《美国病理学杂志》。2013年1月；182(1): 255–265.
PGC-1α调节视网膜正常和病理血管生成
,∗ ,† ,∗ ,† ,‡ ,‡和†∗
马加里·圣杰尼兹
∗波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院Schepens眼科研究所
蒋爱华
†波士顿贝斯以色列女执事医疗中心心血管研究所
斯蒂芬妮·阿本德
∗波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院Schepens眼科研究所
劳拉·刘
†波士顿贝斯以色列女执事医疗中心心血管研究所
哈里·斯威加德
‡波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院眼科
基普·M·康纳
‡波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院眼科
佐尔坦·阿拉尼
†波士顿贝斯以色列女执事医疗中心心血管研究所
∗波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院Schepens眼科研究所
‡波士顿哈佛医学院马萨诸塞州眼耳医院眼科
†波士顿贝斯以色列女执事医疗中心心血管研究所
版权©2013美国病理研究学会。爱思唯尔公司出版。保留所有权利。 - 补充资料
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补充图S2人类米勒细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞中PGC-1α的相对表达。提取指示细胞的RNA，并对PGC-1α进行RT-qPCR。mRNA表达标准化为Müller细胞中的mRNA表达，并以线性形式显示(左侧面板)和对数形式(右侧面板). MIO-M1：人类米勒细胞。ARPE：成人视网膜色素上皮细胞。HUVEC：人脐静脉内皮细胞。误差线为±SEM。*与MIOM相比，P<0.05。
GUID:7CE29455-2A8F-4F31-A20A-CB8D9B3601B6
摘要
眼部新生血管疾病是世界范围内最常见的致盲原因。视网膜病理性新生血管形成的机制尚不完全清楚。PGC-1α是一种转录辅激活因子，在细胞代谢调节中起着核心作用。在骨骼肌中，PGC-1α诱导VEGFA表达，并有力促进血管生成，这表明其在其他组织中的作用类似。本研究探讨了PGC-1α在视网膜正常和病理血管形成过程中的作用。我们发现，PGC-1α诱导了许多视网膜细胞中VEGFA的表达，并且在出生后的视网膜发育过程中，PGC-2α的表达受到强烈诱导，与VEGFA表达和血管生成一致。PGC-1α−/−成年后，小鼠早期视网膜血管生长显著减少，毛细血管密度和主要动脉和静脉数量减少。在早产儿视网膜病变的氧诱导视网膜病变模型中，PGC-1α在视网膜内核层显著诱导表达，表明PGC-1β驱动病理性新生血管。为了支持这一点，PGC-1α−/−受氧诱导视网膜病变影响的小鼠VEGFA表达降低，并对病理性新生血管有保护作用。这些结果表明，PGC-1α调节视网膜中的VEGFA，是正常血管发育和病理性新生血管形成所必需的。数据表明PGC-1α是治疗眼部新生血管疾病的新靶点。
成熟视网膜是一种高度代谢的神经组织，在任何人体组织中，每单位重量的耗氧量最高。1在大多数哺乳动物中，成年视网膜由两个独立的循环系统提供血管：供应视网膜内部的视网膜血管和供应视网膜深层的脉络膜血管。2视网膜血管的生长通常是静止的。三然而，在多种视网膜病变中，如增殖性糖尿病视网膜病变、静脉阻塞、年龄相关性黄斑变性和早产儿视网膜病变（ROP），血管异常血管生成性生长进入视网膜组织和/或玻璃体会导致严重的视力丧失。
ROP是早产儿和极低出生体重儿失明的主要原因，4是由视网膜血管生长紊乱引起的。5人类视网膜的血管化通常在足月时完成并稳定。相比之下，放置在高氧培养箱中的早产儿的未成熟血管在面临氧张力增加时会退化（血管增生期）。6一旦恢复常压，灌注不足的视网膜就会出现缺血，并显著诱导血管内皮生长因子A（VEGFA）和异常血管生长（血管增殖期）。目前治疗ROP的方法只能将失明率降低25%，并且对视网膜有破坏作用。7最近的抗血管内皮生长因子治疗取得了可喜的结果，强调了血管内皮生长激素A在该病中的重要性。8因此，了解ROP的病理生理学，并确定调节视网膜VEGFA和血管生成的潜在靶向途径，是非常有意义的。
长期以来，转录因子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）被认为是正常和病理条件下视网膜血管形成的主要驱动力。9然而，这一概念最近受到了挑战。例如，使用VEGFA启动子缺乏HIF-1应答元件，因此无法产生VEGFA以应对HIF-1α的转基因小鼠，Vinores等人10结果表明，HIF-1α依赖的VEGFA调节对于正常的视网膜血管形成来说是不需要的。我们最近在骨骼肌中描述了一种新的HIF-非依赖性途径，该途径可有效调节血管生成，涉及转录辅激活物PPARγ-辅激活物-1α（PPARGC1A；别名PGC-1α）。11PGC-1α是许多组织中线粒体和氧化代谢的强大调节器（在Kelly和Scarpulla中综述，12Lin等人，13Handschin和Spiegelman，14和Arany15). 此外，我们最近发现PGC-1α还调节培养的肌肉细胞和骨骼肌中的血管生成程序，包括VEGFA和其他血管生成因子体内.11骨骼肌中PGC-1α的转基因表达显著增加了微血管密度，在骨骼肌缺血模型中具有保护作用。PGC-1α是线粒体功能的主要调节因子，因此也控制着骨骼肌中一种新颖而强大的血管生成途径，这表明它也可能在其他组织中起作用。
尽管视网膜是体内代谢最活跃和血管化的组织之一，但对PGC-1α在眼睛中的作用知之甚少。最近只有一份报告表明PGC-1α与感光细胞的光损伤存活有关。16PGC-1α是一种新的血管生成调节剂，其在代谢中的重要作用使我们怀疑它可能在视网膜血管发育和ROP中发挥作用。我们在此表明，PGC-1β在视网膜中表达，在发育中的视网膜中表达显著增加，PGC-1α可以诱导视网膜细胞中的VEGFA。此外，PGC-1α−/−在类似于ROP的增殖性视网膜病变模型中，小鼠的视网膜血管生长延迟，免受病理性新生血管的影响。
材料和方法
动物
