VCL-CB01, an injectable bivalent plasmid DNA vaccine for potential protection against CMV disease and infection

Mark R Schleiss

当前操作摩尔热。作者手稿；PMC 2013年1月8日提供。

以最终编辑形式发布为：

当前操作摩尔热。2009年10月；11(5): 572–578.

预防性维修识别码：PMC3539801型

NIHMSID公司：美国国立卫生研究院185333

PMID：19806506

VCL-CB01，一种对CMV疾病和感染具有潜在保护作用的可注射双价质粒DNA疫苗

马克·R·施莱斯

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摘要

预防人类巨细胞病毒（hCMV）感染和疾病的疫苗是一项主要的公共卫生优先事项。用编码hCMV免疫应答关键蛋白的DNA疫苗进行免疫已成为hCMV疫苗研究的一个主要焦点。DNA疫苗在动物模型中的保护效果验证为临床试验提供了支持。VCL-CB01由Vical Inc开发，用于预防hCMV感染和疾病，是一种泊洛沙姆形成的二价DNA疫苗，含有编码hCMV体表磷酸蛋白65和主要hCMV表面糖蛋白B的质粒。在hCMV血清学阳性造血细胞移植受者的II期试验的中期结果中，与安慰剂相比，VCL-CB01增加了T细胞反应。第二阶段试验的最终结果将对制定预防hCMV血清学阳性移植受者hCMV疾病的策略具有价值，并可能导致VCL-CB01或相关疫苗预防先天性hCMV感染的其他试验。

介绍

CMV是疱疹病毒家族的成员，是一种dsDNA病毒[1033483]. 人类巨细胞病毒（hCMV）感染在所有地理位置和社会经济群体中都是地方病，尽管不同人群的血清流行率不同[1036711]. 一般来说，人巨细胞病毒感染是在生命早期获得的，在社会经济地位较低的人群和发展中国家，总体血清流行率较高[1036711]. 在许多人中，hCMV感染是无症状的，并导致长期（终身）无症状感染，在此期间病毒驻留在细胞内，不会造成可检测到的损害或临床疾病[1025915]. 在这些人巨细胞病毒血清阳性的个体中，疾病是随着潜在感染的重新激活而发生的，特别是在免疫抑制的个体中（例如，晚期HIV感染的患者，或接受实体器官或造血细胞移植的患者）[1037134]. hCMV感染也可能从孕妇传播给发育中的胎儿，并且可能发生在原发性母体感染、潜在母体感染重新激活或再次感染hCMV新毒株的情况下[1037134]. 人巨细胞病毒很容易通过体液传播（包括唾液、尿液、生殖道分泌物、母乳和血液）；因此，传播通常需要与另一感染者密切接触。

hCMV感染可导致HCT受者患上危及生命的疾病[1036390]艾滋病患者的视力威胁性视网膜炎[1036391]. 新生儿先天性hCMV感染可导致终身残疾[1036394]患有神经发育后遗症，包括感音神经性耳聋、精神发育迟滞、脑瘫和癫痫[1036398]. 抗病毒治疗是可行的，并且可以对预防HCT患者中hCMV相关死亡率和艾滋病患者视网膜炎产生深远影响[1036409], [1036447]. 然而，抗病毒治疗无法逆转先天性感染新生儿的神经发育损伤。此外，目前许可的抗病毒药物也有副作用，特别是中性粒细胞减少和肝脏损伤[1036409].

治疗的VCL-CB01型

发起人维卡尔公司

状态II期临床

指示巨细胞病毒感染

行动DNA疫苗，治疗性疫苗

技术生物治疗，肌肉内配方

鉴于抗病毒治疗的局限性，迫切需要疫苗来预防高危患者中的hCMV疾病，特别是因为在免疫抑制状态或妊娠期接触hCMV后，已有的免疫可以减轻疾病的严重性[1025915]. hCMV疫苗的临床应用可以是多种多样的，从预防原发性感染（例如通过早期儿童的通用疫苗接种计划）到增强已感染hCMV的个人（例如实体器官或HCT受体）的免疫力，以预防或限制hCMV病[1025915]. 考虑到感染hCMV的新生儿可能会出现终身残疾，研制hCMV感染预概念疫苗将带来最大的经济影响[589207], [1025918].

