诱导多能干细胞显示人体皮肤中的体细胞拷贝数嵌合体

逆转录聚合酶链反应

总RNA为使用PicoPure RNA从hiPSC克隆的第5代至第13代中纯化隔离套件（Arcturus）。使用SuperScript III逆转录酶和随机六聚体对从hiPSC株中提取的100毫微克总RNA进行逆转录。ES细胞标记基因引物在其他地方有描述³¹用于Oct4、c-Myc和Sox2的引物专门检测内源性基因的转录物。β-actin作为负荷对照。

亚硫酸氢盐测序

使用亚硫酸氢甲酯转化试剂盒（加利福尼亚州生命技术公司）将200 ng来自成纤维细胞或hiPSC的基因组DNA转化为亚硫酸氢盐。用10月4日的引物集7通过PCR扩增亚硫酸氢盐转化的DNA³²和设置3³³对于Nanog。使用以下成分进行PCR：200μM dNTPs、200 nM正向或反向引物和2单位PfuTurboCx热启动DNA聚合酶（安捷伦科技公司，加利福尼亚州），PCR条件为95°C 5分钟，95°C 35个周期30秒，58/55°C 1分钟，72°C 1 min，然后在72°C下延长10分钟。然后克隆PCR产物，并为每个扩增子选择7-8个菌落进行Sanger测序。

神经元分化

神经分化是通过对hiPSC领域已经使用的方案稍作修改来实现的^13,34将保存在Matrigel上的未分化hiPSC菌落与ROCK抑制剂（Y-27632）预先孵育，分离成单个细胞，然后使用V-bottom Aggrewell平板在含有重组Noggin（200ng/mL）的无血清培养基中重新聚集。两天后，将产生的类胚体（EB）转移到皮氏培养皿中，在悬浮培养中再培养两天，然后转移到无血清培养基中的Matrigel底物中，该培养基补充有Noggin（200ng/mL）、FGF2（20ng/mL）和Dkk1（200ng/mL）。24小时后，EB产生被称为玫瑰花结的神经上皮结构。在FGF2和EGF（均为10ng/mL）存在的情况下，在聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿上人工解剖、解离和重新定位神经玫瑰花结后，获得单层神经祖细胞（NPC），这允许增殖的神经祖细胞扩增（3或4代）。

基因表达分析用微阵列

通过HumanHT-12 v4 BEADCHIP Illumina微阵列分析上述分离的总RNA。数值由GenomeStudio使用分位数归一化和背景减法进行分析。将差异分数与从联邦批准的H1人类胚胎干细胞（hESC）系获得的值进行比较。

配对末端（PE）RNA和DNA测序的文库准备

对于RNA-seq文库，聚腺苷化RNA片段通过Dynabeads mRNA纯化试剂盒（invitrogen，CA）纯化，片段化（RNA片段缓冲区，Ambion CA），并使用随机六聚体和上标II（invitro，CA）反转录成第一链cDNA，然后使用RNaseH和DNA聚合酶I（invitrogen，CA）合成第二链cDNA。在与Illumina成对末端适配器结扎之前，对cDNA进行末端修复，并在3′端添加一个“a”。在凝胶上运行后，使用MinElute凝胶纯化试剂盒（Qiagen，MD）切割并提取250至350 bp的DNA片段，并使用Phusion High-Fidelity主混合物和Illumnia PE引物在98°C条件下进行PCR扩增，98°C 15个循环10秒，65°C条件30秒，72°C条件30s，以72°C结束5分钟。

为了制作DNA文库，遵循了PE DNA样品制备的Illumina协议，并进行了少量修改。简而言之，对gDNA进行声波处理，生成200bp至800bp的片段，这些片段经过末端修复，末端附着“A”，与Illumina PE适配器连接，大小在2%E-gel（Invitrogen，CA）上选择（450bp–550 bp）并从凝胶中提取。最后的PCR步骤与RNA-seq文库制备相同，但有18个周期。

