Modifying metabolically sensitive histone marks by inhibiting glutamine metabolism affects gene expression and alters cancer cell phenotype

Natalie E. Simpson; Volodymyr P. Tryndyak; Marta Pogribna; Frederick A. Beland; Igor P. Pogribny

doi:10.4161/epi.22713

表观遗传学。2012年12月1日；7(12): 1413–1420.

数字对象标识：10.4161/epi.22713

PMCID公司：项目经理3528696

PMID：23117580

通过抑制谷氨酰胺代谢修改代谢敏感组蛋白标记影响基因表达并改变癌细胞表型

娜塔莉·辛普森,Volodymyr P.Tryndyak公司,玛塔·波格里布纳,弗雷德里克·贝兰德、和伊戈尔·波格里布尼^*

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关联数据

补充资料: 其他材料。
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摘要

代谢和表观遗传调控机制的相互作用已成为更好地了解癌症发展和进展的焦点。在这项研究中，我们获得了支持先前观察的数据，这些观察表明谷氨酰胺代谢影响人类乳腺癌细胞系中的组蛋白修饰。用谷氨酰胺酶抑制剂化合物968治疗非侵袭性上皮（T-47D和MDA-MB-361）和侵袭性间充质（MDA-MB-231和Hs-578T）乳腺癌细胞系，在所有细胞系中产生细胞毒性，其中在MDA-MB-231乳腺癌细胞中观察到最大的效果。化合物968治疗诱导20个关键癌症相关基因显著下调，其中大多数为抗凋亡和/或促进转移，包括AKT、BCL2,BCL2L1、CCND1、CDKN3、ERBB2、ETS1、E2F1、JUN、KITLG、MYB、，和MYC公司组蛋白H3K4me3是转录激活的标志，在所有这些关键癌症基因的启动子处都减少，只有一个除外。组蛋白H3K4me3在整体和基因特异性水平上的减少与设置D1和ASH2L公司，编码组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的基因。此外，其他表观遗传调控基因的表达在细胞凋亡过程中被下调（例如。，DNMT1（DNMT1）,DNMT3B公司,设置D1和SIRT1公司)也被化合物968下调。这些基因表达和组蛋白修饰的变化伴随着凋亡的激活，降低了MDA-MB-231细胞对化疗药物阿霉素的侵袭性和耐药性。这项研究的结果为抑制谷氨酰胺代谢引起的细胞毒性与乳腺癌细胞表观基因组改变之间的联系提供了证据，并表明细胞内代谢的改变可以提高表观遗传治疗的效率。

关键词：乳腺癌、谷氨酰胺代谢、组蛋白修饰、基因表达

介绍

近年来积累的证据表明，细胞的代谢状态和表观遗传调控之间存在密切联系。¹^-⁴这一点显而易见，来自细胞间中间代谢的各种小分子，包括S-腺苷蛋氨酸、丙酮酸、黄素腺苷二核苷酸、尼古丁腺苷二核酸、叶酸、乙酰辅酶a、α-酮戊二酸和铁，对细胞表观基因组的适当维护至关重要。²^,^三^,⁵代谢状态和表观遗传调控在正常细胞中非常平衡，但在包括乳腺癌细胞在内的癌细胞中却受到严重干扰。⁶^-⁸在之前的一项使用人类乳腺癌细胞系的研究中，我们证明代谢产物水平、代谢敏感的表观遗传组蛋白标记以及代谢和组蛋白修饰酶基因的表达与乳腺癌发生的不同阶段相关。⁹例如，高侵袭性和耐药的MDA-MB-231和Hs-578T间充质乳腺癌细胞的特征是谷氨酸-谷氨酸水平的改变，这表明谷氨酸代谢增加，谷氨酸酶的表达增加(GLS1）组蛋白脱乙酰酶9(HDAC9公司)与非侵袭性上皮性T-47D和MDA-MB-361乳腺癌细胞相比，组蛋白H4-赖氨酸20三甲基化和H4-赖氨酸16乙酰化（H4K16ac）水平较低。⁹

