由于小分子代谢的重组伴随着致癌转化,癌细胞获得了与正常细胞不同的代谢责任1——4人们对确定这些责任并利用它们开发新的癌症选择性治疗非常感兴趣5许多癌细胞激活有氧糖酵解,因此即使在氧气可用于氧化磷酸化的情况下,也表现出较高的葡萄糖摄取率和乳酸排泄率6几种糖酵解酶以及输入葡萄糖和输出乳酸的转运蛋白被认为是药物开发的目标7——13我们进行了功能丧失基因筛查,以确定影响癌细胞对3-溴丙酮酸(3-BrPA)敏感性的基因,3-溴丙酸是一种正在临床开发的候选药物14,15.3-BrPA具有细胞毒性作用,通过抑制糖酵解作用降低细胞能量水平16.除糖酵解酶外17——19,3-BrPA还可以抑制几种非糖酵解酶20——24而且,由于其结构简单,可能在细胞内有不止一个直接蛋白质靶点。因此,3-BrPA很可能是一种毒性分子,而不是糖酵解的特异性抑制剂。在这里,我们确定SLC16A1型基因产物单羧酸转运体1(MCT1)是3-BrPa摄取和敏感性的主要决定因素,因此我们提出了利用MCT1介导的转运向糖酵解肿瘤传递有毒分子的治疗策略。
在单倍体或近单倍体哺乳动物细胞中进行基因陷阱插入突变,可以在全基因组范围内筛选基础细胞生理学基因的功能缺失25——27例如,在近单倍体KBM7人细胞系中进行筛选,确定了几种病毒和微生物毒素产生细胞毒性作用所必需的宿主因子28——30为了将这种方法应用于3-BrPA的研究,我们使用逆转录病毒感染创建了一个含有约7000万个插入片段的突变单倍体KBM7细胞库,该库涵盖了KBM7中约98%的所有表达基因30用3-BrPA处理诱变细胞,将存活细胞扩大为一个池。通过大规模平行测序,将抗性群体中的插入片段映射到人类基因组。使用邻近指数分析来识别包含多个紧密邻近的基因陷阱插入的基因组区域。SLC16A1型和BSG公司(Basigin)是两种最常见的失活基因()与未选择的对照细胞相比,其插入富集程度最高(分别为p=4.7E-121和p=5E-29)(补充图1). 得分最高的基因,SLC16A1型编码MCT1,MCT1是一种H+连接的单羧酸转运体,可从细胞中分泌乳酸,在某些癌症中高度上调31——36得分第二高的基因Basigin是护送MCT1到达质膜所必需的伴侣37,38为了深入研究MCT1丢失的影响,我们分离了两个克隆(克隆A和克隆B),它们在MCT1缺失的第一内含子中进行插入SLC16A1型基因()免疫印迹法检测不到MCT1蛋白(). 与筛选结果一致,MCT1缺失细胞对3-BrPA剂量具有完全耐药性()亲代KBM7细胞诱导细胞死亡并伴有caspase-3激活(补充图1). 重要的是,MCT1-null细胞中MCT1的重新表达几乎完全恢复了其对3-BrPA的敏感性(). 因此,这些数据强烈表明MCT1是KBM7细胞中3-BrPA敏感性的重要决定因素。
单倍体细胞基因筛查确定了3-BrPA敏感性所需的MCT1(一)用3-BrPA处理突变的KBM7细胞,收集耐药克隆。基因陷阱插入位点通过大规模平行测序确定,并映射到人类基因组。Y轴表示邻近指数,这是插入的局部密度的度量。X轴代表按基因组位置排序的插入位点。(b条)中唯一插入站点的地图SLC16A1(MCT1)和BSG公司存活细胞群中的(Basigin)基因。方框表示外显子。(c(c))两个克隆衍生细胞系MCT1蛋白的免疫印迹研究SLC16A1型(克隆A和B)。(d日)与野生型KBM7细胞相比,MCT1-null KBM7克隆对3-BrPA(50μM)的抗性。3-BrPA处理3天后野生型和MCT1-null KBM7细胞的显微镜分析(左)和存活曲线(右)。误差线为±SEM。比例尺,20微米。(e(电子))MCT1-null KBM7细胞中MCT1的外源性表达可恢复其对3-BrPA的敏感性。误差线为±SEM(n=3)。