所有动物实验均由Schepens眼科研究机构动物护理和使用委员会批准。PGC-1α-缺陷小鼠先前已有描述。17如前所述，通过将出生后第7天（P）的小鼠置于75±2%氧气中连续5天诱导氧诱导视网膜病变（OIR）。18
细胞和试剂
人类米勒细胞系MIO-M1（英国伦敦眼科和摩尔菲尔德眼科医院研究所G.Astrid Limb捐赠）和小鼠锥细胞系661W（俄克拉荷马大学健康科学中心细胞生物学系Al-Ubaidi博士捐赠）保存在杜尔贝科改良的Eagle培养基（DMEM）中（Invitrogen/Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德）补充100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素（均来自Gibco）和10%热灭活胎牛血清（佐治亚州劳伦斯维尔亚特兰大生物制品公司）。大鼠神经节细胞系RGC-5用1.0 g/L葡萄糖（Invitrogen/Gibco）、100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素（均来自Gibco）和10%热灭活胎牛血清（Atlanta Biologicals）保存在DMEM中。ARPE-19细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心）保存在DMEM/F12培养基（瑞士巴塞尔隆扎）、100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素（均来自Gibco）和10%热灭活胎牛血清（亚特兰大生物制品公司）中。37°C下，1μmol/L staurosporine在DMEM（不含血清或抗生素）中诱导RGC5分化1小时。所有培养物都保持在95%空气和5%CO的湿润气氛中237°C时。已描述过表达PGC-1α的逆转录病毒和腺病毒。19,20对于PGC-1α击倒后，MIO-M1s感染了携带慢病毒的人类PGC-1α短发夹（shPGC-1α）质粒或绿色荧光蛋白（GFP）短发夹（shGFP）质粒（从哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所的RNAi联盟获得），并被选作嘌呤霉素抗性。通过定量PCR（qPCR）证实PGC-1α的表达PGC-1α基因及其下游靶基因。蛋白水平的PGC-1α表达通过Western blotting检测。MIO-M1细胞在含有0.5%FBS的DMEM中饥饿过夜，然后在常氧或缺氧（完全缺氧）条件下保存24小时，然后采集用于qPCR或酶联免疫吸附测定VEGFA表达水平。根据制造商的说明，使用人类VEGF量化因子试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）在条件培养基上进行VEGFA酶联免疫吸附试验。
定量聚合酶链式反应
使用RNA-Bee溶液（德克萨斯州Friendswood的Iso-Tex Diagnostics公司）或TurboCapture 384 mRNA试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚的Qiagen公司）从组织和细胞中分离出总RNA。使用iScript（加利福尼亚州Hercules的Bio-Read实验室）或高容量cDNA逆转录试剂盒（加利福尼亚州福斯特市的Applied Biosystems）逆转录RNA。根据制造商的说明，使用SYBR Green Master Mix和ABI Prism 9700序列检测系统（Applied Biosystems）或CFX384实时系统（Bio-Read）进行qPCR反应。为了确保准确的基因量化，将PCR数据标准化为多个内部控制基因的平均值(人力资源部,企业对企业,ACTB公司、和TBP（待定）),21根据ΔΔC计算基因表达T型方法。qPCR研究的基因列表列于中列出了使用的相应引物.
表1
| 符号 | 姓名 |
|---|
| ACTB公司 | β-肌动蛋白 |
| TBP（待定） | TATA盒结合蛋白 |
| HPRT1型 | 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1 |
| 企业对企业 | β-2-微球蛋白 |
| COX5B公司 | 细胞色素c（c）氧化酶亚基Vb |
| ATP5O公司 | ATP合成酶，H+运输，线粒体F1复合物，哦亚单位 |
| PPARGC1A公司（别名PGC-1α) | 过氧化物酶体增殖物激活受体γ，辅激活物1α |
| 中国青年科学院 | 细胞色素c（c），体细胞 |
| 学术委员会（别名MCAD公司) | 中链酰基辅酶A脱氢酶 |
| VEGFA（血管内皮生长因子） | 血管内皮生长因子A |
| PDGFB公司 | 血小板衍生生长因子β多肽 |
| 角度1 | 血管生成素1 |
| 角度2 | 血管生成素2 |
表2
| 物种 | 符号 | 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| 鼠标 | Actb公司 | 5′-CCCTGTATGCCTGGTACCAC-3′ | 5′-GCCAGCAGGTCCAGACGCAGGATG-3′ |
| 鼠标 | Tbp公司 | 5′-CCCTATCACTCCTCGCCACACCAGC-3′ | 5′-GTGGCAATGGTCTTTAGGTCAAGTTACAGCC-3′ |
| 鼠标 | Hprt公司 | 5′-GTTAAGCAGTACCCCAAA-3′ | 5′-AGGCATACCAACAAAACTT-3′ |
| 鼠标 | 200万 | 5′-GTGCCCTTAGCTGTGCTCG-3′ | 5′-ACCTGAATGCTGGATCTC-3′ |
| 鼠标 | 考克斯5b | 5′-GCTGCATCTGTGAAGAGGACAAC-3′ | 5′-CAGCTTGTAATGGGTTCCACAGT-3′ |
| 鼠标 | 第5页 | 5′-AGGCCCTTTGCCAAGCTT-3′ | 5′-TTCTCCTTAGATGCAGCAGAGTACA-3′ |
| 鼠标 | PGC-1α∗ | 5′-gctgcatggttctgagtctaag-3′ | 5′-TCTGGTACCCAGGCAC-3′ |