最近的研究结果表明，谷氨酸是肿瘤发生的关键因素，¹⁰^-¹²包括乳腺癌的发展和进展。¹¹^,¹³^,¹⁴具体而言，Wang等人。¹³证明谷氨酰胺酶催化水解L-谷氨酰胺为L-谷氨酸的异常增加有助于肿瘤的发生，Asiago等人。¹⁴据报道，谷氨酸水平升高与乳腺癌患者的疾病转归相关；然而，谷氨酰胺-谷氨酸代谢途径异常可能影响乳腺癌肿瘤发生的机制尚未阐明。

一种可能的机制与以下事实有关：参与细胞内葡萄糖和谷氨酰胺代谢途径的代谢物是几种组蛋白修饰酶的底物，包括组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去甲基酶（HDM）。具体来说，乙酰辅酶a是HAT正常功能所必需的，而2-酮戊二酸是HDM的协同因素；影响这些底物的水平会影响组蛋白修饰、基因表达和细胞表型。例如，通过沉默ATP-柠檬酸裂解酶的siRNA抑制乙酰辅酶A的产生，降低组蛋白乙酰化的整体水平和基因特异性水平，并影响基因表达和细胞表型。¹⁵此外，我们已经证明，使用化合物968（一种二苯并菲啶）可以通过高度特异性抑制谷氨酰胺酶来阻断谷氨酸生成，从而部分逆转人MDA-MB-231乳腺癌细胞中H4K16ac的低水平，¹⁶化合物968治疗显著降低组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）的全球水平。⁹因此，谷氨酸的产生可能会影响组蛋白修饰以重新编程细胞。

在本研究中，我们研究了使用化合物968对表观基因组进行代谢靶向是否会影响基因表达和细胞表型。我们发现，化合物968治疗显著降低了T-47D、MDA-MB-361、Hs-578T，尤其是MDA-MB-231人类乳腺癌细胞的细胞存活率。MDA-MB-231癌细胞凋亡的激活、生存率和侵袭性的降低以及药物敏感性的增加伴随着癌基因和抑癌基因启动子的基因表达下调和组蛋白H3K4me3的降低，特别是在凋亡、细胞周期、，细胞粘附和转移。

结果

复方968对人乳腺癌细胞的作用

Wang等人之前的一份报告。¹³^,¹⁶结果表明，化合物968通过GLS1抑制人乳腺癌细胞中的谷氨酰胺代谢而阻断MDA-MB-231细胞的增殖，并在体内外阻碍肿瘤的形成和发展。的确，图1结果表明，化合物968对MDA-MB-361、T-47D、Hs-578T和MDA-MB-231乳腺癌细胞系的重复剂量治疗对所有研究的癌细胞都具有细胞毒性（p<0.05），MDA-MB231癌细胞的细胞毒性作用最大（急性单剂量和重复剂量治疗均p<0.01）。相反，化合物968对正常乳腺上皮MCF-10A细胞的细胞毒性作用不太明显。

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图1。化合物968对多种人类乳腺癌细胞系具有细胞毒性。按照“材料和方法”中的描述，用10μM化合物968或二甲基亚砜对照（n=3）处理2和4天后，测定MCF-10A、MDA-MB-361、T-47D、Hs-578T和MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞存活率。存活率是通过剩余968个处理过的细胞数除以剩余存活的二甲基亚砜处理细胞数来确定的。分析分三次进行，误差条表示重复独立实验之间的标准偏差。星号表示与DMSO控制有显著差异；*p<0.05；**p<0.01。