为了了解MCT1缺失如何导致3-BrPA抵抗,我们检测了3-BrPA对亲代和MCT1-null KBM7细胞代谢的影响。在缺乏3-BrPA的情况下,不同细胞类型之间的乳酸生成或耗氧量没有差异(补充图2)表明MCT1的丢失在很大程度上不会改变基础能量代谢。相反,3-BrPA导致细胞外酸化率(ECAR)(乳酸生成的指标)和总ATP水平显著降低()亲代KBM7细胞,但不是MCT1-null细胞。与这些发现一致,3-BrPA不影响能量应激标记物AMPK和ACC磷酸化39,在MCT1-完整细胞中,而在野生型对应物中,细胞数量显著增加(). 为了更全面地描述细胞对3-BrPA反应的代谢状态,我们对用3-BrPA处理的野生型和MCT1-null KBM7细胞进行了代谢分析。相对于MCT1-null细胞,在野生型KBM7细胞中,3-BrPA导致3-磷酸甘油醛之前的糖酵解中间产物积累,3-磷酸甘油甲醛是磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的底物,但随后的糖酵素中间产物消耗殆尽。此外,3-BrPA处理的野生型KBM7细胞积累了磷酸戊糖途径的中间体,该途径在糖酵解的GADPH步骤之上分支(). 此外,RNAi对GAPDH表达的部分抑制减缓了癌细胞的增殖并使细胞对3-BrPA治疗敏感(补充图3). 3-BrPA先前已被证明抑制GAPDH17以及其他几种糖酵解酶,包括己糖激酶(HK2)40,41,乳酸脱氢酶(LDH)19,琥珀酸脱氢酶(SDH)18,42醛缩酶(ALDOA)43和丙酮酸激酶(PKM)44,45然而,我们的代谢物分析强烈暗示GAPDH抑制是其抗糖酵解作用的主要原因(). 总之,这些数据表明,MCT1-null KBM7细胞对3-BrPA的代谢作用具有显著的抵抗力,这表明3-BrPA在没有MCT1的情况下可能不会进入细胞,并表明MCT1是3-BrPA转运蛋白。
MCT1-非完整细胞对3-BrPA的代谢效应具有免疫力,并且不能运输3-BrPA(一)添加3-BrPA(50μM)后野生型和MCT1-null KBM7细胞的胞外通量分析。添加50μM 3-BrPA后,监测乳酸生成的替代物ECAR的变化。结果显示为添加3-BrPA前ECAR读数的百分比。误差线为±SEM(n=10)。(b条)使用基于荧光素酶的分析方法,用指定浓度的3-BrPA处理60分钟后,测定野生型和MCT1-null KBM7细胞中的细胞内ATP水平。误差线为±SEM(n=6)。免疫印迹显示3-BrPA(50μM)处理后野生型和MCT1-null KBM7细胞中AMPK和ACC的磷酸化状态。(c(c))3-BrPA处理后野生型和MCT1-null KBM7细胞之间相对代谢物变化的热图。黄色至蓝色条表示变化程度(对数2)相对于MCT1-null KBM7细胞的代谢物丰度。用50μM 3-BrPA培养细胞1小时,获得细胞内代谢物并用LC-MS分析(n=3)。(d日)14在存在/不存在过量未标记的3-BrPA(500μM)的情况下,MCT1-完整和野生型KBM7细胞对C-3-BrPA的摄取。误差线为±SEM(n=3)。请注意,在某些情况下,错误栏太小,无法看到或被符号隐藏。
事实上,与亲代KBM7细胞相比,MCT1-null细胞没有吸收14C-标记的3-BrPA(). 未标记的3-BrPA以及在较小程度上已知的MCT1底物,如乳酸和丙酮酸,有效地与放射性标记3-BrPA的摄取竞争,证明这种转运是特定的(补充图3). 此外,与MCT1介导的转运的pH依赖性一致31,46细胞外pH值降低,3-BrPA摄取增加(补充图3). 因此,MCT1对于3-BrPA的细胞摄取是必要的,并且考虑到其运输单羧酸盐的能力46,可能直接运输3-BrPA。
考虑到人类基因组中有许多MCT和SMCT,我们采取了一种无偏见的方法来询问MCT1水平是否是3-BrPA敏感性的最具预测性的指标。在一组15个癌细胞系中,我们测定了IC503-BrPA诱导的细胞死亡值,并将其与来自癌症细胞系百科全书(CCLE)的转录组宽mRNA表达数据相关联47令人惊讶的是,在检测的20000个mRNA中,SLC16A1型信使核糖核酸水平是3-BrPA敏感性的最佳预测指标(r=−0.89,p=1.4E-5)(). 此外,MCT和SMCT单羧酸转运体家族中没有其他成员的表达与癌细胞株的3-BrPA敏感性显著相关(,补充图4). 最后,另一种单羧酸转运体Jen1p最近被认为是酵母中3-BrPA的主要载体48然而,该转运体与任何人类基因产物都没有同源性。