hiPSC中线性CNV的保守预测

使用BWA 0.5.9-r16³⁵带有选项“-t 4-q 15”的对准器，我们已将基因组序列读取与1000基因组项目使用的人类参考基因组对齐(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000基因组/ftp/technical/reference)，它基于hGRC37，包含少量额外的连接。对齐读取由BWA使用以下选项“-a 1000-n 1-n 1”进行配对、映射和排序。因此，对于每个序列样本，我们都获得了一个BAM格式的映射读取文件。为了预测CNV，使用CNVnator方法处理bam文件^26,36其基于读取深度分析（参见Mills等人。²⁷供审查）。为了分析低覆盖率下测序的基因组，我们使用了1000 bp的箱子。为了分析在高覆盖率下测序的两个基因组，我们使用了400 bp的箱子。然后，在hiPSC和相应的成纤维细胞中，我们估计/基因分型并比较（通过CNVnator）hiPSC中预测的CNV拷贝数（CN）。在正常细胞中，CN应该是一个整数（例如0、1、2等），但是，如果用于分析的细胞群不是异质的，那么CN可以是一个非负实数（例如1.5）。如果i）中国^我<1.5&中国^（f）>1.5&中国^（f）–中国^我>0.5; 或ii）中国^我<0.5&中国^（f）>0.5&中国^（f）–中国^我>0.5男性样本中的X和Y染色体。在这里，中国^我和中国^（f）分别代表iPSCs和成纤维细胞样品中的CN。同样，如果iii）中国^我>2.5&中国^（f）<2.5&中国^我-中国^（f）>0.5; 或iv）中国^我>1.5&中国^（f）<1.5&中国^我-中国^（f）>0.5男性样本中的X和Y染色体。换句话说，我们认为CNV在成纤维细胞中的估计等位基因频率至少为25%，与hiPSC株相比，等位基因的频率差异至少为25%。然后，我们手动检查RD信号轨迹，以选择最有信心的线状CNV（LM-CNV）候选进行验证。为了选择有信心的候选者，我们依靠人类专业知识直观评估候选者区域的RD信号，存在支持预测的不一致配对读码（见下文），以及在片段重复区域需要非常明显的信号；我们还考虑了CNV是否是以前发现的CNV^27,37.重新估计了两个CNV边界。通过qPCR、aCGH、PCR和ddPCR对筛选出的可靠LM-CNV候选基因进行了实验验证。

hiPSC中线性CNV的敏感性预测

为了使用CNVnator进行更敏感的CNV呼叫，我们使用了选项“relax”，这允许我们找到等位基因频率低至12.5%的CNV，而默认选项为25%。值得注意的是，二倍体染色体上的杂合缺失/重复具有50%的等位基因频率。此外，我们放宽了将CNV声明为LM-CNV的标准。具体而言，我们使用了以下标准i）中国^我<1.7&中国^（f）>1.5&中国^（f）–中国^我>0.3; 和ii）中国^我<0.7&中国^（f）>0.5&中国^（f）–中国^我>0.3要求在二倍体和单倍体染色体上分别进行线性缺失。同样，我们使用了iii）中国^我>2.3&中国^（f）<2.5&中国^我-中国^（f）>0.3; 和iv）中国^我>1.3&中国^（f）<1.5&中国^我-中国^（f）>0.3要求在二倍体和单倍体染色体上分别进行线性重复。换句话说，与hiPSC株系相比，我们认为CNV在成纤维细胞中具有估计的等位基因频率（低至15%）和等位基因的频率差异（低至15%。

通过配对分析获得CNV的额外支持

为了获得预测CNV的额外支持，我们在hiPSC细胞系和亲代成纤维细胞中搜索异常映射的配对基因（PE）³⁸。对于删除，支持PE必须映射到预期的方向，但与测序库准备中的预期PE相比，其跨度应更大。对于串联复制，支持PE smust贴图的方向与预期不同，并且跨度也较大(补充图57). 预测的重复可能是串联的，也可能是分散的。对于分散复制，我们搜索了PEs簇，其中一端映射接近预测的复制边界，另一端在基因组中某处聚集。众所周知，见Lam等人。³⁹在读映射不明确的断点附近，CNV被富集为重复序列和同源序列。因此，预测的CNV没有PE支持并不会使CNV无效。我们认为，如果PE具有适当的（针对CNV类型的）读取映射模式，并且其跨度和预测的CNV大小至少有80%的相互重叠，则PE支持删除/复制。这种条件和预测的CNV的千基大小保证了支持性PE的跨度至少为几个kbp，这远远大于测序文库准备的预期跨度，即300-800 bp。最后，尽管我们不需要任何特定的读取映射质量，但每个支持读取不低于25（根据映射器，这意味着不正确映射的几率小于0.003）。由于只找到了大约100个支持读取，我们不希望其中任何一个被错误映射。