| 鼠标 | 周期 | 5′-GCAAGCATAAGACTGGACCAAA-3′ | 5′-TTGTGGCATCTGTAAGAATC-3′ |
| 鼠标 | 阿卡德姆 | 5′-CAGCTAGCCACTGACGCCGTGCAG-3′ | 5′-GCTCACGAGCTAGACTCTG-3′ |
| 鼠标 | 素食主义者 | 5′-GAGGATGTCTCACTCGATGAT-3′ | 5′-TCTCAGACCACACATGAAGCC-3′ |
| 鼠标 | Pdgfb公司 | 5′-cgagccaagacgcctcacaagctcgg-3′ | 5′-GGCCGCTTGTCATGGTGTGC-3′ |
| 鼠标 | Angpt1型 | 5′-GAAAAATAGAAGTCGGAGATGGCCC-3′ | 5′-CCTATCTCAAGCATGGTGCCGTGTG-3′ |
| 鼠标 | Angpt2型 | 5′-GCCAGGTCAACACTCCC-3′ | 5′-GCAACCGAGTCTTGGAGTTGG-3′ |
| 人类 | HPRT1型 | 5′-TGGACAGGACTGAACGTCTTG-3′ | 5′-AGGCATACCAACAAAACTT-3′ |
| 人类 | ACTB公司 | 5′-GAGCGCGTACAGCTT-3′ | 5′-TCCTTAATGTCACGCACGATT-3′ |
| 人类 | COX5B公司 | 5′-GGAAGACCCTATTTAGTCCCCT-3′ | 5′-CCAGCTTGAATGGGCTCCCAC-3′ |
| 人类 | PGC-1α | 5′-GCTTTTCTGGGTGGACTCAAGT-3′ | 5′-TCTAGTGTCTCTGTGAGGACTG-3′ |
| 人类 | VEGFA（血管内皮生长因子） | 5′-CAACATCACCATGCAGATATGC-3′ | 5′-CCCACAGGGATTTTCTTGTCTT-3′ |
激光捕获显微切割
在无RNase条件下，将暴露于OIR模型的P17动物和对照动物的去核眼在最佳切割温度的复合物中进行快速冷冻。使用低温恒温器（Leica 3050S；Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）获得16微米切片，安装在聚对苯二甲酸乙二醇酯载玻片（Leica Microsystems）上，然后立即染色或在−80°C下储存。在激光显微切割之前，将切片固定并用50%，然后用75%的乙醇脱水，然后用无核水清洗（加州福斯特城Ambion）。切片在0.1%甲苯胺蓝染料（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）中短暂染色20秒，在无核酸水中漂洗，并在75%乙醇中脱色。使用激光显微解剖显微镜（AS LMD型；Leica Microsystems）捕获外核层（ONL）、内核层（INL）和神经节细胞层（GCL）。使用RNeasy Micro试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并通过纳米滴分光光度法进行量化（马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）。
西部印记
将细胞裂解物加载到NuPAGE Novex 4%至12%双三凝胶（Invitrogen）上，对蛋白质含量进行标准化。按大小分离后，将蛋白质转移到Immobilon膜（Millipore，Billerica，MA）。在室温下，用3%的牛奶在TBST缓冲液中封闭膜1小时，并用抗PGC-1α抗体（ST1202，1:1000；Calbiochem/Millipore）在4%的TBST缓冲溶液中的3%牛奶中培养过夜。然后在室温下，将膜与二级抗体（1:10000；宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）在TBST缓冲液中的3%牛奶中孵育1小时。
光谱域光学相干层析成像与ONL厚度量化
通过光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）（北卡罗来纳州三角研究公园Bioptigen）在活体麻醉动物上采集以视神经头为中心的图像。使用100条水平、光栅和连续的B扫描线进行体积分析，每条线由1200次A扫描组成。体积大小为1.6×1.6 mm。使用Photoshop CS4（Adobe Systems，San Jose，CA）测量每侧视神经100μm的横截面积上的ONL厚度。
现场杂交
通过将小鼠PGC-1αcDNA（核苷酸646至1307）的661-bp区域亚克隆到pBluescript KS+载体（Stratagene/Agilent Technologies，Santa Clara，CA）中获得PGC-1β探针，并转录在体外制备地高辛标记的反义和正义核糖探针。按照上述方法对扁平安装的视网膜进行杂交和染色，24进行了一些修改。样品在65°C下预杂交6小时，在60°C下杂交12小时。使用碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体（110932749101/2000；印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）在4°C下过夜进行检测。洗涤后，用NBT/BCIP底物（Promega，Madison，WI）进行显色反应。在颜色显影后，将扁平安装的视网膜固定在4%多聚甲醛中，嵌入最佳切割温度的化合物中，然后冷冻切片。
统计分析
数值表示为平均值±SEM（除非另有规定），并使用未配对学生的吨-测试。
结果
PGC-1α在视网膜细胞中强烈表达，并在视网膜发育过程中被显著诱导
PGC-1α是多组织代谢和血管生成的有效调节因子。PGC-1α在视网膜中的作用尚未研究。为了研究其作用，测定了小鼠视网膜中PGC-1α的相对表达。使用Trizol方法从各种小鼠组织（包括视网膜、心脏和肝脏）中制备总RNA。然后逆转录RNA，并表达PGC-1α用qPCR检测。如所示A、 PGC-1α在成人视网膜中表达良好，其水平与PGC-1α在许多组织中发挥重要作用的水平相当。这种表达模式与已公开的适度吞吐量微阵列分析中观察到的模式相匹配，包括BioGPS，其中PGC-1α的表达在许多视网膜成分中强烈检测到，包括视网膜色素上皮、虹膜和睫状体(补充图S1).