MCT1表达是癌细胞中3-BrPA敏感性的主要决定因素(一)给药3天后出现50%细胞生长抑制的3-BrPA浓度(IC50)对15个癌细胞株进行了检测。这些值与来自癌症细胞系百科全书(CCLE)的转录组mRNA表达数据相关,并对所得的皮尔逊相关系数进行排序和绘制。红点表示SLC16A1(MCT1)而蓝点表示MCT和SMCT转运蛋白家族的成员。图中显示了运输乳酸的所有家族成员的姓名。(b条)免疫印迹显示9种不同乳腺癌细胞系的MCT1蛋白水平(左)。与相应IC相关的相对蛋白质水平50每个细胞系的3-BrPA值(右)。(c(c))表达对照GFP蛋白或MCT1的SK-BR-3和MDA-MB-231细胞中MCT1水平的免疫印迹(左)。表达MCT1 cDNA并用3-BrPA处理的指示细胞系的存活曲线(右)。误差线为±SEM(n=3)。(d日)14亲代和MCT1-过表达MDA-MB-231细胞中C-3-BrPA的摄取。误差线为±SEM(n=3)。(e(电子))靶向对照GFP蛋白或MCT1(MCT1_1和MCT1_2)的表达shRNAs的指示细胞系经3-BrPA处理后的免疫印迹和存活曲线。误差线为±SEM(n=3)。((f))用载体或3-BrPA(8 mg/kg)治疗3周后,表达MCT1或GFP cDNA的MDA-MB-231细胞形成的肿瘤的代表性照片(左)和平均重量(右)。误差线为±SD(n=5)。请注意,在某些情况下,错误栏太小,无法看到或被符号隐藏。
接下来,我们询问MCT1的表达是否也可以预测单个癌症类型中3-BrPA的敏感性,并将重点放在乳腺癌细胞系上,因为它们表现出特别广泛的MCT1表达水平(补充图5). 事实上,MCT1蛋白水平高的乳腺癌细胞株对3-BrPA敏感,而MCT1水平低或无的乳腺癌患者对甚至高浓度的3-BrPA都有耐药性(). MCT1在两个低MCT1表达的乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和SK-BR-3)中的稳定表达足以使其对3-BrPA敏感(). 此外,与KBM7细胞一样,MCT1的表达并没有改变乳酸的产生或耗氧量,但确实增强了14C-3-BrPA摄取(). 最后,RNAi对MCT1表达的部分抑制足以赋予具有高水平MCT1的细胞系(BT-20,BT-549)对3-BrPA的抗性()。
为了测试MCT1的表达是否会影响已建立肿瘤对3-BrPA、亲代MDA-MB-231细胞(表达低水平MCT1)的敏感性(补充图5)在裸鼠左侧侧翼皮下注射,同时在同一动物的对侧侧翼注射稳定表达MCT1的MDA-MB-231细胞。在开始服用3-BrPA之前,我们让可触及的皮下肿瘤形成2周。经过3周的3-BrPA治疗后,强制表达MCT1的肿瘤明显小于未经治疗或经3-BrPA处理但表达对照蛋白(GFP)的肿瘤(,补充图5). 这些结果表明,MCT1的表达足以使预先形成的肿瘤对3-BrPA治疗敏感,并对确定3-BrPA敏感性具有预测价值体内。
我们还研究了MCT1高表达的癌细胞是否具有任何代谢特性。使用耗氧率(OCR)与ECAR的比值来衡量OXPHOS和糖酵解对细胞能量产生的相对贡献,我们将15个癌细胞系的OCR/ECAR比值与从CCLE获得的全基因组表达数据进行了比较。有趣的是,除了两种糖酵解酶(LDHB和PGM1)外,MCT1基因的表达与较低的OCR/ECAR比率密切相关(,补充图5). 这一发现表明,糖酵解率最高的肿瘤更有可能出现MCT1水平升高,因此对3-BrPA治疗更敏感()。
MCT1表达与癌细胞糖酵解上调相关(一)使用海马细胞外通量分析仪测定15个细胞系的OCR/ECAR值。这些值与来自癌症细胞系百科全书(CCLE)的转录组mRNA表达数据相关,并对所得的皮尔逊相关系数进行排序和绘制。(b条)使用3-BrPA的有毒货物交付策略示意图。糖酵解癌细胞表达高水平的MCT1,对3-BrPA敏感。MCT1水平低/无MCT1的癌细胞对3-BrPA具有耐药性。