用于LM-CNV调用验证的qPCR

引物对是使用罗氏应用科学公司的ProbeFinder软件设计的(https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/index.jsp). ProbeFinder扫描假定CNV中心附近2-4kbp的DNA序列，UCSC In-Silio PCR确认引物对设计(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)和底漆-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)对于唯一性和染色体位置，只有一个产物和扩增子大小。

用于参考靶点分析的对照引物从RPP30基因中获得65 bp扩增子（正向引物：AGATTGGACCTGAGCGG；反向引物：GAGCGGCTGCCACAAGT），从ZNF423基因中获得128 bp扩增子。已知这些基因在单倍体人类基因组中以单拷贝形式存在^40,41。使用Applied Biosystems StepOne实时PCR系统（ABI）和SYBR®绿色化学进行实时定量PCR。实验数据使用StepOne Software v2.1进行处理。采用比较Ct法分析成纤维细胞和iPSCs中CNV的数据。

每个引物集的所有反应均以一式三份的形式进行，并由相同的主混合物制备而成，该主混合物包含1×Power SYBR Green PCR master mix、300nM CNV正向引物、300nM CNV反向引物和10ng基因组DNA。热循环条件包括在95°C下预运行10分钟和40个循环，其中95°C变性步骤持续15秒，然后60°C退火/延伸步骤持续60秒。在每次运行中，将成纤维细胞校准品与每个CNV的iPSC样品并行扩增。对于每个CNV测定，还包括重复的无模板阴性对照运行。

RNA-Seq分析及其与基因组CNV的相关性

Tophat公司⁴²用于将数据与人类基因组（hGRC37）和动态构建的外显子和剪接文库进行比对。使用SAMtools将BAM格式的Tophat输出转换为SAM格式⁴³然后，使用RSEQ工具⁴⁴映射读取格式（MRF）。对于每个GENCODE⁴⁵基因，RSEQtools用于计算转录物的标准化丰度水平，以RPKM，Reads Per Kb Per Million mapped Reads为单位。

对于来自同一个人的hiPSC的每一个三联体，我们选择了与三联体中至少一个hiPSC中的LM-CNV交叉的基因，并且在至少一个hiPSC中具有不同的零表达（保守地说，超过5个标准偏差）。然后，在同一个三联体中的hiPSC之间，比较有无LM-CNV的所选基因的表达值。

PCR检测成纤维细胞异质性

为了验证LM-CNV候选基因并检测成纤维细胞中的异质性，特异性引物(补充表3)设计用于靶向与删除区域相邻的区域两侧或复制区域的5′和3′端。通过这种方式，只有在存在缺失或重复的情况下才能扩增特定产物。来自HapMap细胞系GM12878的基因组DNA用作阴性对照。PCR使用10 ng iPSC gDNA、500 ng（即过量）成纤维细胞gDNA、500ng阴性对照的gDNA、200uM dNTPs、200 nM正向和反向引物、1.5 mM Mg²⁺和4单位Taq聚合酶（Invitrogen，CA），使用热循环条件，包括95°C 2分钟，35个95°C循环30秒，56°C循环30s，72°C循环30min，最后72°C延长5min。对于一个事件，进行了第二轮30个周期的PCR，以进一步增加信号。对于第一次PCR产物产量可观的CNV，在相同条件下进行额外的30个周期的PCR，但起始成纤维细胞gDNA的量减少到10 ng（即等于hiPSC的gDNA量）。所有特异扩增的PCR条带在2%的E-gel（Invitrogen，CA）上运行，凝胶由MinElute凝胶纯化试剂盒（Qiagen，MD）提取，提取的DNA用正向和反向引物测序。使用AGE将结果带与参考基因组对齐⁴⁶导出准确的CNV断点。