尽管人们对hCMV疫苗的关键需求达成了共识，但尚不清楚什么将构成免疫原性和保护性疫苗战略。已报告使用减毒活疫苗（表达关键免疫原的载体疫苗[如减毒痘病毒]）、佐剂重组蛋白疫苗和DNA疫苗的临床试验（如参考文献中所述[1025915]). 此外，对于亚单位疫苗方法，hCMV疫苗中应包括哪些hCMV蛋白产品尚不确定。

免疫低下个体中hCMV的控制主要与细胞免疫反应有关。抗体反应似乎对预防先天性传播至关重要，主要针对hCMV包膜糖蛋白，特别是糖蛋白B（gB）[1033491], [1033492]. 在移植受者和HIV感染者中，hCMV感染的控制与保存的细胞免疫应答相关，包括CD4+和CD8+T细胞应答[1032837]. 尽管hCMV感染后的T细胞靶点是不同的[1025920]，检测到的CD8+T细胞反应在体外似乎主要针对人巨细胞病毒被膜磷酸蛋白65（pp65）和即刻早期1（IE1）蛋白，其中pp65和gB是CD4+T细胞反应中最能识别的抗原[1025923], [1032837], [1032840], [1033497], [1033498]. 最近的一项II期临床试验首次证明，在使用含有单一抗原（gB）的疫苗的高危hCMV血清阴性年轻女性中，以预防感染为试验终点，可以实现对hCMV获得性感染的保护[992920]. 目前，临床试验中的大多数亚单位疫苗方法都强调不仅包括体液免疫靶点，还包括T细胞靶点[1025915]. 希望通过诱导体液和细胞免疫反应，可以实现最佳有效的疫苗策略。

DNA疫苗具有几个吸引人的特性，包括免疫反应的特异性、接种疫苗诱导强烈体液和细胞免疫反应的能力、疫苗的批对批重复性、易于生产和管理、安全性以及易于储存和运输。以单价、二价或三价形式表达gB、pp65和IE1的人巨细胞病毒DNA疫苗已设计用于临床试验[987215], [992920], [1026018]. 为了优化免疫原性，一些疫苗配方中包含了佐剂。本文综述了人巨细胞病毒DNA疫苗的现状，重点介绍了Vical公司的专利疫苗VCL-CB01。

合成与合成孔径雷达

VCL-CB01是一种二价DNA疫苗，含有编码hCMV pp65（VCL-6368）和gB（VCL-6265）的质粒。VCL-6368质粒缺乏激酶，因为pp65的蛋白激酶结构域缺失（氨基酸435至438缺失），VCL-6365构建物编码gB的截断形式（氨基酸1至713）以促进分泌。为了提高免疫原性，将质粒DNA与非离子共聚物（泊洛沙姆）CRL-1005（SynthRx Inc）和阳离子表面活性剂苯扎氯铵（BAK）按5 mg/ml质粒DNA：7.5 mg/ml CRL-1005:0.1 mg/ml BAK的比例配制，并在接种前在PBS中稀释至适当浓度[987215], [1026013].

使用这种佐剂的质粒DNA制剂被证明可以产生热力学稳定的自组装系统[934385]. 在小鼠实验中评估了共聚物浓度和BAK组成等参数对免疫反应的影响。本研究中评估的质粒DNA不是hCMV特异性的，而是编码流感核蛋白基因的。在7.5 mg/ml CRL-1005、0.3 mM BAK和5 mg/ml质粒DNA浓度下，CRL-1005/BAK/质粒DNA颗粒的平均直径为261 nm，表面电荷为-11.6 mV。负表面电荷和原子力显微镜图像表明，质粒DNA与吸附在共聚物颗粒表面的BAK结合。与未成形质粒DNA相比，该制剂显著增强了抗原特异性细胞和体液免疫反应（分别为1.8倍和2.0倍），并增加了肌肉和血清中的转基因水平（均p<0.01）[934385].

