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自噬。2012年12月1日；8（12）：1811年至1821年。
数字对象标识：10.4161/自动22145
预防性维修识别码：项目经理3541290
PMID：23051914

通过涉及TRAF2和RIPK1/RIP1介导的MAPK8/JNK活化的自噬生存途径减轻TNFSF10/TRAIL诱导的凋亡

魏阳河,1,2,三 王琼（音）,三 詹宁斯·徐,三 徐秀玲,三 梅贝尔·T·帕迪拉,三 任国盛,2,* 新沟,1,*和永林三,*
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摘要

虽然已知肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFSF10/TRAIL）诱导自噬，但TNFSF10激活自噬的机制仍不清楚。在本报告中，我们证明TRAF2和RIPK1介导的MAPK8/JNK激活是TNFSF10诱导细胞保护性自噬所必需的。TNFSF10在来自肺、膀胱和前列腺肿瘤的癌细胞系中快速激活自噬。以关键自噬因子BECN1/Beclin 1或ATG7为靶点的药物抑制剂或siRNAs阻断自噬，可有效增强TNFSF10诱导的凋亡细胞毒性，证实TNFSF10-诱导的自噬具有细胞保护作用。阻断MAPK8而非NFκB有效地阻断了自噬，表明MAPK8是TNFSF10诱导自噬的主要途径。此外，阻断MAPK8可有效抑制BCL2L1/Bcl-xL的降解，并减少抑制自噬的BCL2L1–BECN1复合物。敲除TRAF2或RIPK1可有效抑制TNFSF10诱导的MAPK8活化和自噬。此外，抑制自噬抑制抗凋亡因子BIRC2/cIAP1、BIRC3/cIAP2、XIAP和CFLAR/c-FLIP的表达，并增加TNFSF10诱导的死亡诱导信号复合物（DISC）的形成。这些结果揭示了MAPK8激活途径通过TRAF2和RIPK1在TNFSF10诱导的自噬中的关键作用，该自噬可钝化癌细胞的凋亡。因此，抑制MAPK8介导的自噬可用于肿瘤细胞对TNFSF10治疗的敏化。

关键词：自噬、MAPK8/JNK、RIPK1/RIP1、TRAF2、TNFSF10/TRAIL、凋亡

介绍

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL/TNFSF10）是一种有前途的抗癌药物，目前正在进行临床前和临床研究，用于治疗包括肺癌在内的实体瘤。1-4TNFSF10单独或与其他化疗药物联合通过诱导凋亡显示出良好的抗癌活性。4然而，已有文献证明肿瘤细胞对TNFSF10的原发性或获得性耐药性，TNFSF10-耐药性的分子基础尚不清楚。5-7因此，了解肿瘤细胞中TNFSF10耐药的潜在机制对于提高TNFSF10-作为抗癌治疗药物的价值至关重要。

TNFSF10通过与其功能性死亡受体、死亡受体（DR）4（TNFRSF10A/TRAIL-R1）和DR5（TNFRSF10B/TRAIL-R2）结合，激活外源性凋亡途径，诱导肿瘤细胞凋亡。TRAIL还激活c-Jun N-末端激酶（MAPK8/JNK）和转录因子核因子-κB（NFκB）。1TNFSF10与TNFRSF10A或TNFRSF10B的连接促进了死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，该复合物由死亡受体FADD、CASP8/胱天蛋白酶-8和CFLAR/c-FLIP组成。通过自分裂过程，CASP8在DISC中被激活，以触发下游效应caspase的激活，如CASP3/caspase-3和CASP7/caspase-7。8在CASP8-CASP3信号级联较弱的细胞中，TNFSF10的凋亡效应需要CASP8介导的BH3-only BCL2/Bcl-2家族成员BID的裂解来激活固有的凋亡途径。8有一些机制可以严格控制TNFSF10诱导的凋亡，癌细胞利用这些机制来抵消TNFSF10-的细胞毒性。这些包括NFKB激活以上调抗凋亡因子的表达，如CFLAR和BIRC2，9,10诱饵受体（DcR）1（TNFRSF10C/TRAIL-R3）和DCR2（TNFRSF10D/TRAIL-R4）竞争性抑制TNFRSF1A/B，以及骨保护素（TNFRFS11B/OPG）抑制介导凋亡的功能性椎间盘的形成。11此外，我们还发现了一种由EGFR、CFLAR、MCL1、PTGS2/Cox-2和TGM2组成的细胞信号通路，用于获得性TNFSF10耐药性。12-14