视网膜和视网膜发育过程中PGC-1α的表达。A类：提取所示成年小鼠组织的RNA，并对PGC-1α进行RT-qPCR。B类–D类：从出生后第1天（P1）到第17天的WT小鼠视网膜中提取RNA，并进行RT-qPCR。的表达式级别PGC-1α(B类)及其下游靶基因，中国青年科学院和MCAD公司(C类)，随着发育而增加，从P3激增到P7。PGC-1α的发育表达曲线也与血管外生长早期（直至P7）的VEGFA、PDGFB和ANG2表达相关。然而，在视网膜发育的后期，PGC-1α的高表达保持不变，而VEGFA的表达受到抑制(D类). *P（P）与P1相比<0.05。E类:现场P7.5和成人视网膜中PGC-1α的杂交。比例尺=50μm。
接下来，测量出生后发育过程中视网膜中PGC-1α的表达。如所示B、，PGC-1α在视网膜发育过程中，表达增加了20倍以上，早在P5开始，在P15到P17达到峰值。PGC-1α的诱导与线粒体功能相关基因的表达增加相一致，而线粒体功能是众所周知的PGC-1(中国青年科学院,MCAD公司;C） 以及一些血管生成基因，如VEGFA（血管内皮生长因子）,PDGFB公司、和ANG2型(D） ●●●●。有趣的是，尽管促血管生成因子的表达在P7（最大血管外生长时间）达到峰值，然后在视网膜发育的后期（P12至P15）下降，以允许血管丛重塑，25PGC-1α的表达仍然很高，这表明在P12以上的视网膜稳态可能需要PGC-1的持续表达。我们接下来使用就地杂交以确定视网膜中PGC-1α的表达模式。在P7.5，PGC-1α的表达在含有分化感光细胞（PR）的ONL中显著，在INL和GCL中更弱(E） ●●●●。在成人视网膜中，PGC-1α的表达更均匀地分布在所有细胞层(E） ●●●●。因此，PGC-1α在视网膜中表达良好，并在出生后早期视网膜发育过程中被强烈诱导，与视网膜的生理血管形成一致。
PGC-1α调节多种视网膜细胞类型中VEGFA的表达
上述数据和我们对骨骼肌的研究11,26提示PGC-1α可能调节视网膜VEGFA和血管生成。为了验证这一点，一些视网膜细胞系感染了表达PGC-1α的腺病毒，而不是GFP对照病毒，48小时后用qPCR检测VEGFA的表达。如所示腺病毒感染传递PGC-1α可有效诱导考克斯5b，PGC-1α的线粒体靶点，存在于许多视网膜细胞中，包括Müller（神经胶质）细胞（MIO-M1）(D） ，神经节细胞（RGC5）(A） ，PR（661W）(B） 和视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）(C） ●●●●。重要的是，PGC-1α也能有效诱导同一细胞中VEGFA的表达(，A–D）。多种视网膜细胞类型，包括星形胶质细胞、神经节细胞和RPE细胞，在正常和病理条件下均表达VEGF。27然而，Müller细胞被认为是视网膜内缺氧时VEGFA的主要来源。28因此，我们将注意力集中在这种细胞类型上。稳定表达MIO-M1细胞系PGC-1α，与空白对照组相比，是由逆转录病毒感染产生的。PGC-1α蛋白表达增加约两倍(E、 插图）。这种对PGC-1α的适度诱导有效地诱导了考克斯5b(E） ●●●●。然后将细胞置于低血清培养基中，有无缺氧，以尽可能模拟视网膜的缺血环境。PGC-1α过度表达显著增强了两者的缺氧诱导VEGFA（血管内皮生长因子）表达式(F） 和分泌物(G） 在这些细胞中。相反，MIO-M1细胞中小发夹RNA（shPGC-1α）对PGC-1的抑制显著抑制了正常和低氧诱导的VEGFA表达(H） ●●●●。因此，PGC-1α在常氧和缺氧条件下调节包括Müller细胞在内的多种视网膜细胞类型中VEGFA的表达。
PGC-1α调节视网膜细胞中的VEGFA。RGC5型(A类)，661瓦(B类)，ARPE-19(C类)和MIO-M1(D类)用表达小鼠PGC-1α或GFP的腺病毒感染（作为阴性对照）。感染后48小时，分离RNA并用qPCR检测基因表达。VEGFA在所有细胞中上调两到三倍。MIO-M1用携带空置或小鼠PGC-1α质粒的逆转录病毒感染。PGC-1α在蛋白水平的表达随着其靶基因的诱导而升高(E类). PGC-1α依赖性上调(F类)和分泌物(G公司)缺氧增强了MIO-M1细胞中VEGF的表达。shRNA敲低PGC-1α抑制VEGFA在常氧和缺氧条件下的表达(H（H）). *P（P）< 0.05.
缺乏PGC-1α小鼠视网膜血管发育异常
出生后视网膜发育过程中PGC-1α表达的显著上调及其对各种视网膜细胞中VEGFA表达的影响表明，PGC-1β可能在视网膜血管生长过程中发挥重要作用。为了测试这一点，从P4 PGC-1α缺陷小鼠获得视网膜扁平支架，与它们的同窝野生型（WT）对照相比，并用内皮细胞标记物异亮氨酸B4染色。PGC-1α−/−之前已经描述过老鼠，17但PGC-1α缺乏对视网膜血管的影响尚未见报道。如所示,PGC-1α−/−小鼠表现出对浅表血管丛生长的显著抑制，血管半径和面积减小就是证明。这种抑制与血管前缘尖端细胞数量减少以及毛细血管密度中度但显著降低有关().
视网膜血管发育延迟和毛细血管密度降低PGC-1α−/−老鼠。用isolectin-B4（绿色）和/或IV型胶原（红色）染色的平板支架在P4时评估视网膜血管的生长(A类)并量化(B类).PGC-1α−/−幼崽的血管半径缩小(红色箭头)与WT室友相比的面积(A类和B类). 血管前部的高倍显微照片显示尖端细胞数量减少(星号)英寸PGC-1α−/−与WT相比(A类). 在IV型胶原染色的P4视网膜平板上量化血管密度，发现毛细血管密度在PGC-1α−/−老鼠(n个=5至7）*P（P）< 0.05.