临床前发展

为了验证针对hCMV疾病的DNA疫苗接种概念，在动物模型中进行了几项临床前研究。hCMV不会感染其他哺乳动物，因此需要对非人类CMV进行研究[1025996]. 幸运的是，关键免疫原性病毒基因产物（如gB和pp65）在非人类巨细胞病毒中高度保守，似乎是其各自宿主免疫反应的重要靶点。综述了在这些非人类系统中各种巨细胞病毒DNA疫苗的研究[1025997]. 与VCL-CB01相关的是那些专注于非人类CMV编码的gB和pp65同源物的动物研究。由于对hCMV DNA疫苗效力的预许可研究无法在动物中进行有意义的研究，因此DNA疫苗在动物模型中的“概念验证”研究结果与VCL-CB01在控制hCMV疾病方面的潜在价值最为相关。

一项使用种特异性豚鼠CMV在豚鼠身上进行的研究表明，表达gB和pp65同源物的二价DNA疫苗引发免疫反应[1025998]. 有趣的是，通过截短蛋白质跨膜结构域上游的蛋白质，可以增强抗gB反应，而通过基因枪而不是肌肉注射疫苗可以提高免疫反应[1025998]. 随后对豚鼠先天性感染模型进行的疗效研究表明，使用gB疫苗对胎儿感染有效，但不使用pp65疫苗[1026005].

在恒河猴（rh）CMV模型中进行了gB和pp65疫苗的类似研究。接种编码磷酸蛋白65-2（pp65同源物）的DNA疫苗后，gB刺激的抗原特异性抗体、CD8+T细胞反应和血浆病毒载量在接种rhCMV后显著降低[1026006]. 由于CD4+T细胞相对较弱，中和抗体反应仅由DNA产生，因此随后的一项研究调查了DNA质体/蛋白增强策略，包括接种编码pp65-2、gB和IE1同源物的DNA疫苗，然后接种福尔马林灭活的rhCMV病毒。除了显著的中和抗体滴度外，该策略还引发抗原特异性CD4+和CD8+T细胞反应。挑战病毒感染的主要部位的病毒复制减少，验证了这种方法[1026007].

hCMV gB/pp65 DNA疫苗的临床前研究最初在小鼠中进行[1026013]. 这些研究使用VCL-CB01-like产品的前体制剂。用gB和pp65质粒DNA的各种组合接种小鼠（第0天和第14天两次接种），无论是否在PBS或基于泊洛沙姆的递送系统VF-P1205-02A（02A）中配制。当在PBS中配制时，克隆gB和pp65质粒具有高度的免疫原性，但接种二价疫苗后，对每个抗原的免疫反应分别减少了克隆值的2.8倍和4倍。然而，与PBS中使用二价疫苗诱导的免疫反应相比，使用02A的二价疫苗显著增加了抗原特异性免疫反应（p=0.048），并完全消除了pp65特异性T细胞反应的减少[1026013].

毒性

一般来说，DNA疫苗在临床前研究和临床试验中都被证明是无毒的[1036505]. DNA疫苗的理论安全性问题包括质粒DNA整合到宿主细胞染色体的风险、诱导抗DNA抗体的风险（例如在自身免疫疾病中可能遇到的）、致癌性风险以及细胞或细菌DNA“携带”的风险[1026009], [1026011]. 在一项对肌肉注射三价泊洛沙姆形成的质粒DNA-基人巨细胞病毒疫苗的兔子进行的整合研究中，尽管质粒DNA在接种后60天在注射部位持续存在，但通过琼脂糖凝胶电泳或分馏分析无法检测到质粒DNA整合[1036630].