数字PCR检测成纤维细胞LM-CNV细胞频率

数字液滴PCR（ddPCR）⁴⁷使用Bio-Rad QX100平台Quantalife系统（Bio-Rad-Laboratories Inc.，Hercules CA）执行。按照制造商的说明，由ddPCR母液和TaqMan试剂组成的20ul PCR反应混合物被分成15000到20000个油包水滴。每个化学均质液滴都支持热循环中的PCR扩增。TaqMan试剂能够对扩增的参考区和靶区进行荧光标记。然后将PCR产物插入自动液滴流式细胞仪中，在该仪器中测量液滴的单色、同时双色检测。鉴于PCR混合物被随机分为15000到20000个反应囊泡，泊松统计可应用于该过程，以获得样品的目标核酸定量。

在这种情况下，VIC荧光探针与靶向RPP30基因的扩增子杂交，作为每个细胞中应有两个拷贝的参考区域（由BioRad提供的探针和引物）。合成了LM-CNV特异性FAM探针，以便将其与针对给定LM-CNV的扩增子杂交。引物设计用于靶向LM-CNV，使扩增子包含断点序列，FAM探针设计用于尽可能直接与该断点序列杂交（来自加利福尼亚州圣地亚哥IDT的LM-CNV特异性引物和探针）。在给定液滴中没有靶向LM-CNV的情况下，不会发生PCR反应。然后参照RPP30事件计数计算目标区域的拷贝数。

ddPCR检测参考区域和靶CNV的等位基因计数。让米是参考区域的测量值（即计数），以及米_CNV公司是hiPSC中靶CNV等位基因的测量值（即计数）。然后假设hiPSC中的细胞群体均匀，我们预计二倍体染色体上LM-CNV的目标杂合CNV的估计等位基因频率约为50%（一个单倍体没有LM-CNV），单倍体染色体上LM-CNVs的约为100%。那就是

（这里我们需要乘以2来解释单倍体染色体，因为参考区域位于二倍体染色体上）。事实上，我们观察到测量值与上述预期值非常接近，验证了我们的假设，即hiPSC细胞是均质的，LM-CNV是杂合的。

由于实验可变性（例如引物效率），这两个比率与0.5或1.0略有不同。作为实验偏差引入b条解释差异，然后用hiPSC

给我们b条=0.5*米/米_CNV公司单倍体染色体的任何二倍体。

使用相同的逻辑，我们现在可以得出成纤维细胞中LM-CNV等位基因频率的估计。让F类是参考等位基因的测量值（即计数），以及F类_CNV公司是成纤维细胞中目标CNV等位基因的测量（即计数）。等位基因频率可估算如下

b条是从对hiPSC的数据分析中估计的，并且通常接近1。这个小区CNV频率也就是说，携带CNV的细胞数量可以估计为

单倍体或二倍体染色体。

为了评估该方法的敏感性，我们进行了一项阴性对照实验，将S1123家族中确认的LM-CNV的引物应用于03家族的样品，该家族没有这种特异的LM-CN。对于三个副本中的6146个参考等位基因，我们只观察到一个LM-CNV等位基因的虚假计数。对于我们按照制造商的说明设计和使用的所有引物，hiPSC中的等位基因比率没有超过预期的1:2（一条二倍体染色体）或1:1（单倍体染色体上）的16%。因此，我们估计了一个修正系数b条小于1.16，估计背景噪声为2*1/6146*1.16=0.038%。因此，0.1%的等位基因频率估计值与背景噪声至少相差1.63个标准差（假设噪声计数具有泊松性质）。

我们感谢NIH、AL Williams教授基金和Harris教授基金的支持。我们还感谢耶鲁大学生物医学高性能计算中心；其支持团队（尤其是Robert Bjornson和Nicholas Carriero）。我们感谢Ami Klin博士在家庭招聘方面提供的重要帮助。我们感谢Maria Vittoria Simonini博士的技术帮助，感谢In-Hyun Park博士在iPSC系列特性描述和iPS PGP1-1礼品方面的建议，感谢Stephen A.Duncan博士赠送iPS K3 iPSC系列。我们感谢以下拨款支持：NIMH MH089176和MH087879、西蒙斯基金会和康涅狄格州，它们资助了hiPSC的生成和表征；国家卫生研究院拨款：RR19895，为仪器提供资金。我们感谢耶鲁临床研究中心在获取活检标本方面提供的临床支持。我们感谢耶鲁大学基因组分析中心的John Overton博士对DNA和RNA测序的建议。最后，我们感谢斯坦福大学的Maeve O'Huallachain女士和Jennifer Li-Pook-Than博士就ddPCR实验的规划、实施和分析提出的建议。