VEGFA对视网膜血管的动脉规格也很重要。29因此，我们描述了PGC-1α−/−通过将P13.5扁平安装的视网膜与孤立凝集素B4和平滑肌肌动蛋白（动脉化血管的标记物）共同染色(A） ●●●●。在这一阶段，视网膜血管网成熟为定义明确的小动脉、小静脉和毛细血管。从视盘萌生的小动脉和小静脉可以通过其管腔大小（小静脉较大）、小动脉周围无毛细血管区的存在以及平滑肌细胞覆盖范围（小动脉较强）在形态学上进行区分。尽管野生型动物平均有五对主动脉和静脉从视盘出芽，但27%的野生型动物的主血管对数量显著减少PGC-1α−/−动物(B） ●●●●。然而，每对都保持了适当的动静脉规格。这种表型与星形胶质细胞网络组织异常（未显示）或平滑肌细胞覆盖率改变无关。有趣的是，P13.5的血管密度PGC-1α−/−与P4.5相比，视网膜看起来正常()表明PGC-1α缺乏会延迟血管外生长，但不会降低最终血管密度或破坏动静脉分化。总之，这些结果表明PGC-1α有助于发育中视网膜的正常血管化。
主要动脉和静脉数量减少PGC-1α−/−老鼠。A类：在P13.5，WT和PGC-1α基因敲除的同窝婴儿的扁平视网膜与isolectin B4（绿色）和平滑肌肌动蛋白（红色）共染，以区分静脉（v）和动脉（a）。年主要动脉和静脉的数量减少PGC-1α−/−(B类)（平均值±SD，n个=7至11）*P（P）< 0.05.
尽管在视网膜发育早期观察到这些血管异常，但成年人的眼部结构和视网膜层在其他方面似乎正常PGC-1α−/−H&E染色切片显示的小鼠(、A和B）。通过视盘的SD-OCT成像也显示了正常的视网膜结构(C） ●●●●。ONL厚度的量化证实成人中没有明显的退化过程PGC-1α−/−老鼠(D） ●●●●。
正常的眼部和视网膜结构PGC-1α−/−老鼠。A类和B类：8周龄婴儿的H&E染色眼矢状切面PGC-1α+/+（重量）和PGC-1α−/−老鼠。A类：低倍镜显示正常的眼部结构；比例尺=500μm。B类：高倍镜显示视网膜组织无异常或层厚PGC-1α−/−小鼠；比例尺=50μm。C类：WT和PGC-1α−/−小鼠，ONL由双头箭头.比例尺=100μm。D类：OCT记录的ONL厚度从视神经头（OD）每100μ，n个=3至6）。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；IS，内部段；ONL，外核层；OS，外段。
PGC-1α−/−在OIR模型中保护小鼠免受ROP的侵害
ROP的特征是组织缺血导致过度新生血管。鉴于在MIO-M1细胞中观察到PGC-1α过度表达和缺氧对VEGFA水平的协同作用，我们推断PGC-1β缺乏可能会减弱ROP期间出现的过度新生血管。为了验证这一点，使用了重现ROP一些关键特征的小鼠OIR模型。在这个模型中，7天大的幼崽和它们的母亲一起被放置在高氧室（75%O2)过度的组织氧合减弱了发育性血管生成的缺氧驱动。第12天，幼崽回到环境空气中（21%O2)现在变钝的血管树不能再维持组织氧合。继而发生视网膜缺血，导致血管生成紊乱和致病性新生血管形成(A） ●●●●。
OIR期间PGC-1α表达的区域特异性调节。A类：OIR模型的示意图。B类：qPCR定量分析对照组（白条）和OIR（黑条）WT小鼠P12至P17视网膜总PGC-1α和VEGFA mRNA。C类：激光捕获显微切割前后视网膜切片的代表性图片。D类：通过qPCR对P17对照组和OIR视网膜的激光捕获ONL、INL和GCL的mRNA进行定量（log年轴）。结果表示为RE（相对表达），归一化为看家基因（平均值±SEM，n个=3至4）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
我们之前已经证明，骨骼肌细胞在缺血样条件下PGC-1α表达增加。11为了测试OIR小鼠视网膜中是否也存在这种情况，我们检测了从P12至P17小鼠分离的视网膜中PGC-1α的表达。当在整个视网膜中测量时，PGC-1α的表达在高氧治疗（P12B） 或在模型缺氧阶段（P12+6小时到P17，B） ●●●●。相比之下，VEGFA在P12处强烈下调，然后由相对低氧的视网膜快速而显著地诱导(B） ●●●●。然而，我们假设PGC-1α在不同视网膜层中的调节可能不同。激光捕获视网膜层后进行qPCR显示，PGC1α在视网膜层中的表达差异很大。光感受器外核层（ONL）中PGC1α的表达最强，其次是INL，而GCL表达的PGC-1α的基础水平低得多(D） ●●●●。OIR对PGC-1α表达的影响具有明显的层特异性。PGC1α在INL中显著诱导（超过190倍），而在ONL中减少约60%，在GCL中轻微诱导（但不显著）(D） ●●●●。当整合到整个视网膜上时(B） ，PGC-1α在ONL中的强表达以及OIR对其的抑制，从而完全掩盖了PGC-1β在INL中的显著诱导作用(D） ●●●●。INL含有Müller细胞，这是OIR过程中VEGF的主要来源。28因此，这些数据表明，OIR模型诱导的相对缺血可能在Müller细胞中有效诱导PGC-1α。
上述数据也强烈提示，在ROP的OIR模型中，PGC-1α上调可能参与VEGFA的病理诱导和血管增殖。因此，我们接下来分析了PGC1α缺乏对OIR模型的影响。如所示A、 并在中进行量化B、 病理性新生血管覆盖了大约11%经历OIR的WT P17小鼠扁平坐骑的面积。相比之下，只有约7%的OIR视网膜面积PGC-1α−/−小鼠有病理性血管生成的迹象(P（P）<0.01），减少了约36%。因此，PGC-1α的抑制在ROP的OIR模型中具有保护作用。
PGC-1α−/−小鼠受到OIR的保护。氧诱导视网膜病变（OIR）是通过暴露PGC-1α+/+（重量）和PGC-1α−/−小白鼠幼崽从P7到P12的氧含量为75%。A类和B类：在P17，采集视网膜并用isolectin-B4染色。血管闭塞区(黄色轮廓)使用Photoshop CS4软件量化新生血管区域（用白色标记）。PGC-1α的丢失不会影响无血管区，但显著减少新生血管面积(n个=7至9）**P（P）< 0.01.C类和D类：代表性象形图(C类)和量化(D类)P12高氧诱导的中枢血管硬化(n个=7至12）。ns，无统计学差异。E类：对暴露于OIR模型的P17动物的视网膜总mRNA进行qPCR分析，发现Cox5b和VEGFA在PGC-1α−/−小鼠与PGC-1α+/+(n个= 4). *P（P）< 0.05, ***P（P） < 0.001.
