细胞外基质：不仅仅是漂亮的纤维

摘要

介绍

所有细胞都与细胞外基质密切接触，无论是持续接触还是在其发育的重要阶段（例如，作为干细胞或祖细胞，或在细胞迁移和侵袭期间）。众所周知，细胞外基质（ECM）能够为器官和组织、基底膜形式的细胞层以及作为细胞运动底物的单个细胞提供结构支持。ECM在细胞黏附中的作用以及通过黏附受体（如整合素）向细胞发送信号的作用受到了广泛关注^1——三最近，人们提出了这样一种观点，即基质的机械特性（刚度、变形性）也为细胞行为提供了输入^4,5因此，很明显，ECM蛋白质和结构在细胞的决定、分化、增殖、存活、极性和迁移中起着至关重要的作用。可以说，ECM信号在控制这些过程中至少与可溶性信号同等重要，甚至可能更重要。这项工作在其他地方已经得到了很好的总结，这里没有空间进行审查。相反，我想强调ECM和ECM蛋白对细胞和组织行为的贡献的不同方面，即它们在将生长因子信号结合、呈递和整合到细胞中的作用。

ECM蛋白的复杂结构域

脊椎动物基因组中编码了数百种ECM蛋白。许多基因都是古老的，例如那些包含基底膜工具箱的基因（IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、珠光体聚糖、XV/XVIII型胶原蛋白），它们存在于大多数后生动物中，有人认为基底膜对多层生物的进化至关重要⁶然而，许多脊椎动物ECM蛋白/基因在后肠口谱系进化过程中进化得更晚，这种扩展不仅包括原有家族（如层粘连蛋白、胶原蛋白等）的精细化，还包括新蛋白（如纤维连接蛋白、tenascin等）。ECM蛋白的这种增殖有什么目的？ECM蛋白的几乎普遍特性是它们大而复杂，具有多个不同的结构域，并且这些结构域在不同的分类群中高度保守(图1). 为了生成强大、稳定的纤维，蛋白质不一定要大或复杂，中间丝蛋白质和I型胶原蛋白则相反。那么，为什么大多数ECM蛋白如此庞大、复杂和保守？许多ECM蛋白都有几十个单独折叠的结构域，但在大多数情况下，我们不了解其中多个结构域的功能。剩下的在那里干什么？保守结构域以特定的并置方式排列，有时受高度调控的选择性剪接控制。明确的含义是ECM蛋白的特定域和结构包含具有生物学意义和进化价值的信息。本文将根据有关典型ECM蛋白的结构、功能和相互作用的最新发现来探讨这一假设。

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图1

ECM蛋白的复杂结构域

图中显示了具有代表性的ECM蛋白质（基因组中数百个编码的蛋白质中）。这些蛋白质由多个独立折叠的结构域构建而成，这些结构域在进化过程中外显子洗牌后以不同的组合出现在不同的ECM蛋白质中。域结构是从SMART网站生成的(http://smart.embl-heidelberg.de/)并根据个别蛋白质的特定知识进行编辑。

A.纤维结合蛋白由单个基因编码，但在三个区域交替剪接（红色框中），在啮齿动物中产生12种蛋白质，在人类中产生20种蛋白质。FN3结构域广泛存在于ECM蛋白中。标记其他基质蛋白的结合位点。肝素-硫酸盐结合位点可以与蛋白聚糖（PG）或syndecan（一种完整的膜PG）相互作用。RGD（arg-gly-asp）整合素结合位点用红色星号标记，第二个LDV（leu-asp-val）整合素结合位点则用磅号标记。纤维结合蛋白是一种促血管生成分子，其功能因RGD位点或两个交替拼接的FN3结构域的消除而受损^36,37FN还结合促血管生成生长因子VEGF和HGF^16,17.

