孕激素缺乏型额颞叶痴呆诱导的多能干细胞模型揭示了特异性可逆神经元缺陷

FTD患者特异性iPSC向神经元的分化

接下来，我们使用我们实验室提供的方案，将每个受试者在第20-26代的三个完全重新编程的iPSC系分化为有丝分裂后神经元(Delaloy等人，2010年). 分化始于神经诱导，随后是神经前体细胞的扩增和神经成熟。第一步，诱导多系分化和类胚体（EB）形成，在饲养细胞上维持iPSCs时效率低下。将多能干细胞适应于无馈条件，可形成稳定可靠的EB(图2，A和B). 悬浮5-6天后，用碱性成纤维细胞生长因子和补充N2启动神经诱导，出现圆形排列的玫瑰花状细长细胞(图2C). 十天后，分离玫瑰花结，将其作为神经球悬浮扩张3-4周(图2D)，并分解成单个细胞。用胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子、抗坏血酸和环腺苷酸诱导终末分化。两周后，细胞显示出典型的神经元形态(图2F). FTD和对照iPSC的分化速度相似。

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图2

FTD和对照iPSCs诱导的人有丝分裂后神经元的分化和特征

（A-E）神经元分化不同阶段细胞的相控图像。比例尺，100μm。

（F） MAP2染色的2周龄细胞的代表性图像。核染色显示为蓝色。

（G，K）MAP2和GFAP阳性细胞占2周培养的所有细胞的百分比。

（H-J）VGLUT1、GABA和TH阳性细胞（分别为谷氨酸、GABA能和多巴胺能标记物）占MAP的百分比⁺细胞。平均而言，每次实验在G-K小组中分析200个细胞（n=3个独立培养物）。数值为平均值±SEM。（L）控制神经元和PGRN S116X神经元的电生理特性。通过电流从0 pA注入到400 pA（100 pA阶跃）的阶跃去极化反应的代表性动作电位，可被河豚毒素阻断。n=每条线24。（M） 来自对照组（蓝色）和PGRN S116X神经元（黑色）的mEPSC样本痕迹。所有神经元（每行10个）均表现出突触反应，并被AMPA受体拮抗剂NBQX阻断。

（N） 对照组（蓝色）和PGRN S116X神经元（黑色）的平均mEPSC轨迹。

另请参见图S2.

然后我们确定疾病和/或突变是否影响通过该方案获得的神经元的百分比。2周后，大约80%的培养细胞对神经元标记物微管相关蛋白2（MAP2）呈阳性反应，并且具有神经元形态(图2G)，不到4%的细胞对胶质标记物胶质纤维酸性蛋白呈阳性，而不管所用iPSC系的基因突变如何(图2、G和K). 因此，PGRN S116X突变不会影响分化方案产生的神经元百分比。MAP2的大约40%⁺细胞可能是谷氨酸能细胞并表达VGLUT1(图2H)，GABA细胞不到10%⁺抑制神经元或TH⁺多巴胺能神经元(图2，I和J). 同样，从对照组和FTD患者特异性iPSC系分化出的神经元百分比无法区分。信使核糖核酸水平的额外分析表明谷氨酸能(VGLUT1型)，GABA能源(GAD67型)和多巴胺能(真实航向)神经元亚型或突触后密度(PSD95型)未检测到不同线路之间的显著差异(图S2，A-D). 因此，PGRN S116X突变并不影响iPSC向特定类型神经元的神经分化。

接下来，我们进行了全细胞电压钳记录，并测量了从两个iPSC系（对照系20和PGRN S116X系26）分化出的神经元的膜特性和突触传递(图2L-N). 培养的大多数细胞能够诱导河豚毒素敏感性动作电位（对照组：79.2%，PGRN S116X:75%），这与大约80%的细胞是MAP2阳性神经元的发现一致(图2G). 两种细胞系之间的静息膜电位没有显示出统计上的显著差异（对照神经元：−62.5±1.5 mV，PGRN S116X:−60.0±1.9 mV，n=24，p=0.17）。为了解决这些细胞是否可以形成功能性突触连接，我们发现PSD95点状存在于这些神经元的树突上(图S2E)并测量了AMPA型谷氨酸受体介导的微兴奋性突触后电流（mEPSCs）。从PGRN S116X iPSCs分化出来的神经元显示出与对照神经元无法区分的突触连接[对照神经元的mEPSC振幅：12.1±1.7 pA，PGRN S 116X：14.37±1.7 p A，p=0.36；对照神经元的频率：3.2±0.6 pA；PGRN s 116X：2.2±0.2 pA，n=10，p=0.12]。这些结果表明，与对照组和PGRN S116X iPSC分化的有丝分裂后神经元具有功能。