使用含有pp65基因的人巨细胞病毒DNA疫苗的一个独特的潜在风险是pp65蛋白固有的蛋白激酶活性的存在[1026012]. 这种外源性激酶活性对人类宿主细胞生理学的影响尚不清楚。然而，已经证明转化Lys的点突变⁴³⁶在pp65开放阅读框中的不变赖氨酸处的天冬氨酸是磷酸转移酶活性的关键部位，它清除所有激酶活性。尽管如此，突变的pp65仍保留其免疫学特性，包括体液和细胞反应的诱导[1026012]. pp65突变的鉴定用于使VCL-CB01疫苗激酶因氨基酸435至438的缺失而缺失[987215]. 在小鼠和兔子的临床前研究中，VCL-CB01被报告为安全的[538551], [568102].

代谢和药代动力学

如前一节所述，在注射三价泊洛沙姆形成的hCMV疫苗后，在接种后至少60天内，可以在兔子肌肉中检测到质粒DNA；然而，肌肉中的质粒DNA拷贝数在接种后的前30天减少了约3倍，在接种后第60天又增加了3倍[1036630]. 在一项对小鼠的类似研究中，在接种疫苗后第60天，除注射部位（肌肉内）外，在所有组织类型中均未检测到质粒DNA。与PBS-质粒DNA疫苗接种小鼠相比，泊洛沙姆形成疫苗接种小鼠的质粒DNA清除较慢[1036630].

DNA疫苗免疫后可能会传播DNA，尽管没有证据表明在远处的位置有吸收或表达[1026019]. 应注意用基于PCR的hCMV DNA检测研究作为病毒复制状态的标记；如果用于检测hCMV序列的引物也包括在DNA疫苗制剂中，则由于即使少量的DNA疫苗传播到系统区室中，也可能出现假阳性结果。有人认为，如果目标细胞是有丝分裂后细胞，即使没有染色体整合，也可能从质粒DNA中长期表达外源基因[1026019]. 这种长期基因表达对免疫反应的影响尚不清楚，尽管它可能在免疫启动中发挥重要作用。

关于VCL-CB01，临床疫苗学中一个重要的药代动力学问题是药物的效力。为了评估疫苗效力，使用基于TaqMan的RT-PCR分析作为在体外VCL-CB01生物活性测定[987216]. 该检测定量了转染VCL-CB01的培养细胞中hCMV特异性mRNA；在将参考和试验样品转染到培养细胞并量化RNA RT-PCR后，报告了疫苗的批间变异。该测定区分了50、75、150和200%参考物质的产品效力，并降低了在体外在注射相同材料的小鼠中，效力测定与hCMV特异性免疫反应降低相关[987216].

临床开发

第一阶段

一项I期、多中心、开放标签、剂量递增临床试验评估了VCL-CB01（im）在基线检查时hCMV血清阴性（n=22）或血清阳性（n=21）的健康成年人中的作用[568102], [987215]. 在第0周、第2周和第8周（n=32），成年人被纳入两种给药方案中的一种，分别服用1或5 mg VCL-CB01，或在第0、3、7和28天（n=12）服用5 mg VCL-CB01。16周时，45.5%的hCMV血清阴性参与者和25.0%的hCMV-血清阳性参与者观察到免疫原性。此外，68.1%的CMV血清阴性参与者在第32周出现记忆性IFNγT细胞反应。这一结果表明，VCL-CB01具有启动T细胞的能力，使抗原特异性T细胞在与抗原再交换后能够增殖并分泌IFNγ。测量对gB的体液反应的结果并不令人鼓舞。在所有给药方案中，接种疫苗后，没有一名hCMV血清阳性受试者的抗gB抗体水平显著提高（比基线水平增加2倍以上），23%的hCMV抗体阴性受试者出现抗gB反应（22名受试者中有5名）。抗体和T细胞反应分别在接种疫苗后第12至16周和第10至12周达到峰值，此后下降[987215].