B.纤维蛋白-1三基因家族的成员。纤维素酶由EGF-like结构域组成，这些结构域存在于许多ECM蛋白中，还有TB（TGFβ结合，标记为T）和杂交（H）结构域，它们都是纤维素蛋白和LTBP的特异性结构域^21,22标记了原纤维蛋白-1内其他基质蛋白和生长因子的已知结合位点。

C.LTBP-1一个结构与纤维蛋白相关的四基因家族成员。TGFβ/LAP潜伏复合物以及纤维蛋白和纤维连接蛋白的已知结合位点被标记。

D.血栓反应蛋白-1。五基因家族成员³⁸血栓反应蛋白1和2的结构如图所示，都是抗血管生成的。抗血管生成活性在于与CD36受体结合的TSP1重复序列。TSP1重复序列也存在于其他ECM蛋白中。凝血酶原反应蛋白还包含EGF-like重复序列和VWC结构域，在其他蛋白质中已知可结合BMP。13个TSP3重复序列（紫色）和C末端结构域对血小板反应蛋白是唯一的，并结合多个Ca⁺⁺离子。

在所有蛋白质中，星号标记可能与整合素结合的RGD（arg-gly-asp）三肽序列，这在纤维连接蛋白中的类似基序中有很好的证明（见A）。

ECM蛋白和生长因子信号

一个由来已久的观点是ECM结合生长因子，这当然是真的。许多生长因子（如FGF、VEGF）与肝素和硫酸乙酰肝素（许多ECM蛋白聚糖的组成部分）密切结合。因此，普遍认为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（PG）作为生长因子的库或贮存器，可能有助于建立与ECM结合的生长因子的稳定梯度；这种形态梯度在模式发育过程中起着至关重要的作用。人们还经常提出，有时甚至证明，生长因子可以通过降解ECM蛋白质或PG的糖胺聚糖组分而从ECM中释放出来。这些模型将ECM置于远端，充当可溶性生长因子的局部贮存器，这些生长因子将从固相释放出来，作为传统的可溶性配体发挥作用。然而，一些生长因子实际上使用硫酸乙酰肝素作为辅助因子与它们的信号受体结合。FGF与FGFR的结合同时依赖于硫酸乙酰肝素链的结合⁷TGFβ配体首先与完整的膜蛋白多糖（如内切蛋白、β-糖苷）结合，结合和“呈现”在这些配体的信号传递中起关键作用⁸在某种意义上，它们是固相配体。这种现象可能比已知的少数几个经过深入研究的例子更为普遍。不太为人所知的是生长因子与ECM蛋白自身结合而不涉及糖胺聚糖的例子，但此类相互作用的文献越来越多，我将在这里论证，ECM蛋白呈现生长因子信号是ECM功能的重要组成部分。

在考虑ECM蛋白在调节生长因子信号反应中的潜在作用之前，重要的是首先解决一些相关概念，这些概念在思考和分析ECM向细胞发出信号的功能时需要分开。第一，很明显，标准ECM受体（如整合素和DDR酪氨酸激酶受体）本身就是信号转导受体——它们的配体是ECM蛋白中嵌入的特定结构域和基序，ECM-整合素相互作用导致细胞的信号转导反应，其复杂性和重要性至少与由EGF、PDGF和VEGF等可溶性配体触发的。这个话题已经被很好地回顾了^1——三我不会在这里进一步讨论。其次，也不太清楚的是，有许多关于整合素信号与各种生长因子信号之间“串扰”和“协同作用”的报告⁹在大多数情况下，这种串扰是否涉及[1]膜-近端相互作用或[2]下游信号转导途径中的合作尚不确定。我们对第二种情况不感兴趣，但稍后会回到第一种情况。20年前，尤尔根·恩格尔（Jurgen Engel）首次提出了另一个概念，当时ECM蛋白质的模块化性质首次显现，即ECM蛋白质内的固有结构域可能充当典型生长因子受体的配体¹⁰这一建议源于观察到层粘连蛋白含有多个EGF-like结构域副本，许多ECM蛋白（如层粘连素、tenascins、血小板反应蛋白、纤维蛋白）也是如此。恩格尔认为，它们可能与EGF受体结合，并发出信号固相配体。已经证明层粘连蛋白的EGF-like结构域^11,12或tenascin^13,14显示为可溶的配体可以与EGFR结合并调节其信号传导，通常假设ECM蛋白片段可以通过蛋白水解（例如通过基质金属蛋白酶）释放，并充当可溶性配体。该模型与基质结合生长因子可以通过ECM降解释放的想法类似。在这两种情况下，ECM都充当生长因子（结合的或内在的）的库，这些生长因子可以作为可溶性因子释放以结合其受体。然而，内在生长因子样配体可以从固相起作用这一有趣的想法值得更深入的研究，并与结合或内在配体的释放等替代方案进行仔细的实验区分。我们将探讨ECM蛋白与生长因子结合并呈现为有组织固相配体.