自噬是一种细胞内分解代谢过程，涉及长寿命蛋白质和细胞器的降解和再循环，这对于营养缺乏条件下的细胞生存以及通过去除耗尽的、多余的和不需要的细胞成分进行内务管理都很重要。15,16然而，在某些情况下，自噬会导致细胞死亡。15,16在自噬过程中，细胞溶质首先被一个双层膜囊泡隔离，形成称为自噬体的自噬液泡，然后与溶酶体融合形成自溶体，其中隔离的成分被溶酶体酶降解。15,16自噬过程受自噬因子调控，如ATG7、ATG5和BECN1，它们在不同阶段发挥关键作用。15,16抗凋亡BCL2家族蛋白（如BCL2和BCL2L1/BCL-xL）与BECN1结合以抑制自噬，并且这些BCL2家庭蛋白从BECN1中的分离促进自噬。17根据自噬在细胞死亡控制中的矛盾作用，自噬对癌细胞对化疗反应的影响也很复杂：要么防止要么促进治疗性死亡。18-20

据报道，TNFSF10能够在某些癌细胞中诱导自噬，21通过减弱TNFSF10的细胞毒性来保护它们，并可能促进TNFSF10-耐药性。22然而，TNFSF10如何诱导自噬尚未阐明。在本报告中，我们研究了TNFSF10诱导的细胞自噬诱导信号通路，发现TRAF2和RIPK1介导的MAPK8激活对TNFSF10-诱导自噬至关重要。此外，我们发现抑制自噬促进TNFSF10 DISC的形成，抑制抗凋亡因子，并增强TNFSF10-诱导的癌细胞凋亡。因此，抑制MAPK8介导的自噬可能是一种有用的方法，可以使肿瘤细胞对TNFSF10治疗敏感。

结果

TNFSF10诱导不同肿瘤细胞自噬

我们首先研究了TNFSF10是否能够在来源于不同人类肿瘤的癌细胞中诱导自噬。早在TNFSF10治疗后1 h，膀胱癌细胞株UM-UC3、肺癌细胞株A549和前列腺癌细胞株PC3中即可检测到MAP1LC3B-I（LC3B-1）向MAP1LC2B-II（LC3B-II）的转化，这是自噬的标志(图1A和B;图S1A). 与自噬诱导一致，TNFSF10处理的细胞中自噬蛋白SQSTM1/p62的表达水平逐渐降低(图1A和​和B；B类;图S1A). 为了进一步证实观察到的MAP1LC3B和SQSTM1的变化是由自噬引起的，进行了MAP1LC3G和SQST M1周转试验以检测自噬通量。在本实验中，使用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）来确定TNFSF10是否增加MAP1LC3B-II的生成，而不仅仅是抑制MAP1LC3-II的清除。在所有三种细胞系中，虽然TNFSF10或氯喹单独导致MAP1LC3B-II中度增加，但与TNFSF10-氯喹共同孵育的细胞进一步提高了MAP1LC2B-II的表达(图1C和D;图S1B). 同样，CQ也有效地阻止了TNFSF10诱导的SQSTM1减少(图1C和D). 这些自噬通量结果强烈表明TNFSF10在癌细胞中诱导自噬。23此外，通过转染GFP-LC3质粒，我们在A549细胞中检测了TNFSF10处理后MAP1LC3B点形成，这是自噬的另一个特征。事实上，TNFSF10通过增加细胞内MAP1LC3B点和MAP1LC2B点的形成，显著增加了细胞数量(图1E和F).24综上所述，这些结果强烈表明TNFSF10在不同类型的人类癌细胞中诱导自噬。

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图1。TNFSF10在癌细胞中诱导自噬。(A和B)用TNFSF10处理细胞（UM-UC-3200 ng/ml用于A549，150 ng/ml用来PC-3）指定时间。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(C和D)用氯喹（CQ，20μM）预处理细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理2 h（MAP1LC3B）和8 h（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(E类)稳定转染GFP-LC3的A549用TNFSF10（200 ng/ml）处理1小时或保持未处理状态。照片是在荧光显微镜下拍摄的。(F类)用GFP-LC3点（左）和每个阳性细胞的点数量量化细胞数量。所示数据为平均值±标准差*p<0.01