Progranulin单倍体缺乏的人类神经模型

为了建立人原核蛋白单倍体不足的神经元模型，我们首先通过qRT-PCR检测了每个受试者成纤维细胞中原核蛋白的表达水平。GRN公司对照组和散发性FTD患者细胞中的mRNA水平相似(图3A)但在患有PGRN S116X突变的FTD患者的细胞中，mRNA水平仅为对照组的30%左右(图3A). 这一观察结果与患有FTD的患者的平均血浆丙二醇水平显著降低相一致GRN公司与没有这种突变的人相比(科波拉等人，2008年; Finch等人，2009年）。然而，重新编程后GRN公司所有三个PGRN S116X iPSC系的mRNA均降低50%(图3B)，如预期。此外GRN公司所有对照组或散发性FTD iPSCs中的mRNA几乎没有变化(图3B). 相应地，PGRN S116X iPSCs分泌的progranulin比对照组和散发性FTD患者的iPSCs少50%(图3C).

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图3

前列腺素单倍体缺乏的FTD患者特异性神经元模型

（A）GRN公司成纤维细胞mRNA表达水平。

（B、D）GRN公司来自对照组、散发组和PGRN S116X受试者的iPSC株（B）和从iPSC分化的神经元（D）中的mRNA表达水平。对照（成纤维细胞）或对照品系20的值设置为1（n=3-4个独立培养物）。

（C，E）iPSCs（C）和iPSC-derived neurons（E）在24小时内分泌到培养基中的progranulin量。对照品系20的值被设定为100%（n＝3-4个独立培养物）。

（F） 收集培养基后iPSC-derived神经元的细胞内progranulin水平。对照品系20的值设置为100%（n=3-4个独立培养物）。在面板（A-F）中，数值为平均值±SEM**第页< 0.01; ***第页<0.001，患者细胞与对照细胞进行比较。

另请参见图S3.

在分化时，GRN公司PGRN S116X神经元的mRNA水平比对照组和从多个iPSC系分化的散发性FTD神经元低约41%(图3D). ELISA检测到，这些神经元中细胞内和分泌的原核蛋白水平也相应降低(图3，E和F). 因此，我们建立了progranulin单倍体不足的患者特异性人类神经元模型。我们还能够将这些iPSCs分化为小胶质细胞，如小胶质细胞特异性标记物Iba1的表达所示(图S3、A和B). 这些细胞的孕激素分泌也比对照和散发性FTD细胞低约50%(图S3、C和D).

PGRN S116X神经元对PI3K/Akt和MEK/MAPK信号通路抑制剂诱导的细胞应激更敏感

与许多其他神经退行性疾病相比，与FTD相关的细胞缺陷仍不明确。从患者特异性多能干细胞衍生的人类神经元是检测疾病基因特异性细胞表型的极好系统。为此，我们首先使用每个患者的两个iPSC细胞系，并将其分化为有丝分裂后的神经元。在正常培养条件下，PGRN S116X和对照神经元表现出相似的活性。作为一种迟发性疾病，FTD可能是由于损伤随着时间的推移而累积，而不是由于丙二醇水平降低的急性影响所致。对于人类神经元中progranulin单倍体不足所导致的细胞缺陷知之甚少。因此，为了确定PGRN S116X神经元中可能受损的通路，我们对影响不同关键细胞功能/通路的各种细胞应激诱导物进行了系统筛选，如线粒体、氧化应激、内质网、蛋白酶体和细胞存活。来自健康个体和散发FTD病例的神经元被用作对照。

我们测试了两种众所周知的线粒体功能障碍诱导剂，寡霉素（一种ATP合酶抑制剂）和鱼藤酮（一种复合I抑制剂），以及一种经典的氧化应激诱导剂（过氧化氢）。所有三种细胞应激诱导剂均以剂量依赖性方式降低细胞活力，所有基因型或疾病状态均受到同等影响(图S4、A、B; 由于空间限制，未显示寡霉素数据）。相反，PGRN S116X神经元比对照神经元更容易受到由蛋白N-糖基化抑制剂衣霉素诱导的内质网（ER）应激(图4A)和乳酸菌素诱导的蛋白酶体活性抑制(图S4C). 因为散发的FTD神经元对衣霉素和乳酸菌素也表现出类似的敏感性增强(图4A和图S4C)，我们得出结论，这些细胞表型并不是针对progranulin缺乏症的。

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图4

PGRN S116X神经元新的细胞和分子缺陷可以通过表达Progranulin来修复

（A-C）应激诱导剂对人类神经元的影响。数值以暴露于二甲基亚砜（对照）的细胞百分比表示（n=3-4个独立培养物）。

（D） 暴露于10 nM staurosporine、0.5μM tunicamycin或DMSO 24 h后的Caspase-3样活性。

（E和F）前颗粒蛋白表达挽救后细胞活力（E）和胱天蛋白酶-3激活（F）的测量。n=5-6个独立培养基。

（G） 热图显示了与对照神经元相比，从散发性FTD病例（蓝色）或PGRN S116X患者（fucsia）的四个iPSC系中的每一个分化出的2-3个神经元培养物中基因表达的折叠变化。

