倒HUES8细胞株。

补充信息，图S7

KDM6A/KDM6B敲除改变最终内胚层下WNT靶基因的表达分化条件。

补充信息，表S1

RT-PCR定量表达分析引物。

补充信息，表S2

ChIP-qPCR的基因组引物。

补充信息，数据S1

方法

工具书类

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文章来自细胞研究由以下人员提供自然出版集团