生长因子与ECM蛋白的结合

如前所述，许多生长因子与附在ECM和膜蛋白上的糖胺聚糖链结合已被广泛接受。然而，越来越多的证据表明，蛋白质本身具有生长因子的特异性结合。例如，纤维连接蛋白和玻璃体凝集素都与HGF结合，形成Met（HGF受体）和整合素（ECM受体）的复合物，导致细胞迁移增强¹⁵同样，VEGF与纤维连接蛋白（FN）和tenascin-C中的特定FN III型（FN3）结构域结合，这些结合促进细胞增殖^16,17重要的是，在FN-VEGF结合的情况下，对增殖的影响需要整合素和VEGF的结合位点位于相同的分子，表明需要并列两个受体（整合素α5β1和VEGFR2），而不是一些下游串扰¹⁶值得注意的是，FN3结构域在许多ECM蛋白和膜受体中普遍存在，其结合可溶性因子的潜力需要进一步研究。

还有其他广泛分布的ECM域结合并呈现生长因子的例子。例如，在果蝇，IV型胶原结合Dpp（BMP同源物）并增强其与BMP受体的相互作用；这种胶原/骨形态发生蛋白的相互作用对调节卵巢的背腹轴和生发干细胞数量至关重要，这两个过程都依赖于Dpp的梯度¹⁸IV型胶原是基底膜的普遍组成成分，是两种蛋白C末端结构域中确定的关键Dpp结合基序果蝇属IV型胶原亚基在门中高度保守，表明这种相互作用在许多其他情况下可能很重要¹⁸胶原蛋白II是软骨的主要胶原蛋白，它提供了另一个有启发性的例子。这种胶原蛋白在其N末端附近含有一个类似脉络膜的VWC结构域，该结构域结合TGF-β1和BMP-2这两种软骨生长因子。VWC结构域选择性剪接，包括在软骨前中胚层和早期发育的软骨中，但不包括在成熟软骨中¹⁹VWC/弦蛋白结构域存在于许多ECM蛋白以及BMP的已知调节因子中，通常作为其功能的负调节因子²⁰这两个例子说明了ECM蛋白的保守元件对BMP家族的扩散生长因子/形态因子的功能进行正调控或负调控的能力。

ECM结合对TGF-β的调节

关于生长因子和ECM的最成熟故事涉及不同ECM蛋白及其受体在TGF-β结合和调节中的作用。有三个基因编码TGF-β亚型1-3的前体。每个前体都被一种呋喃蛋白酶切割成成熟的TGF-β及其前肽，称为LAP（潜伏相关肽）。LAP和TGF-β在一种称为小潜伏期复合物（SLC）的复合物中保持非共价结合，并且在这种形式下TGF-^21,22LAP随后与一种潜在TGF-β结合蛋白（LTBPs）S-S键合，形成大的潜在复合物（LLC），许多细胞分泌已经组装成这种复合物的TGF-α。LTBP依次与其他ECM蛋白（包括纤维蛋白和纤维结合蛋白）结合，从而将不同的TGF-β亚型以潜在形式并入细胞外基质（参见图1和​和2A）。2安培). LTBP介导的掺入ECM对于随后有效激活TGF-βs是必要的。有几种激活机制（请参见图2B); 它们包括ECM蛋白的降解，如纤维蛋白或LTBP。激活也可以通过LAP的分裂或构象变化发生，暴露或释放TGF-β，以便它们能够结合并激活其受体^21,22另一种ECM蛋白，血小板反应蛋白，可以通过结合和解离LAP或激活金属蛋白酶来激活TGF-βs；缺乏血小板反应蛋白-1的小鼠由于肺部TGF-β活性水平降低而发生肺炎²³TGF-βs激活的另一种机制涉及αvβ6和αvβ8整合素，它们与LAP1和LAP3中的RGD序列结合^24,25αvβ8整合素似乎与金属蛋白酶协同释放TGF-β。然而，αvβ6整合素激活TGF-β，而不需要任何蛋白水解。相反，它与LAP结合，并且在表达整合素的细胞和SLC附着的ECM之间存在机械应变的情况下，使LAP变形以暴露相关的TGF-β（参见图2B). 活化的TGF-β不是以可溶性、扩散形式释放的，但似乎只在短范围内起作用，可能作为结合固相配体。因此，TGF-β的结合、潜在形式的隔离和随后的激活都与多种ECM蛋白密切相关；LTBP和纤维蛋白起到隔离TGF-β/LAP复合物的作用，血小板反应蛋白可以激活TGF-图2). 整个装配就像一台受调节的机器，包含了负调节和正调节；将TGF-β纳入基质锚定并以潜在形式定位生长因子，随后可通过蛋白水解或机械应变激活^21——25LAP中许多ECM蛋白、整合素和RGD位点的突变证实了这些相互作用的相关性体内.