自噬保护癌细胞对抗TNFSF10诱导的细胞毒性

为了确定自噬在TNFSF10诱导的癌细胞毒性中的作用，我们首先使用不同的自噬抑制剂沃特曼（WTM）、3-甲基腺嘌呤（3MA）和CQ，在自噬途径的不同步骤阻断自噬。23虽然抑制剂本身几乎没有细胞毒性，但它们显著增加了TNFSF10在所有三种癌细胞系中诱导的细胞死亡(图2A和B;图S1C). 3MA和沃特曼宁均能阻断TNFSF10诱导的自噬，其表现为基础MAP1LC3B-II和自噬通量降低(图2C;图S2). 为了进一步证实这些观察结果，siRNA靶向自动液位计7或BECN1公司用于阻断自噬。敲除ATG7或BECN1，这已通过western blot证实(图2D)，有效增强了TNFSF10诱导的细胞毒性(图2D). 这个BECN1公司和自动液位计7siRNAs有效阻断TNFSF10诱导的MAP1LC3B-II升高(图2E). 这些结果与之前的报道一致，即TNFSF10诱导的自噬是一种细胞保护信号，可对抗TNFSF10-诱导的细胞死亡。22,25,26

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图2。自噬保护癌细胞免受TNFSF10诱导的细胞毒性。(A和B)用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或沃特曼（1μM）预处理细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）处理细胞24 h。通过LDH释放试验测定细胞死亡。(C类)用不同抑制剂（CQ，20μM；沃特曼，1μM；3MA，10 mM）预处理UM-UC-3细胞30 min，然后分别用TNFSF10（60 ng/ml）再处理2 h（MAP1LC3B）和8 h（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。(D类)用指示的siRNAs（10 nM）转染上层UM-UC-3细胞24 h，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理24 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。用指示的siRNAs（10 nM）转染低级UM-UC-3细胞24小时。通过western blot检测指示的蛋白质。(E类)用指示的siRNAs（10 nM）转染UM-UC-3细胞24小时，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理2小时（MAP1LC3B）和8小时（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。ACTB被检测为负载控制。

自噬抑制TNFSF10诱导的凋亡信号

然后，我们检查了阻断自噬是否影响TNFSF10诱导的外源性细胞凋亡途径的激活。当用wortmannin预处理UM-UC-3和A549细胞时，TNFSF10诱导的CASP8和CASP3的激活被强烈增强。与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活一致，PARP1（凋亡的生物标志物）的裂解也显著增强(图3A和C). 以GST-TNFSF10为配体，进行了GST下拉实验，以检测TNFSF10DISC的形成。如所示图3B和D，用氯喹阻断自噬显著增加了FADD和CASP8的募集以形成DISC。这些结果表明，自噬通过抑制TNFSF10诱导的凋亡信号，至少部分地减弱了TNFSF10-的细胞毒性。

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图3。自噬抑制TNFSF10诱导的凋亡信号。(A和B)用沃特曼（1μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测CASP8、CASP3和PARP1。GADPH被检测为负载控制。(C和D)通过GST下拉分析检测DISC形成。用CQ（20μM）预处理细胞30分钟，然后用GST-TNFSF10（A549为60 ng/ml和200 ng/ml）处理15分钟或不处理。将GST-TNFSF10（60 ng/ml）添加到来自未刺激细胞的裂解物中，以沉淀未刺激的TNFSF10-受体。通过western blot分析GST-TNFSF10结合蛋白是否存在TNFRSF10B、FADD和CASP8。检测GADPH作为负荷和阴性对照。