OIR模型中的病理性血管生成是由缺氧触发的，缺氧与高氧治疗产生的无血管面积成正比。为了测试血管生成是否减少PGC-1α−/−OIR小鼠反映出高氧治疗后风险区域减少，在高氧治疗结束后的第12天，另一组小鼠被处死。如所示，C和D，P12处的无血管面积在PGC-1α+/+和PGC-1α−/−动物。观察到的病理性血管生成减少PGC-1α−/−OIR模型中的小鼠(因此，A和B）并不反映高氧治疗结束时无血管区域的差异，相反，很可能反映了VEGFA的表达减少，以应对退出高氧治疗后的相对组织缺血。为了测试这一点，从PGC-1α−/−和接受OIR模型的WT小鼠。如所示E、 VEGFA的表达在PGC-1α−/−视网膜。总之，这些数据表明，在OIR模型中，PGC-1α的缺失可能通过减少VEGFA的表达来防止病理性新生血管。
讨论
我们在这里显示，PGC-1α调节视网膜的正常和病理血管生成。敲除小鼠中PGC-1α的缺失导致正常血管生长缺陷，同时减少OIR模型中过度病理性血管生成。
我们发现PGC-1α在许多视网膜细胞类型中调节VEGFA在体外PGC-1α对视网膜新生血管形成的主要作用可能是通过Müller细胞介导的，Müler细胞被认为是VEGFA的主要来源30也是低氧诱导血管渗漏和新生血管形成的主要原因。31与此一致，低氧条件增强了Müller细胞中PGC1α依赖性VEGFA的上调(). 当然，其他细胞也可能发挥作用。视网膜新生血管是由血管、胶质细胞和神经细胞之间的复杂相互作用调节的。32PGC-1α在PR发展中高度表达()最近发现与PR对光损伤的敏感性有关。16即使在严重缺氧的情况下，PR似乎也不是促血管生成分子的主要来源，但PR的缺氧状态可以影响VEGFA的表达和随后的血管生成反应。33然而，由于PGC-1α缺乏不会导致视网膜变性(和Egger等人16)PGC-1α依赖性调节PR代谢似乎不太可能导致我们观察到的氧依赖性新生血管减少。PGC-1α也可能参与内皮细胞的稳态。34然而，与其他类型的细胞相比，尤其是Müller细胞，内皮细胞中PGC-1α的表达极低(补充图S2)提示PGC-1α在Müller细胞中的作用可能更大。最后，从形式上讲，这里观察到的表型的某些方面可能反映了PGC-1α−/−老鼠。然而，对我们的研究结果最简单的解释是，PGC-1α的主要作用是在苗勒细胞中介导的，苗勒细胞被认为是VEGFA最强的分泌细胞。30精确表征PGC-1α在每种细胞类型中的功能将需要使用可用的PGC-1β漂浮等位基因进行细胞特异性缺失。
视网膜中的血管生成，特别是对生理和病理缺氧的反应，被认为主要由HIF-1途径介导，尽管有证据表明必须存在其他途径。10我们之前已经证明，骨骼肌中PGC-1α对VEGFA和血管生成因子的诱导独立于HIF-1α，而是通过孤儿核受体雌激素相关受体α（ERRα）的协同激活来实现的。11这里提供的数据表明，这种途径也可能在视网膜中发挥作用。有趣的是，我们没有在PGC-1α缺陷小鼠的OIR模型中观察到氧诱导血管硬化程度的任何变化，这表明与HIF-1蛋白相反，35PGC-1α不参与维持防止微血管闭塞的营养因子。研究视网膜发育和对OIR的反应将很有意义ERRα−/−老鼠。最终，尝试对这一新途径进行药理学干预也是很有意义的。例如，识别调节PGC-1α的小分子的筛选已经产生了一些结果，但仍处于早期阶段。36
我们观察到的未受质疑的表型的某些方面PGC-1α−/−小鼠未完全渗透（例如，). 这可能反映了可变遗传修饰物和/或其他途径的可变补偿的影响。例如，PGC-1β调节许多与PGC-1α相同的途径，包括骨骼肌中的血管生成。37我们没有观察到PGC-1βmRNA在PGC-1α−/−但补偿可能发生在转录后水平。因此，同时评估PGC-1α和β的缺失是很有意义的。这将需要在适当的细胞类型中有条件地删除，因为PGC-1α/β双删除小鼠在出生时死亡。38
眼睛中的PGC-1α调节通路可能是多种生理信号调节的重要节点。缺氧并不是缺血组织面临的唯一挑战。血流量不足也会导致营养素缺乏、pH值变化、中间代谢和细胞氧化还原状态的剧烈变化以及大量细胞外分子的积聚。这些代谢事件在调节血管生成中的作用尚不清楚。例如，Sapieha等人39最近的研究表明，缺氧视网膜积累细胞外琥珀酸，直接刺激神经节细胞分泌VEGFA和其他独立于HIF途径的血管生成因子。因此，缺血期间发生的复杂代谢事件显然与血管生成反应有关，但其机制尚未完全解决。PGC-1α在转录和翻译后水平上受到上游信号级联的广泛调节，包括cAMP、有丝分裂原活化蛋白激酶和强大的代谢传感器，如AMP活化蛋白激酶及sirtuin。14因此，PGC-1α除缺氧外还整合了多种代谢信号，并且处于将这些信号与眼部血管生成联系起来的理想位置。
总之，我们在这里显示PGC-1α在生理和病理生理条件下调节视网膜中的VEGFA和血管生成。对这一新途径的进一步研究可能会为治疗以不适当和紊乱的新生血管为标志的各种视网膜病变带来新的见解和方法，包括ROP，但也包括“湿性”年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。
致谢
我们感谢Andrea Giani博士和Aristomenis Thanos博士（波士顿马萨诸塞州眼耳医院）在SD-OCT图像采集方面的帮助。
脚注
由Dimes三月（Z.A.）、哈佛催化剂|哈佛临床和转化科学中心（Z.A和M.S.-G）、国家心脏、肺和血液研究所（Z.A.A.）、美国心脏协会（A.J.）、美国糖尿病协会（Z.B.）、埃里森基金会（Z.A.）支持，国家眼科研究所培训拨款（H.S.）和视力研究核心拨款（K.M.C.）、哈佛眼科学院预防失明研究无限制拨款（K.M.C.）、NIHR01EY022084（K.M.C.），以及哈佛大学及其附属学术保健中心的财政捐款。
M.S.-G.和A.J.对这项工作做出了同等贡献。
补充数据
补充图S2：PGC-1α在人Müller细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞中的相对表达。提取指示细胞的RNA，并对PGC-1α进行RT-qPCR。mRNA表达标准化为Müller细胞中的mRNA表达，并以线性形式显示(左侧面板)和对数形式(右侧面板). MIO-M1：人类米勒细胞。ARPE：成人视网膜色素上皮细胞。HUVEC：人脐静脉内皮细胞。误差线为±SEM。*与MIOM相比，P<0.05。
工具书类