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图2

ECM相互作用调节TGFβ

A.纳入ECM.

furin蛋白酶将Pro-TGFβ裂解为由TGFβ和LAP组成的小潜伏复合物（SLC）受到ECM蛋白emilin的抑制。SLC通过S-S键与TB结构域结合，与LTBP结合，形成大的潜在复合物（LLC），其中TGFβ不活跃^21,22.LTBP然后与纤维蛋白和纤维连接蛋白结合（参见图1特定交互域）。纤维蛋白竞争LTBP与纤维蛋白的结合³⁹纤维素酶与预先存在的纤维连接蛋白原纤维结合或组装成微纤维，纤维蛋白和纤维连接蛋白在ECM内进一步进行同聚和异聚相互作用。

B.激活ECM-结合的潜在TGFβ.

TGFβ可通过ECM蛋白和/或LAP的蛋白水解或直接通过血小板反应蛋白激活（见正文）。TGFβ也可被机械应变激活（绿色大箭头）。这种菌株是由通过αvβ6整合素施加的细胞骨架力引起的，整合素与LAP中的RGD位点结合，需要通过LTBP将TGFβ/LAP复合物附着到富含纤维连接蛋白的基质上，而后者又通过α5β1整合素附着到其他细胞上。纤维蛋白也可能通过整合素附着在细胞上。

对LAP、LTBP和纤维蛋白的进一步分析揭示了相互作用的分子细节。TGF-β/LAP复合物通过特定的TGF-结合（TB）结构域和相邻的EGF结构域与LTBP-1结合（参见图1). TB结构域和杂交结构域是TB和EGF结构域的杂交，它们对纤维蛋白和LTBP是唯一的，并且每个蛋白质中都有几个，这表明它们可能能够结合其他BMP家族成员(图1). 事实上，已知proBMP-7可以在含有杂交结构域和TB结构域的N末端区域与纤维蛋白-1结合²⁶此外，纤维蛋白-2和骨形态发生蛋白-7突变在导致小鼠并指和多指畸形中显示出遗传交互作用²⁷与之相关的人类疾病，先天性契约性蛛网膜下腔炎，是由纤维蛋白-2的突变引起的。因此，TGF/BMP和LTBP/纤维蛋白家族成员之间的其他重要功能相互作用似乎仍有待发现。不同的LTBP和纤维蛋白与不同TGF/BMP家族成员的相互作用有可能将不同的信号靶向不同的位置。

这种基于ECM的TGF-β功能调节对人类疾病的影响最近在Marfan综合征中变得非常清楚，这是一种由原纤维蛋白-1基因突变引起的遗传性疾病^28,29与许多其他靶基因编码ECM蛋白的遗传病一样，这种疾病与细胞外基质成分的组装缺陷有关，在这种情况下，微纤丝是其成分。该表型最初归因于ECM这些结构缺陷的机械后果。然而，已知的纤维蛋白与LTBPs的相关性表明，TGF-βs的激活也可能发挥作用，在马凡综合征小鼠模型中，TGF--β的激活显著增加，并且TGF-α拮抗剂可以改善纤维蛋白-1突变的许多表型后果^28,29这些见解已经在临床上得到应用。