抑制MAPK8激活抑制TNFSF10诱导的自噬并增强TNFSF10's细胞毒性

为了确定参与TNFSF10诱导自噬的信号通路，我们使用MAPK8和NFκB的特异性抑制剂来干预自噬诱导。MAPK8抑制剂完全消除了TNFSF10诱导的自噬(图4A和B;图S3). 相反，NFκB阻断剂IKB抑制剂对TNFSF10诱导的自噬作用不大(图4A和B). 这些抑制剂有效地抑制了各自的途径(图4A和B).14与自噬的细胞保护作用一致，阻断MAPK8也显著增强了TNFSF10诱导的细胞死亡(图4C和D). 此外，阻断MAPK8可增强TNFSF10诱导的细胞凋亡，这表现为CASP8活化和PARP1断裂的增强(图4E). 这些结果表明MAPK8是TNFSF10诱导细胞保护性自噬的主要途径。

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图4。抑制MAPK8活化可抑制TNFSF10诱导的自噬并增强TNFSF10-的细胞毒性。(A和B)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；IKB抑制剂，50μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30分钟，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理1小时。用western blot检测磷酸化MAPK8和MAP1LC3B。ACTB被检测为负载控制。(C和D)用SP600125（10μM）预处理UM-UC-3和A549细胞30分钟，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理24小时。通过LDH释放测定检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。(E类). 用SP600125（10μM）预处理UM-UC-3细胞30 min，然后用TNFSF10（60 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测CASP8和PARP1。ACTB被检测为负载控制。

MAPK8通过降解BCL2L1和减少BCL2L1-BECN1复合物介导自噬

在饥饿诱导的自噬中，MAPK8磷酸化前存活的BCL2蛋白家族，以破坏这些蛋白与BECN1的复合物，从而促进自噬的启动。27因此，我们检查了TNFSF10诱导的MAPK8激活是否调节了前生存BCL2家族的蛋白质。早在TNFSF10治疗后1小时，就检测到BCL2L1表达水平下降。MCL1表达轻微下降，而BCL2基本未受影响(图5A;图S4A). BCL2L1的降解被CQ阻断溶酶体降解而非z-VAD阻断半胱天冬酶抑制(图S4B)这表明这种降解不太可能是caspase介导的裂解的结果。28抑制MAPK8而非NFκB可恢复BCL2L1水平，这表明MAPK8介导的TNFSF10诱导的BCL2L2L1降低(图5B). MAPK8或NFκB的抑制对MCL1和BCL2的表达水平几乎没有影响(图5B). 因为MAPK8使BCL2L1和BECN1的复合体分离，从而触发自噬，29,30我们通过免疫沉淀法检测TNFSF10是否诱导BCL2L1和BECN1复合物的还原。结果表明，BECN1与BCL2L1组成性结合，TNFSF10处理后BCL2L2L1表达减少(图5C;图S4C). 有趣的是，当MAPK8被阻断时，BECN1–BCL2L1相互作用的减少被恢复，这与BCL2L2L1表达的恢复有关(图5D;图S4D). 虽然也检测到BECN1–BCL2复合物，但TNFSF10对该复合物没有检测到影响(图5C和D;图S4C和S4D). 相反，没有MCL1与BECN1共免疫沉淀，这表明BECN1和BCL2L1的相互作用专门参与了TNFSF10诱导的自噬调节。这些结果表明，TNFSF10诱导的MAPK8通过减轻BCL2L1对BECN1的抑制而激活BECN1进行自噬。

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图5。MAPK8通过BCL2L1的降解和BCL2L1-BECN1复合物的分离介导自噬。(A类)A549细胞用TNFSF10（200 ng/ml）处理指定时间。western blot检测蛋白表达。GADPH被检测为负载控制。(B类)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；IKBKB抑制剂，50μM）预处理A549细胞30 min，然后用TNFSF10（200 ng/ml）再处理1 h。用western blot检测BCL2L1和BCL2。GADPH被检测为负载控制。(C类)A549细胞用TNFSF10（200 ng/ml）处理指定时间（h）。与BECN1抗体共免疫沉淀后，用western blot检测蛋白。(D类)A549细胞用SP600125（10μM）预处理30 min或未处理，然后用TNFSF10（200 ng/ml）处理1 h。用BECN1抗体共免疫沉淀后，用western blot检测指示蛋白。GAPDH被检测为负载控制。