我们的结果预测,MCT1表达水平将作为一种生物标记物,用于识别可能对3-BrPA治疗有反应的肿瘤14,15此外,由于我们发现MCT1表达与糖酵解升高相关,因此可能通过糖酵化抑制剂的联合治疗来增强3-BrPA的疗效,从而开发肿瘤的高糖酵分解需求和MCT1的癌性表达。有趣的是,抑制癌细胞乳酸输出的MCT1小分子抑制剂正在开发中,有望成为抗癌治疗药物11,49虽然这种方法要求表达MCT1,并且MCT1对癌细胞生存至关重要11,493-BrPA治疗的独特之处在于,它只需要MCT1的表达即可有效。例如,KBM7细胞对3-BrPA敏感,但MCT1的完全丧失并不影响其生存能力。
最后,我们的数据进一步表明,3-BrPA的毒性作用不是其抗糖酵解作用的结果,而是其高度烷基化性质。3-BrPA敏感性与其转运体的表达密切相关,但之前确定的代谢靶点或转运体均不存在48,50表明3-BrPA进入细胞后可能具有非特异性毒性。与此一致,3-BrPA具有非糖酵解靶点,如V-ATP酶20、SERCA24,碳酸酐酶51和HDAC52和MCT1一样,其他转运体在癌症亚群中也上调53,54因此有可能开发出类似于3-BrPA的有毒分子,利用这些转运蛋白选择性地进入并靶向癌细胞。
方法
材料
材料来自以下来源:Millipore的MCT1抗体、Sigma的GAPDH抗体、Cell Signaling Technologies的RPS6、ACC、AMPK、phospho-ACC、phosphal-AMPK和Raptor抗体、Santa Cruz Biotechnology的HRP-偶联抗兔抗体、Roche的乳酸脱氢酶、,Acros Organics公司生产的乳酸和3-BrPA、RPMI-1640培养基、甘氨酸缓冲液、丙酮酸、l-乳酸、d-乳酸嘌呤霉素和Sigma公司生产的聚brene、Invivogen公司生产的速溶素、,14C-3BrPA来自Moravek Biosciences,Matrigel和Cell-Tak来自BD Biosciences,IMDM来自US Biologicals。细胞系取自ATCC。慢病毒shRNAs来自Broad Institute的RNAi Consortium(TRC)收集。所使用的shRNAs的TRC编号为TRCN0000072186(GFP)、TRCN0000038339(MCT1_1)、TRCN0000038340(MCT1_2)、TRCP0000982283(GAPDH_1)和TRCP000088283(GAPDH2)。将MCT1克隆到pMXs IRES blasticidin和PLJM1 puro中的引物序列如补充表1。
细胞培养与病毒转导
KBM7细胞在添加10%IFS和青霉素/链霉素的IMDM中培养。本研究中的所有其他细胞系均在添加了10%FBS的RPMI中培养。KBM7、MDA-MB-231和Sk-Br-3细胞系稳定过度表达人MCT1或GFP,是通过感染表达相应cDNA的慢病毒而产生的,并分别筛选出抗急变菌素(10μg/ml)或抗嘌呤霉素(4μg/ml。类似地,通过感染表达相应shRNAs的慢病毒,产生表达MCT1和GAPDH shRNA的BT-20、KBM7、MDA-MB-468和BT-549(补充表1)在含有4μg/ml聚brene的介质中,以2250 rpm的转速进行30分钟的自旋感染。接下来用嘌呤霉素筛选细胞。
单倍体细胞筛选
如前所述,使用1亿突变的KBM7细胞进行3-BrPA单倍体细胞遗传筛选30将突变的单倍体KBM-7细胞暴露于50μM 3-BrPA中3周。采集存活的克隆,分离基因组DNA并扩增插入物。逆转录病毒插入位点两侧的序列通过逆转录PCR和Illumina测序映射到人类基因组。使用给定插入的接近指数来识别具有高密度插入的基因组区域。此外,通过Fisher精确检验将失活插入数与未经处理的对照数据集中的插入数进行比较,计算选定人群中给定位点插入数的统计富集度。分离单个克隆,并使用基因组DNA分离试剂盒(Qiagen)分离单个克隆的基因组DNA。如前所述,通过反向PCR和后续测序鉴定基因组插入25。
代谢分析