第二阶段

在接受异基因HCT的供体和受体中，正在进行一项二期、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，以评估VCL-CB01（5 mg im）的安全性和免疫原性(临床试验.gov标识符：NCT00285259；CB01-202）。本试验的目的是评估向相关供体/受体对（D/R组）和仅hCMV血清阳性受体（R组）个体（相关或无关）施用VCL-CB01，以检查和比较hCMV感染和疾病的发病率。受试者在移植前3-5天以及移植后3-6、12和28周接受免疫。在D/R试验组中，供体在移植前9、6和2天也进行了免疫接种。在47名参与者（33名R和14名D/R）的初步免疫原性分析中，与安慰剂相比，R组患者移植后第56天和第84天的hCMV特异性pp65和gB T细胞的频率更高（均p<0.05）。然而，移植后抗gB抗体水平没有差异[962355], [1026020]. 由于D/R组参与人数较少，因此未从该组获得决定性数据。根据小样本量和R组中期免疫原性分析结果，Vical确定无需继续加入D/R组[962355].

试验的R组完成了80名受试者的登记（40名VCL-CB01:40安慰剂），并公布了中期数据[962355]. 接种VCL-CB01疫苗的受者表现出hCMV感染的发生率降低（定义为在HCT后4个月内的任何时间点>500 hCMV基因组拷贝/ml，通过实时PCR测定）、hCMV复发（定义为≥2次DNA血症）、DNA血症持续时间、，与接受安慰剂的患者相比，HCT后累积病毒载量的AUC和DNAemia峰值（所有参数降低24-70%）。此外，病毒重新激活的时间缩短了，一项现场-现场分析表明，与安慰剂相比，疫苗接种者需要更短的抗病毒治疗时间，也不太可能开始抗病毒治疗[1024128].

副作用和禁忌症

在第一阶段临床试验中，VCL-CB01耐受性良好，无严重不良事件（AE）[987215]. 最常见的疫苗相关AE是注射部位疼痛（81.8%），其次是肌痛（54.5%）、头痛（40.9%）和不适（40.9%。不良事件为轻度至中度，无4级事件和1例3级事件（注射部位疼痛）报告。共有36名参与者（81.8%）经历过至少一次1级AE，18名参与者（40.9%）出现至少一次2级AE。值得注意的是，较高剂量（第0周、第2周和第8周服用5 mg）可观察到更多的局部反应性（尤其是注射部位红斑和注射部位硬化）和加速时间表（第0、3、7和28天服用5 mg）[987215]. 在发表时，没有关于HCT受体中VCL-CB01安全性的数据。

专利摘要

VCL-CB01包含在WO-2004058166中的Vical中，其中声称hCMV疫苗含有密码优化多核苷酸。该专利的一个基石是，通过密码子优化，对人类或其他哺乳动物细胞中感兴趣的人巨细胞病毒抗原（pp65、gB和IE1）的天然编码区进行了“改良以提高翻译”。该专利涵盖Arg的删除⁴³⁵到Lys⁴³⁸pp65的激酶结构域，以及gB中缺失的膜锚和胞内结构域。该专利还涵盖佐剂和免疫调节剂，例如由CRL-1005和BAK组成的基于泊洛沙姆的配方。同等的美国产品专利US-07410795于2008年8月获得授权，在US154延期510天后于2025年5月到期。还有一份等效的欧洲申请EP-01587816，在公布时正在审查中。

当前意见

DNA疫苗是高危患者接种hCMV疾病疫苗的一种新的令人兴奋的选择。由于对hCMV的免疫似乎需要体液和细胞免疫反应，DNA疫苗可以代表一种最佳的接种策略。虽然保护性免疫所必需的关键病毒基因产物仍不明确，但在使用基于gB、pp65和IE1同源物的DNA疫苗的相关动物巨细胞病毒挑战模型中发现的对疾病的保护需要在临床试验中进行进一步研究。