自噬抑制TNFSF10诱导的抗凋亡蛋白降解

我们进一步研究了自噬是否调节抗凋亡因子。TNFSF10治疗使BIRC2、BIRC3、XIAP和CFLAR略有下降。当细胞与TNFSF10和wortmannin共同处理时，观察到这些蛋白质显著减少(图6A和B). 通过敲除ATG7或BECN1抑制自噬也有效地增强了TNFSF10诱导的这些抗凋亡蛋白的降解(图S5). MAPK8抑制对这些蛋白的类似作用也被检测到(图6A和B). 这些结果表明，MAPK8介导的自噬保护这些抗凋亡蛋白免受TNFSF10诱导的这些蛋白的减少。

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图6。MAPK8介导抗凋亡蛋白的自噬相关降解。(A–C)用指示的抑制剂（SP600125，10μM；沃特曼，1μM；MG132，10μM；组织蛋白酶B抑制剂，10μL；CQ，20μM；z-VAD，10μG）预处理UM-UC-3和A549细胞30 min，然后用TNFSF10（UM-UC-3为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理4 h。用western blot检测指示的蛋白质。ACTB被检测为负载控制。

因为抗凋亡蛋白是通过蛋白酶体和溶酶体的串扰降解来调节的，31我们进一步研究了自噬阻断过程中这些因子下调的机制。蛋白酶体抑制剂MG-132有效地恢复了TNFSF10处理细胞中BIRC2的表达(图6C). 组织蛋白酶B抑制剂（抑制一组溶酶体蛋白酶）和CQ（防止溶酶体酶发挥功能所需的酸化）也略微增加了BIRC2的表达，而不影响BIRC2修饰。这些结果表明蛋白酶体和溶酶体都参与了TNFSF10诱导和自噬介导的BIRC2降解。相反，组织蛋白酶B抑制剂（而非MG132）可保护其免受TNFSF10诱导的BIRC3、XIAP和CFLAR减少的影响，这表明溶酶体而非蛋白酶体途径参与了这些蛋白质的降解。(图6C). 重要的是，CQ抑制SP600125触发的BIRC2、BIRC3、XIAP和CFLAR均不同程度降低(图6C)表明MAPK8介导的这些抗凋亡蛋白的保护涉及溶酶体降解。这一观察结果与自噬抑制破坏泛素-蛋白酶体途径的报道一致。32此外，泛酶抑制剂z-VAD也保护BIRC2，但对BIRC3、XIAP和CFLAR几乎没有影响(图6C). 蛋白酶体中的凋亡或类半胱氨酸蛋白酶活性是否介导BIRC2降解需要进一步研究。然而，这些结果表明，抗凋亡蛋白的降解涉及不同的机制，蛋白酶体和溶酶体都参与了TNFSF10诱导的自噬。

RIPK1和TRAF2调节TNFSF10诱导的和MAPK8介导的自噬

接下来，我们研究了TNFSF10受体信号级联中TNFSF10-诱导MAPK8激活和自噬的因素。敲除RIPK1或TRAF2部分抑制TNFSF10诱导的MAPK8激活，表明TNFSF10-诱导的MAPK激活需要RIPK1和TRAF2(图7A)与我们之前在小鼠胚胎成纤维细胞中的发现一致。9与MAPK8在自噬诱导中的作用一致，抑制RIPK1或TRAF2抑制TNFSF10诱导的自噬(图7A和B). 此外，敲除RIPK1或TRAF2可有效增强TNFSF10诱导的细胞毒性(图7C和D). western blot证实RIPK1和TRAF2表达下调(图7E和F). 尽管RIPK1和TRAF2可能通过NFκB等其他机制保护细胞免受凋亡，但这些结果表明，MAPK8相关自噬的介导也有助于RIPK1与TRAF2的细胞保护活性。

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图7。RIPK1和TRAF2调节TNFSF10诱导的自噬和MAPK8介导的自噬。(A和B)用阴性对照或siRNAs转染UM-UC-3细胞RIPK1段或TRAF2型.转染后2小时，用TNFSF10（60 ng/ml）处理细胞2小时（MAP1LC3B）和8小时（SQSTM1）。western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为负载控制。(C和D)用指示的siRNAs转染UM-UC-3和A549细胞24小时，然后用TNFSF10（UM-UC-2为60 ng/ml，A549为200 ng/ml）再处理24小时。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差*p<0.01。(E和F)用指示的siRNAs（10 nM）转染UM-UC-3和A549细胞24小时。通过western blot检测指示的蛋白质。ACTB被检测为负载控制。