化合物968改变MDA-MB-231癌细胞中癌相关基因的表达

图2A结果表明，用化合物968处理MDA-MB-231细胞后，20个基因表达下调（倍数变化≥2.0，p<0.05），而52个基因（62%）的表达要么没有差异，要么低于≥2.0倍的截止值(表S1). 在这些基因中，有几个基因，包括关键基因VHL（甚高频）,MGMT公司和FHIT公司抑癌基因分别上调1.6倍、1.8倍和1.9倍。此外，12个基因显示Ct值>33个周期，表明这些基因在MDA-MB-231细胞中不表达(表S1). 化合物968治疗下调的大多数（75%）基因参与了凋亡的调控，包括11个抗凋亡基因，例如，AKT,BCL2级,BCL2L1、CCND1、CDKN3、ERBB2、ETS1、JUN、KITLG、MYB和MYC公司，下调2.0至5.5倍；2个促凋亡基因，例如，RASSF1和RB1型下调了4.1倍和2.4倍；还有两个具有抗凋亡和促凋亡功能的基因，例如E2F1和TP73，分别下调了3.4倍和3.8倍(表1). 用化合物968处理MDA-MB-231细胞也导致参与细胞粘附、迁移和侵袭的11个基因表达减少(表1).

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图2。化合物968诱导的基因表达下调与相应基因启动子处组蛋白H3K4me3降低相关。(A类)图中显示了MDA-MB-231癌细胞对10μM化合物968（黑条）或DMSO对照（白条）处理2 d后的差异表达基因（折叠变化≥2.0，p<0.05；n=3）。数据表示为化合物968处理细胞中每个基因表达相对于未处理对照细胞中表达的平均折叠变化，其赋值为1。通过将B2-微球蛋白和RPL13A的表达归一化来确定折叠变化。误差条=标准偏差。组蛋白H4K14ac的相对变化(B类)和组蛋白H3K4me3(C类)差异表达基因的启动子。用抗乙酰-睾酮H4赖氨酸16（H4K16ac）、三甲基-孕酮H3赖氨酸4（H3K4me3）或兔IgG的一级抗体进行ChIP分析。用人类癌基因和肿瘤抑制基因EpiTect ChIP PCR阵列（Qiagen）对来自免疫沉淀物和输入DNA的纯化DNA进行qPCR分析。数据以化合物968处理的MDA-MB-231细胞相对于DMSO控制的MDA-MB-231细胞在归一化输入DNA和控制IgG后的折叠变化表示。误差条=SD。星号表示与未处理的对照细胞的差异（折叠变化≥1.5）。

表1。化合物968处理的MDA-MB-231乳腺癌细胞中差异表达的基因（倍数变化≥2.0，p<0.05；n=3）

基因符号	基因描述	折叠更改	转录因子	血管生成	细胞凋亡	细胞粘附、迁移和侵袭	细胞周期	DNA损伤和修复
AKT1型	v-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1	-2.5		X（X）	X（X）	X（X）	X（X）
BCL2级	B细胞CLL/淋巴瘤2	-5.5			X（X）
BCL2L1型	BCL2类1	-2.7			X（X）
巴西航空公司1	乳腺癌1，早期发病	-2.0	X（X）				X（X）	X（X）
巴西航空公司2	乳腺癌2，早期发病	-2.5	X（X）				X（X）	X（X）
CCND1号机组	细胞周期蛋白D1	-2.0			X（X）	X（X）	X（X）
CDH1型	E-钙粘蛋白	-2.6				X（X）
CDKN3型	细胞周期素依赖性激酶抑制剂3	-2.9			X（X）		X（X）
E2F1系列	E2F转录因子1	-3.4	X（X）		X（X）	X（X）	X（X）
ERBB2（HER2）	v-erb-b2红细胞白血病病毒癌基因同源物2	-2.1		X（X）	X（X）	X（X）	X（X）
ETS1型	v-ets成红细胞增多症病毒E26癌基因同源物1	-2.4	X（X）	X（X）	X（X）	X（X）
HIC1型	癌症中的高甲基化1	-2.3	X（X）			X（X）
6月	原癌基因c-Jun	-2.2	X（X）		X（X）	X（X）
套件	KIT配体	-2.5			X（X）	X（X）
马来西亚令吉	骨髓母细胞增生癌基因	-2.1	X（X）		X（X）
MYC公司	v-myc骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源物（禽）	-2.1	X（X）		X（X）
NF2型	神经纤维蛋白2（merlin）	-2.6				X（X）
RASSF1系统	Ras关联域家族成员1	-4.1			X（X）	X（X）	X（X）
RB1型	视网膜母细胞瘤1	-2.4	X（X）		X（X）
TP73型	肿瘤蛋白p73	-3.8	X（X）		X（X）			X（X）