除了VCL-CB01疫苗外，Vical还正在开发CyMVectin，一种用阳离子脂质/共脂佐剂Vaxfectin（Vical Inc）配制的单价（质粒编码gB）hCMV DNA疫苗，专门用于预防先天性hCMV感染；出版时，正在计划对CyMVectin进行临床试验[1003969]. VCL-CT02是一种由编码hCMV pp65、gB和IE1的质粒组成的三价hCMV DNA疫苗，也是由Vical开发的。在第一阶段试验中，非佐剂VCL-CT02表现出适度的免疫原性[1026018]; 然而，当参与者接受含hCMV减毒活毒株（Towne hCMV）的VCL-CT02时，与仅接受Towne治疗的对照组相比，pp65 T细胞和gB抗体反应显著增强。此外，初始增强与gB-特异性IFNγ反应的发展趋势有关[1026018]. 然而，该疫苗的开发似乎已经停止，因为Vical专注于HCT受体中VCL-CB01的开发和先天性hCMV感染的CyMVectin的开发。

尽管VCL-CB01的临床前研究和临床试验的I/II期数据令人鼓舞，但仍存在一些潜在的障碍。VCL-CB01试验的结果虽然在T细胞反应方面很有希望，但在对gB的体液反应方面却令人失望；这些结果的原因尚不清楚。豚鼠模型的临床前研究表明，通过皮内（基因枪）途径接种DNA疫苗可提供更好的ELISA和中和gB的滴度；因此，尽管VCL-CB01的肌肉内给药途径对于I类处理和诱导T细胞反应（尤其是CD8+细胞毒性T细胞反应）是理想的，但对于诱导gB的体液反应来说，它可能是次优的。另一个需要考虑的问题是，HCT移植受者的保护性免疫相关性是否与保护胎儿免受先天性hCMV感染的相关性相同。虽然T细胞疫苗可能足以在移植后限制hCMV疾病，但保护胎儿可能需要强大的中和抗体反应。因此，最佳DNA疫苗策略可能取决于需要针对hCMV提供保护的患者群体。最后，需要进一步研究hCMV血清阳性受者“增强”免疫力的必要性。在一项I期试验中，hCMV血清阳性受者对VCL-CB01的免疫反应似乎不大。hCMV疾病，无论是在移植环境中还是在妊娠期，都可能在先前免疫的个体再次感染后发生；因此，一种最佳的疫苗将增强已呈hCMV血清阳性的个人的免疫力。

尽管面临这些挑战，VCL-CB01疫苗代表了hCMV疫苗接种领域的重大进展。特别令人感兴趣和潜在价值的是表明VCL-CB01“启动”免疫反应的数据。因此，可能由DNA疫苗和重组gB蛋白组成的“原始-增强”策略可能是获得高水平细胞和体液免疫反应的最佳方法。这种方法需要在动物模型中进行验证。在针对育龄妇女的临床试验中评估这种和其他hCMV疫苗方法也至关重要。虽然在移植环境中预防hCMV疾病是值得的，但从公共卫生角度来看，先天性hCMV感染对社会的重大影响最终掩盖了这个问题的严重性。因此，还应考虑对hCMV感染高危女性进行VCL-CB01和相关hCMV DNA疫苗的未来研究，以改善妊娠结局以及婴儿和儿童的健康和福祉。

交易

赛诺菲巴斯德

1994年9月，Vical和Pasteur Merieux Connaught（后来是Aventis Pasteur:现在是Sanofi Pasteur.）就开发几种基于DNA技术的疫苗达成了研究合作协议，包括用于CMV感染的疫苗[177118]. 2001年12月，所有感染性疾病疫苗的权利都归还给了Vical[433522].

发展现状

开发商	国家	状态	指示	日期	参考
维卡尔公司	美国	第二阶段	巨细胞病毒感染	2006年2月1日	647998
赛诺菲巴斯德	法国	已停止	巨细胞病毒感染	2001年12月14日	433522

工具书类

••未偿付利息

•特别关注

177118表10-K–Vical Inc 1994。Vical Inc表格10-K。1994年12月31日； [谷歌学者]

433522Vical和Aventis重组协议。Vical Inc Press Realese公司。2001年12月13日； [谷歌学者]

538551Locher C.IDDB会议报告；2004年世界疫苗大会；加拿大蒙特利尔。2004年4月27日至29日，[谷歌学者]

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