讨论

在本研究中，我们首次证实TNFSF10在不同的癌细胞系中诱导保护性自噬。通过解剖TNFSF10诱导的信号通路，我们随后研究了TNFSF10-激活自噬的机制。结果表明，由RIPK1和TRAF2介导的MAPK8活化在TNFSF10诱导的自噬中起着关键作用。此外，我们发现抗凋亡因子BIRC2、BIRC3、XIAP和CFLAR的降解以及TNFSF10 DISC形成的增强通过抑制自噬参与促进TNFSF10-诱导的细胞毒性。因此，抑制MAPK8通路介导的自噬将增加TNFSF10的抗癌活性，并规避肿瘤细胞对TNFSF10。

TNFSF10在白血病（Jurkat）、乳腺癌（MCF7）和结肠癌（HCT 116）细胞系中诱导自噬，并且自噬对这些癌细胞的细胞毒性具有保护作用。22,25,26然而，自噬在细胞命运中的作用可能是细胞类型特异性的。15,16此外，TNFSF10如何诱导癌细胞自噬尚不清楚。因此，在这项研究中，我们首先证实了TNFSF10能够在肺癌、前列腺癌和膀胱癌细胞系中诱导保护性自噬，然后继续研究TNFSF10诱导自噬所需的信号通路。结果证实MAPK8通路是TNFSF10诱导自噬的主要途径。阻断MAPK8可有效抑制TNFSF10诱导的自噬。作为一种具有多种细胞功能的激酶，MAPK8既可以是促凋亡的，也可以是抗凋亡的：短暂的MAPK8激活是存活的，而持续的MAPK9激活会导致细胞死亡。33-35尽管有报道称MAPK8有助于TNFSF10诱导的细胞死亡，但我们清楚地表明，在受试细胞中，MAPK8的抑制促进了TNFSF10-的细胞毒性。这些观察反映了MAPK8在细胞死亡调节中的复杂性，这可能涉及MAPK8亚型的细胞类型特异性和替代功能。36与之前关于饥饿诱导自噬的报告一致，27TNFSF10诱导的MAPK8活化导致BCL2L1–BECN1复合物解离。释放的BECN1触发自噬的启动。27然而，我们无法检测到TNFSF10诱导的BCL2磷酸化。相反，我们发现TNFSF10通过激活MAPK8导致BCL2L1降解并抑制BCL2L1-BECN1复合物。BCL2L1的降解被CQ阻断溶酶体降解而非z-VAD阻断凋亡所抑制。MAPK8介导BCL2L1降解自噬的确切机制值得进一步研究。在BCL2家族的抗凋亡成员中，我们发现BCL2L1和BCL2而非MCL1可以与BECN1结合，并且只有BCL2L1-BECN1复合物被TNFSF10抑制。这表明BCL2家族中不同的抗凋亡成员可能在自噬中有不同的参与，这一点在最近的一份报告中有所显示。37

通过siRNA方法，我们发现肿瘤细胞中TNFSF10诱导的MAPK8激活需要RIPK1和TRAF2，这与我们之前在小鼠胚胎成纤维细胞中的发现一致。9更重要的是，RIPK1或TRAF2的敲低有效地抑制了自噬并增强了TNFSF10诱导的细胞死亡。这些结果为TNFSF10诱导的保护性自噬建立了由RIPK1、TRAF2和MAPK8组成的途径。

自噬如何抑制TNFSF10诱导的凋亡细胞死亡尚不完全清楚。我们清楚地表明，抑制自噬可增强TNFSF10 DISC的形成。TNFSF10介导的自噬平衡通过隔离自噬体中的大CASP8亚单位进行溶酶体降解来实现凋亡。25与此报告一致，我们发现抑制自噬显著增加了大CASP8亚单位（p43）。此外，我们发现自噬也抑制了基础和TNFSF10诱导的抗凋亡因子的降解，包括参与TNFSF10-耐药的IAP和CFLAR。12因此，自噬似乎通过两种方式抑制TNFSF10诱导的癌细胞死亡：（1）通过抑制CASP8阻断凋亡信号，（2）通过稳定IAP和CFLAR增强抗凋亡途径。值得注意的是，尽管MAPK8与BCL2L1类似地稳定了MCL1，但MCL1似乎并不参与自噬调节。因此，每种生存前BCL2蛋白在保护癌细胞免受TNFSF10诱导的细胞毒性作用中可能发挥不同的作用。