使用海马生物科学XF24细胞外通量分析仪(海马生物科学)测定了KBM7和MDA-MB-231细胞对3-BrPA的生物能量谱。对于所示的实验,250000 KBM7或40000 MDA-MB-231细胞接种在使用无缓冲RPMI(10 mM葡萄糖)的海马组织培养板中。在实验开始前一小时,使用CellTak(Clontech)将KBM7细胞贴在平板上。对于AUC(曲线下面积)OCR和ECAR测量,对每个细胞系进行三次连续读数。对于使用3-BrPA的实验,在连续读取3次后,通过端口A注入50μM 3-BrPA,并测量ECAR和OCAR水平。如前所述测量乳酸产量55对于ATP检测,20000个细胞接种并用指定量的3-BrPA处理60分钟,使用基于荧光素酶的检测(Promega)测定与未处理细胞相比的相对ATP水平。对于代谢物测量,在提取代谢物之前,在50μM 3-BrPA存在下培养1000万野生型和MCT1缺失的KBM7细胞1小时。然后,用冷PBS快速清洗细胞三次,然后通过添加80%冰镇甲醇提取代谢物,然后在干冰上培养15分钟。如前所述,使用LC-MS获得内源代谢物谱56代谢物水平(n=3)归一化为细胞数。
3-BrPA摄取分析
野生型KBM7或MCT1-完整细胞接种在HBSS中,并暴露20分钟至100μM C14-标记的3-BrPA(6.8 mCi/mmole)(莫拉维克)含有或不含有竞争分子,如3-BrPA、丙酮酸、L-乳酸和D-乳酸。细胞用冷HBSS清洗,在NaOH缓冲液中溶解,并使用液体闪烁计数器测量摄取。
细胞存活分析
将细胞(5000–20000个细胞)接种在96个板中,并用指定量的3-BrPA处理。治疗3天后,使用CellTiter-Glo(Promega)和/或CyQuant(Invitrogen)测量与未处理细胞相比每个浓度的细胞周期阻滞或细胞死亡百分比。根据制造商手册(BD Pharmingen)使用Annexin V和7AAD染色进行FACS分析。
相关性分析
用3-BrPA(0-300μM)处理15个细胞株(BT-474、BT-549、CAKI-1、CAL-51、HCC-70、Hs 578T、Jurkat、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、PC-3、SK-BR-3、T47D、ZR-75-1)。3天后,通过CellTiter-Glo分析和IC对细胞活力进行量化50根据得到的剂量-反应曲线,使用非线性回归模型进行插值。在Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片上进行的基因表达谱分析实验中,所有15个细胞系的转录组标准化mRNA水平均来自CCLE。然后将所有15个样本中每个基因的mRNA表达模式与IC相关50值。使用每个细胞系的OCR/ECAR值进行类似的相关性分析。
免疫印迹和免疫组织化学
简单地说,细胞在冰镇PBS中冲洗两次,并在含有50mM Hepes、pH 7.4、40mM NaCl、2mM EDTA、1.5mM原钒酸盐、50mM NaF、10mM焦磷酸、10mM甘油磷酸、蛋白酶抑制剂(罗氏)和1%Triton-X-100的标准裂解缓冲液中收集。总裂解物中的蛋白质通过8–12%SDS-PAGE进行解析,并使用指示的抗体(1:1000)进行免疫印迹分析55为了定量,使用ImageJ软件,并使用等负荷控制(RPS6/Raptor)对信号进行标准化。采用煮沸Dako抗原回收法(Dako)对福尔马林固定石蜡包埋切片进行免疫组织化学。使用抗MCT1抗体的1:500稀释液进行染色。
小鼠研究
所有动物研究和程序均由麻省理工学院动物护理和使用委员会批准。使用6-10周龄裸鼠(Taconic)生成所有异种移植物。在皮下异种移植物中,在异氟烷麻醉下,在小鼠背部区域的两个部位注射100μl/注射20%基质凝胶的RPMI肿瘤细胞悬浮液。注射了250万个MDA-MB-231细胞。2周后,测量肿瘤,分离小鼠进行PBS和3-BrPA治疗(8 mg/kg)。3周后,收集肿瘤,用卡尺测量其尺寸,根据公式估算肿瘤体积:(0.5*W*L*L)。肿瘤被固定在福尔马林中以备后期处理。