细胞外基质蛋白作为定位的多价信号集合体

所讨论的例子说明了ECM蛋白中离散结构域在结合和调节典型生长因子功能中的作用。这些结构域中的许多在多种ECM蛋白中以不同的组合和排列被发现，并且还有更多这样的ECM/生长因子相互作用有待发现，这是一个合理的命题。

这些ECM蛋白中的其他结构域和基序有可能直接与细胞表面粘附受体如整合素结合。至少，细胞粘附位点和生长因子结合位点在相同的ECM蛋白中共存，使生长因子集中在靠近其自身细胞表面受体的位置。因此，通过与ECM结合在细胞水平上定位生长因子可以定位其信号传导，这一概念是生长因子与ECM结合有助于建立稳定梯度的想法的基础。根据该模型，形态梯度由可溶性因子、扩散因子和ECM共同组成，两者都是必要的。ECM-结合的生长因子可以局部释放，也可以以复合物的形式呈现，仍然与ECM蛋白结合，如前所述，ECM蛋白中的特定内在结构域（例如EGF-样结构域）也有可能（尚未证实）直接与生长因子受体结合。

ECM蛋白高度保守，不仅在特定结构域的序列中，而且在蛋白质内这些结构域的排列中。有趣的是，特定的域经常通过高度调控的选择性剪接插入或省略，从而改变域的补体。这可能改变特定生长因子的结合，如II型胶原中的VWC域¹⁹或与细胞表面受体的相互作用，如agrin。在agrin中，包含两个小外显子（A/y和B/z）分别赋予agrin与硫酸乙酰肝素和肌营养不良多糖结合的能力，并大大增强乙酰胆碱受体的聚集性³⁰我还提到大量数据表明ECM蛋白可以与生长因子协同作用，影响细胞增殖和迁移⁹虽然这种协同作用原则上不需要并置，但一些实验，如关于纤维连接蛋白（FN）与VEGF结合的实验表明，协同作用需要整合素和VEGF的结合位点结合在同一分子中，将它们作为FN的两个单独的底物结合片段来呈现，这是不够的¹⁶这种结果表明接近很重要，并提出了ECM分子凭借其有序的结构域组织，在膜平面上组织受体复合物的假设。这种复合物可以增强受体之间的膜近端调节，并促进所转导信号的整合(图3). 免疫突触中免疫调节受体的聚集（也涉及整合素和其他受体之间的串扰）可以发现一个有启发性的相似之处^31,32免疫突触具有亚结构-不同的受体占据突触内的不同区域。ECM介导的簇可能具有高度详细的亚结构，不同受体的并置可能由ECM蛋白中几个纳米分辨率的结构域的排列驱动。可以将ECM蛋白及其相关伙伴（生长因子和其他ECM蛋白）视为固相生长因子隐喻性地演奏曲调，而可溶性生长因子可以被视为演奏单个音符(图3).