自噬成分（如BECN1和SQSTM1）以自噬依赖或独立的方式参与细胞凋亡调节，这一点已被充分证明。据报道，SQSTM1结合并促进CASP8的充分激活，以增强细胞死亡，表明SQSTM1具有促凋亡作用。我们的结果表明，SQSTM1通过介导TNFSF10诱导的自噬发挥细胞保护作用。虽然SQSTM1在调节CASP8活化中的作用和机制值得进一步研究，但我们的结果清楚地表明，SQSTM10介导的自噬保护癌细胞对抗TNFSF10诱导的凋亡。

蛋白酶体和溶酶体相互影响并参与自噬。尽管自噬蛋白降解是溶酶体，但自噬也促进泛素蛋白酶体蛋白降解。32在我们的研究中，我们发现在TNFSF10诱导的凋亡过程中，溶酶体和蛋白酶体降解都参与调节抗凋亡蛋白。在TNFSF10诱导的信号传导过程中，蛋白酶体活性是BIRC2降解所必需的，而溶酶体参与BIRC2/BIRC3（c-IAP）和CFLAR的降解。有趣的是，这两种蛋白质降解机制都受到自噬的影响。

总之，本研究的结果确定了一条由TRAF2、RIPK1和MAPK8组成的通路，用于TNFSF10诱导癌细胞的保护性自噬。通过靶向该途径的关键成分来抑制MAPK8介导的自噬可能有助于肿瘤细胞对TNFSF10治疗的敏感性。

材料和方法

试剂和抗体

谷胱甘肽S-转移酶（GST）TNFSF10是如前所述制备的。9,12抗BCL2（sc-7328）、BECN1（sc-48341）、GAPDH（sc-32233）和TRAF2（sc-877）的抗体来自Santa Cruz Biotechnology。抗磷酸MAPK8（44682G）来自Invitrogen。抗-FADD（556402）、-BIRC2（AF8181）、-BIR C3（552782）、-CASP3（559565）、-TNFRSF10B（557868）、-MAPK81（554286）、-SQSTM1（610832）、-RIPK1（610458）、-CASP8（551242）和-poly（ADP-核糖）聚合酶（PARP1，611038）来自BD Biosciences。抗-ACTB（A1978）和抗-MAP1LC3B（L7543）购自Sigma-Aldrich。BCL2L1（2762）和XIAP（2042）的抗体来自细胞信号。针对CFLAR（AAP-440c）和MCL1（3035-100）的抗体分别来自Alexis和BioVision。Anti-ATG7（PA5-17216）来自Thermo Scientific。MAPK8抑制剂SP600125（129-56-6）、IKBKB/IKK抑制剂II（354812-17-2）、MG132（474790）、组织蛋白酶B抑制剂（219385）和沃特曼（19545-26-7）均来自Calbiochem。氯喹（CQ，50-63-5）来自Sigma-Aldrich。3-甲基腺嘌呤（3MA，sc-205596）来自圣克鲁斯生物技术公司。短干扰RNA(自动液位计7siRNA、M020112和RIPK1段siRNA，M-00445-02-005）用于所选基因和非靶向siRNA（沉默剂®阴性对照#1 siRNA）从Dharmacom获得。BECN1公司siRNA（sc-29797）和TRAF2型siRNA（sc-29509）来自圣克鲁斯生物技术公司。

细胞培养

UM-UC-3、PC-3和A549细胞从美国典型培养物保藏中心获得，并在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中生长。

细胞毒性测试

使用CytoTox96非放射性细胞毒性试验（Promega，G1782）进行基于乳酸脱氢酶（LDH）释放的细胞毒性试验。细胞接种在70–80%汇合处的48个板中。过夜培养后，按照每个图形图例中的指示处理细胞。如前所述确定LDH释放。38