1Yu D.Y.，Cringle S.J.，视网膜血管化和无血管化以及视网膜疾病动物模型中视网膜内的氧气分布和消耗。Prog视网膜眼部研究。2001;20:175–208.[公共医学][谷歌学者] 2Saint-Geniez M.，D'Amore P.A.玻璃体、脉络膜和视网膜血管的发展和病理学。国际开发生物学杂志。2004;48:1045–1058.[公共医学][谷歌学者] 三。Engerman R.L.、Pfaffenbach D.、Davis M.D.毛细血管细胞周转。实验室投资。1967;17:738–743.[公共医学][谷歌学者] 4菲尔普斯·D.L.早产儿视网膜病：1979年美国视力下降的估计。儿科。1981;67:924–925.[公共医学][谷歌学者] 5Sapieha P.、Joyal J.S.、Rivera J.C.、Kermorvant-Duchemin E.、Sennlaub F.、Hardy P.、Lachapelle P.、Chemtob S.早产儿视网膜病：了解生命的极端缺血性视网膜血管病。临床投资杂志。2012;120:3022–3032. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Alon T.、Hemo I.、Itin A.、Peer J.、Stone J.、Keshet S.血管内皮生长因子是新生视网膜血管的生存因子，与早产儿视网膜病有关。自然医学。1995;1:1024–1028.[公共医学][谷歌学者] 7Chen J.，Stahl A.，Hellstrom A.，Smith L.E.早产儿视网膜病变的最新研究进展：筛查和治疗。当前儿科手术。2011;23:173–178. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Mintz-Hittner H.A.、Kennedy K.A.、Chuang A.Z.、BEAT-ROP合作小组玻璃体腔注射贝伐单抗治疗早产儿3+期视网膜病变的疗效。N英格兰医学杂志。2011;364:603–615. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Arjama O.，Nikinmaa M.视网膜中的氧依赖性疾病：低氧诱导因子的作用。实验眼科研究。2006;83:473–483.[公共医学][谷歌学者] 10Vinores S.A.、Xiao W.H.、Aslam S.、Shen J.、Oshima Y.、Nambu H.、Liu H.和Carmeliet P.、Campochiaro P.A.。Vegf启动子缺氧反应元件在视网膜和脉络膜新生血管小鼠模型中的意义，但不包括视网膜血管发育。细胞生理学杂志。2006;206：749–758。[公共医学][谷歌学者] 11Arany Z.、Foo S.Y.、Ma Y.、Ruas J.L.、Bommi-Rededi A.、Girnun G.、Cooper M.、Laznik D.、Chinsomboon J.、Rangwala S.M.、Baek K.H.、Rosenzweig A.、Spiegelman B.M.通过转录辅激活剂PGC-1alpha对VEGF和血管生成的HIF-独立调节。自然。2008;451:1008–1012.[公共医学][谷歌学者] 12Kelly D.P.，Scarpulla R.C.控制线粒体生物发生和功能的转录调节回路。基因发育。2004;18:357–368.[公共医学][谷歌学者] 13Lin J.、Handschin C.、Spiegelman B.M.通过PGC-1转录辅活化因子家族进行代谢控制。单元格元数据。2005;1：361–370。[公共医学][谷歌学者] 14Handschin C.、Spiegelman B.M.过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1辅激活物、能量稳态和新陈代谢。Endocr版本。2006;27:728–735.[公共医学][谷歌学者] 15Arany Z.PGC-1辅活化剂与骨骼肌在健康和疾病中的适应性。当前操作基因开发。2008;18:426–434. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Egger A.、Samardziga M.、Sothilingam V.、Tanimoto N.、Lange C.、Salatino S.、Fang L.、Garcia-Garrido M.、Beck S.、Okoniewski M.J.、Neutzner A.、Seeliger M.W.、Grimm C.、Handschin C.PGC-1alpha确定小鼠视网膜的光损伤敏感性。公共科学图书馆一号。2012;7：e31272。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Lin J.、Wu P.H.、Tarr P.T.、Lindenberg K.S.、St-Pierre J.、Zhang C.Y.、Mootha V.K.、Jager S.、Vianna C.R.、Reznick R.M.、Cui L.、Manieri M.、Donovan M.X.、Wu Z.、Cooper M.P.、Fan M.C.、Rohas L.M.、Zavacki A.M.、Cinti S.、Shulman G.I.、Lowell B.B.、Krainc D.、Spiegelman B.M。PGC-1alpha基因缺失小鼠的适应性能量代谢缺陷与CNS相关多动。单元格。2004;119:121–135.[公共医学][谷歌学者] 18Smith L.E.、Wesolowski E.、McLellan A.、Kostyk S.K.、D'Amato R.、Sullivan R.、D'Amore P.A.氧诱导小鼠视网膜病变。投资眼科视觉科学。1994;35:101–111.[公共医学][谷歌学者] 19Vega R.B.、Huss J.M.、Kelly D.P.辅激活剂PGC-1与过氧化物酶体增殖物激活受体α在编码线粒体脂肪酸氧化酶的核基因转录控制中协同作用。分子细胞生物学。2000;20:1868–1876. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Puigserver P.，Wu Z.，Park C.W.，Graves R.，Wright M.，Spiegelman B.M.与适应性产热相关的核受体的冷诱导辅活化子。单元格。1998;92:829–839.[公共医学][谷歌学者] 21Vandesompele J.、De Preter K.、Pattyn F.、Poppe B.、Van Roy N.、De-Paepe A.、Speleman F.通过对多个内部控制基因进行几何平均，实现实时定量RT-PCR数据的精确归一化。基因组生物学。2002;三研究0034。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Saint-Geniez M.、Maharaj A.S.、Walshe T.E.、Tucker B.A.、Sekiyama E.、Kurihara T.、Darland D.C.、Young M.J.、D'Amore P.A.视觉功能需要内源性VEGF：Müller细胞和感光细胞存活作用的证据。《公共科学图书馆·综合》。2008;三：e3554。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Connor K.M.