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图3

ECM蛋白与细胞的多域相互作用

所示的例子是纤维连接蛋白⁴⁰已知多个结构域与整合素、其他ECM蛋白和生长因子结合，如图所示。整合素家族α5β1和α4β1分别与RGD和LDV基序结合；syndecan（紫色/蓝色）的硫酸乙酰肝素链与FN3-13结合，VEGF也是如此。证据表明VEGF(V、，黄色）当与纤维连接蛋白结合时，通过自身受体（VEGFR2）更有效地发出信号¹⁶。此处对HGF提出了同样的建议(H（H）)及其受体（Met，粉红色）。如所示图1和​和2，2,纤维蛋白（绿色）结合到纤维连接蛋白的N末端区域，然后再结合长期业务伙伴（蓝色），用于招募转化生长因子β在与LAP（蓝色新月形）的潜在复合物中。αvβ6整合素可以结合LAP中的RGD位点，激活转化生长因子β，这样它就能结合自己的受体（橙色）。建议是纤维连接蛋白在两个水平上组织和整合所有这些信号。首先，通过向ECM招募生长因子，纤维连接蛋白将这些信号定位在细胞水平其次，纤维连接蛋白结构域的紧密并列将不同的受体聚集在一起，形成一个有组织的亚微米补丁在细胞表面膜上。每个结构域的直径为2-4nm，所示的整个纤维连接蛋白亚基的长度为60-70nm，因此受体将紧密并置，以便它们的信号向细胞提供复杂、完整的信息——隐喻性地生成旋律和和弦，而不是每个受体生成的“单个音符”。纤维连接蛋白对血管生成至关重要，大多数结合受体和配体已被证明在血管生成中发挥作用。该模型表明纤维连接蛋白及其相关ECM蛋白协调并整合这些信号。此外，纤维连接蛋白的选择性剪接结构域（深绿色卵形）对血管的正常发育也是必要的，合理的假设是，它们会在混合物中引入额外的配体和/或受体。

这种模型还有其他含义。ECM的本质将空间上下文强加给信号。细胞通常因其与ECM的结合而极化，ECM是上皮片附着的基底膜，它定义了细胞的基底和极性，并赋予对可溶性生长因子（如EGF）作出反应的能力。有充分证据表明，ECM的可变形性会影响细胞对其的响应^{2——4,33,34}ECM分子具有灵活性和可扩展性，机械张力可以发现其中的隐秘位点³⁵这种机械暴露的隐秘位点可以结合额外的细胞表面受体或生长因子。机械延伸或选择性剪接结构域的包含或排除也可能改变其他结构域之间的物理关系，从而影响假想的受体组织斑块的组成和空间排列。

对未来研究的影响

本简要回顾中探讨的想法需要进一步的实验研究。ECM蛋白中的结构域与特定生长因子结合的例子相对较少，但更广泛地研究这种可能性是很容易的。更清楚的是，结合ECM的生长因子是否需要释放为可溶性形式，或者是否可以作为固相配体，以及ECM蛋白的固有结构域可以直接影响典型生长因子受体（无论是作为固相配体还是作为局部释放的可溶性配体）这一命题的情况更少，需要更多的研究。域的特定安排提供重要信息的想法可以得到验证。机械应变对生长因子、受体或其他ECM蛋白的隐性结合位点暴露的可能影响尚处于探索阶段。ECM诱导的膜受体复合物的性质可以通过FRET、FLIM、高分辨率EM和交联等方法进行研究。需要研究ECM蛋白的调节选择性剪接对所有这些问题的影响，以及蛋白质家族（如LTBP和原纤维蛋白）内多样性的影响。

细胞外基质（ECM）是细胞微环境的基本组成部分，在脊椎动物的进化过程中已显著扩大。其中一些精化对骨骼和牙齿等结构成分有贡献，但很明显，这只是ECM的一个作用。ECM提供的不仅仅是机械支持，而且是细胞粘附和迁移的场所，这一丰富证据应纳入我们对ECM在基底膜、干细胞壁龛和肿瘤中潜在作用的思考。所有上皮细胞至少在其生命的一部分时间里都与基底膜相关，许多干细胞龛内都有ECM。ECM的组成和组织在癌症中发生根本性改变，可能影响肿瘤和基质细胞的生存、增殖和其他特性。自从50多年前麦库西克（McKusick）对影响细胞外基质的一系列不同遗传病进行初步识别和分类以来，人们一直隐含地认为，病理后果是ECM组装缺陷的直接结果。虽然这些缺陷确实存在，并且毫无疑问会导致Marfan综合征和相关疾病，但现在很明显，许多表型后果是ECM缺陷导致的TGFβ信号失调的间接影响。如果没有基因治疗或干细胞治疗，结构缺陷很难治疗，但生长因子信号提供了更简单、更容易获得的干预靶点。人们可以希望，对ECM蛋白在调节信号事件中的作用的进一步研究将产生此类额外的线索。

致谢

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