（H） 阵列上的基因表达变化GRN公司和RPS6KB2型对数倍数的变化是相对于对照神经元的。

（I和J）Progranulin表达可恢复PGRN S116X神经元中的S6K2蛋白水平。S6K2（对照品系17和PGRN S116X品系1）的代表性western印迹图像（I）以及在品系17、20（对照品）和、1、26（PGRN S 116X）（J）上进行的三个实验中S6K2相对于GAPDH的定量。在所有面板中，数值均为平均值±SEM。*：第页< 0.05, **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001.

另请参见图S4.

为了进一步探讨FTD神经元中前颗粒蛋白依赖性细胞缺陷，我们还测试了staurosporine（一种广谱激酶抑制剂，可诱导细胞凋亡）的作用(图4B). 有趣的是，PGRN S116X神经元对staurosporine比对照或散发性FTD神经元更敏感(图4B). 这一发现表明，丙二醇缺乏症影响参与细胞生存的激酶途径，使其更容易受到这些途径的抑制。

为了验证细胞活性测定的结果，我们还测量了caspase-3的激活，这是一种经过充分研究的凋亡细胞死亡介质。与细胞活性测定结果一致，与对照或散发FTD神经元相比，PGRN S116X神经元对staurosporine的反应显示caspase-3激活更大，而突尼斯霉素增加了PGRN S 116X和散发FTD神经细胞中caspase-2的活性(图4D). 因为TDP-43病理学是患有前列腺素缺乏症的FTD患者大脑的标志(Neumann等人，2006年)caspase-3活性增加导致TDP-43的断裂增强和定位错误(Zhang等人，2007年)，我们还分析了TDP-43在压力下的细胞分布，以证实我们的初步发现。暴露于staurosporine后，PGRN S116X神经元中TDP-43从细胞核重新分布到细胞质的神经元百分比显著高于对照或散发FTD神经元(图S4D). 相比之下，衣霉素导致PGRN S116X和胞质TDP-43散在神经元的百分比增加。有趣的是，在缺乏应激诱导剂的情况下，含有胞质TDP-43的PGRN S116X神经元的百分比高于对照或散发的FTD神经元(图S4D). 因此，caspase-3和TDP-43分析都证实了PGRN S116X神经元在压力下的内在脆弱性。

由于staurosporine是一种广谱激酶抑制剂，影响多种信号通路，因此我们接下来测试了更特异的激酶抑制剂，以确定受降低的progranulin水平影响的特定通路。PGRN S116X神经元比对照或散发的FTD神经元更容易受到沃特曼的影响(图4C)和LY294002（数据未显示），两种PI3K抑制剂和PD98059，一种MEK抑制剂(图S4E). 这些发现表明，前颗粒蛋白缺乏会损害人类神经元中的PI3K/Akt和MEK/MAPK信号通路。

qRT-PCR、免疫细胞化学、iPSCs的分化和表征、电生理学

大多数实验都是按照描述进行的(Delaloy等人，2010年)稍作调整。请参阅补充资料了解更多详细信息。

PGRN测量

收集前24小时，向细胞中加入新鲜培养基。收集培养基后，用PBS清洗细胞一次，用NP-40缓冲液溶解细胞，并进行三次冻融循环。将培养基和细胞裂解物在4°C下以12000rpm离心10分钟，以清除细胞碎片。用BioRad试剂测定细胞裂解物上清液的蛋白质浓度。根据制造商的说明，稀释总细胞裂解物和培养基，并使用ELISA试剂盒（加利福尼亚州圣地亚哥Alexis生化试剂盒）测定progranulin水平。将数据归一化为蛋白质浓度。

应激诱导毒性试验

将两周大的神经元暴露于以下应激诱导剂下24小时：衣霉素、他吡加金、鱼藤酮、寡霉素、staurosporine、wortmannin、LY294002、PD98059或DMSO。根据制造商的说明，使用WST1细胞增殖试验（德国彭茨堡罗氏应用科学公司）测定细胞活力。Caspase-3活性测定在补充资料.

我们感谢患者家属，他们的慷慨使这项研究成为可能。我们还感谢S.Ordway的编辑协助，J.A.Lee在本项目早期的帮助，以及J.Miller和Gao实验室成员的讨论。这项工作由加利福尼亚再生医学研究所（RL1-00650，FBG和RVF Jr.）的拨款发起，并由马萨诸塞大学医学院（FBG和KF）的启动资金支持。这项工作也得到了美国国立卫生研究院（NS057553，FBG；AG019724和AG023501，BLM）、FTD研究联盟（FBG和DHG）的部分支持。