、Krah N.M.、Dennison R.J.、Aderman C.M.、Chen J.、Guerin K.I.、Sapieha P.、Stahl A.、Willett K.L.、Smith L.E.小鼠氧诱导视网膜病变的量化：血管丢失、血管再生和病理性血管生成的模型。国家协议。2009;4:1565–1573. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Saint-Geniez M.、Argence C.B.、Knibiehler B.、Audigier Y.编码apelin受体的msr/apj基因是视网膜血管系统中静脉表型的早期特异性标记。基因表达模式。2003;三:467–472.[公共医学][谷歌学者] 25Fruttiger M.视网膜血管系统的发展。血管生成。2007年；10:77–88.[公共医学][谷歌学者] 26Chinsomboon J.、Ruas J.、Gupta R.K.、Thom R.、Shoag J.、Rowe G.C.、Sawada N.、Raghuram S.、Arany Z.转录辅激活子PGC-1α介导运动诱导的骨骼肌血管生成。美国国家科学院程序。2009;106:21401–21406. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Gariano R.F.、Gardner T.W.发育和疾病中的视网膜血管生成。自然。2005;438:960–966.[公共医学][谷歌学者] 28Pierce E.A.、Avery R.L.、Foley E.D.、Aiello L.P.、Smith L.E.视网膜新生血管小鼠模型中血管内皮生长因子/血管通透性因子的表达。美国国家科学院程序。1995;92:905–909. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Stalmans I.、Ng Y.S.、Rohan R.、Fruttiger M.、Bouche A.、Yuce A.、Fujisawa H.、Hermans B.、Shani M.、Jansen S.、Hicklin D.、Anderson D.J.、Gardiner T.、Hammes H.P.、Moons L.、Dewerchin M.、Collen D.、Carmeliet P.、D'Amore P.A.选择性表达VEGF亚型小鼠视网膜中的动脉和静脉模式。临床投资杂志。2002;109:327–336. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Stone J.、Itin A.、Alon T.、Peer J.、Gnessin H.、Chan Ling T.、Keshet E.视网膜血管系统的发育是由神经胶质细胞缺氧诱导的血管内皮生长因子（VEGF）表达介导的。神经科学杂志。1995;15:4738–4747. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Bai Y.，Ma J.X.，Guo J.，Wang J.，Zhu M.，Chen Y.，Le Y.Z.Muller细胞衍生VEGF是视网膜新生血管形成的重要因素。病理学杂志。2009;219:446–454.[公共医学][谷歌学者] 32Vessey K.A.，Wilkinson Berka J.L.，Fletcher E.L.氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜功能和神经胶质细胞反应的表征。《计算机神经学杂志》。2011;519:506–527.[公共医学][谷歌学者] 33Lahdenranta J.、Pasqualini R.、Schlingemann R.O.、Hagedorn M.、Stallcup W.B.、Bucana C.D.、Sidman R.L.、Arap W.视网膜感光细胞变性小鼠和人类的抗血管生成状态。美国国家科学院程序。2001;98:10368–10373. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Valle I.、Alvarez-Barrientos A.、Arza E.、Lamas S.、Monsalve M.PGC-1alpha调节血管内皮细胞中的线粒体抗氧化防御系统。心血管研究。2005;66:562–573.[公共医学][谷歌学者] 35Duan L.J.、Takeda K.、Fong G.H.脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（PHD2）介导新生小鼠氧诱导视网膜病变。《美国病理学杂志》。2011;178:1881–1890. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Arany Z.、Wagner B.K.、Ma Y.、Chinsomboon J.、Laznik D.、Spiegelman B.M.基于基因表达的筛选将微管抑制剂鉴定为PGC-1α和氧化磷酸化的诱导物。美国国家科学院程序。2008;105:4721–4726. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Rowe G.C.、Jang C.、Patten I.S.、Arany Z.PGC-1β调节骨骼肌血管生成。美国生理内分泌代谢杂志。2011;301：E155–E163。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Lai L.、Leone T.C.、Zechner C.、Schaeffer P.J.、Kelly S.M.、Flanagan D.P.、Medeiros D.M.、Kovacs A.、Kelly D.P.转录辅激活物PGC-1alpha和PGC-lbeta控制心脏围产期成熟所需的重叠程序。基因发育。2008;22:1948–1961. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Sapieha P.、Sirinyan M.、Hamel D.、Zaniolo K.、Joyal J.S.、Cho J.H.、Honore J.C.、Kermorvant-Duchemin E.、Varma D.R.、Tremblay S.、Leduc M.、Rihakova L.、Hardy P.、Klein W.H.、Mu X.、Mamer O.、Lachapelle P.、Di Polo A.、Beausejour C.、Andelfinger G.、Mitchell G.、Sennlaub F.、Chemtob S。神经元中的琥珀酸受体GPR91在视网膜血管生成中起主要作用。自然医学。2008;14:1067–1076.[公共医学][谷歌学者] 