蛋白质印迹和免疫沉淀

通过将细胞悬浮在M2缓冲液中[20 mM TRIS-HCl（pH 7.6）、0.5%NP40、250 mM NaCl、3 mM EDTA、3 mM-EGTA、2 mM DTT、0.5 mM苯甲基磺酰氟、20 mMβ-甘油磷酸、1 mM钒酸钠和1μg/ml亮氨酸蛋白酶]制备细胞裂解物。用12%或15%的SDS-PAGE溶解每个细胞裂解液中等量的蛋白质，并用western blot进行分析。根据制造商的说明（Millipore，WBKLS0500），通过增强化学发光对蛋白质进行可视化。39每个实验至少重复三次，并显示了具有代表性的结果。为了进行免疫沉淀，细胞在60 mm培养皿中培养，按照图示处理，并在M2缓冲液中溶解。如前所述进行免疫沉淀。40简言之，在室温下将20µl蛋白A琼脂糖珠（50%）与1µg BECN1抗体在PBS中偶联2 h。然后添加1 mg细胞裂解物，并在4°C下旋转过夜，与珠培养。用M2缓冲液清洗珠子七次。使用电泳样品缓冲液洗脱免疫沉淀剂。将样品煮沸5分钟，然后装入12%SDS-PAGE凝胶。western blot检测相关蛋白。

GST下拉和DISC分析

用50 ng/ml的GST-TNFSF10处理UM-UC-3细胞15分钟、30分钟或不处理。然后用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用0.5ml M2缓冲液裂解。将可溶性部分与20μl（50%）谷胱甘肽-葡萄糖珠（法玛西亚）在4°C的旋转器上孵育3小时或过夜。将GST-TNFSF10（60 ng/ml）添加到从非刺激性细胞制备的裂解物中，以沉淀非刺激性受体。用M2缓冲液洗涤五次后，在SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸3分钟洗脱结合蛋白，并在12%的SDS/PAGE中溶解。然后通过western blot检测TNFRSF10B、FADD、CASP8和CFLAR的存在。12

RNAi敲除蛋白表达

转染前一天，将UM-UC-3和A549细胞接种在6孔板和48孔板中，50%融合。用SiRNA INTERFERin™转染SiRNA（多聚物转染，409-10）。转染后24小时，通过western blot检测相关蛋白的表达，并对剩余细胞进行细胞毒性试验。

荧光显微镜

将稳定转染GFP-MAP1LC3B的A549细胞生长在玻璃盖玻片上，用TNFSF10（200 ng/ml）处理1 h，然后在荧光显微镜下进行检测。所示图像代表了三个独立的实验。计算每个阳性细胞点状细胞的百分比和平均点状细胞数。24

统计分析

数据表示为平均值±标准偏差。用单因素方差分析检验统计学意义。

在所有分析中，p<0.05被认为具有统计学意义。

补充材料

其他材料

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致谢

这项研究得到了NIEHS/NIH（R01ES017328）、能源部低剂量辐射研究计划（DE-SC0001173）和重庆市卫生局（2012-2-001）的部分资助。

词汇表

缩写：

3毫安3-甲基腺嘌呤
CQ公司氯喹
磁盘死亡诱导信号复合体
生命周期3微管相关蛋白1轻链3
MAPK8/JNK公司丝裂原活化蛋白激酶8/c-Jun N末端激酶
核因子κB核因子-κB
TNFSF10/拖车肿瘤坏死因子（配体）超家族成员10/肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
TNFRSF10A/拖车R1肿瘤坏死因子受体超家族成员10A/TNF-相关凋亡诱导配体受体1
TNFRSF10B/拖车R2肿瘤坏死因子受体超家族成员10B/TNF-相关凋亡诱导配体受体2
TNFRSF10C/拖车R3肿瘤坏死因子受体超家族成员10C/TNF-相关凋亡诱导配体受体3
TNFRSF10D/列车-R4肿瘤坏死因子受体超家族成员10D/TNF-相关凋亡诱导配体受体4
TNFRSF11B/OPG公司肿瘤坏死因子受体超家族成员11B/骨保护素
水处理模块沃特曼

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

补充材料

补充材料可在此处找到：www.landesbioscience.com/journals/autophagy/article/22145

工具书类

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文章来自自噬由以下人员提供泰勒和弗朗西斯