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化合物968影响MDA-MB-231癌细胞中基因特异性组蛋白H4K16ac和H3K4me3模式

接下来，我们确定化合物968诱导的基因表达变化是否与相同抑癌基因和癌基因启动子处组蛋白修饰模式的基因特异性变化有关。图2B结果表明，在表现出显著基因表达变化的基因中，只有三个基因在其启动子处组蛋白H4K16ac增加，而在六个基因中组蛋白H6K16AC水平没有变化，在其他11个基因中，组蛋白H4 K16显著降低（倍变≥1.5）。相反，正如预期的那样，在20个基因中的19个中，我们观察到基因特异性组蛋白H3K4me3水平下降(图2C)与之前在全球范围内发现的情况类似。⁹

化合物968改变MDA-MB-231癌细胞DNA和组蛋白修饰基因的表达

为了进一步评估化合物968对DNA和组蛋白甲基化机制功能的影响，进行了qRT-PCR检测DNA甲基转移酶（DNMTs）的表达DNMT1型,DNMT3A型和DNMT3B公司，组蛋白甲基转移酶（HMT），包括组蛋白H3K4甲基转移酶设置1A和ASH2L公司,¹⁷^,¹⁸组蛋白H3K9甲基转移酶EHMT2型¹⁹组蛋白H4K16脱乙酰酶SIRT1公司.²⁰

图3显示用化合物968处理MDA-MB-231细胞导致DNMT1（DNMT1）,DNMT3B、SETD1A、ASH2L和SIRT公司（p<0.05）。相反DNMT3A型和EHMT2型不受化合物968处理的影响。

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图3。的表达式DNMT1（DNMT1）,DNMT3A型,DNMT3B公司,设置1A,ASH2L公司,EHMT2型和SIRT1公司DMSO对照组和化合物968处理的MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的组蛋白修饰基因。使用来自未经处理和化合物968处理细胞的总RNA来评估DNMT1（DNMT1）,DNMT3A型,DNMT3B公司,设置1A,ASH2L公司,EHMT2型和SIRT1公司基因。如“材料和方法”中所述，通过qRT-PCR测定基因表达。数据表示为化合物968处理细胞中每个基因表达相对于相应DMSO对照细胞的平均倍变化，其赋值为1。星号表示与DMSO对照细胞的显著差异（p<0.05）（n=3）

化合物968激活MDA-MB-231癌细胞的凋亡、降低侵袭性并增加药物敏感性

最后，我们研究了化合物968介导的MDA-MB-231癌细胞基因表达和组蛋白修饰的改变是否会影响其关键表型特征，如逃避凋亡、侵袭性和化疗药物耐药性。图4A显示在化合物968处理的MDA-MB-231细胞中效应胱天蛋白酶3/7的活性是未处理细胞中的1.7倍。此外，启动子caspase 8的表达也显著上调(图S1).

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图4。化合物968激活MDA-MB-231癌细胞的凋亡，降低侵袭性，并增加药物敏感性。(A类)二甲基亚砜（白条）或化合物968（黑条）处理的MDA-MB-231细胞中caspase 3/7的活性。数据以DMSO处理细胞的百分比变化表示。(B类)DMSO（白条）或化合物968（黑条）处理的MDA-MB-231细胞的细胞侵袭活性。数据显示为用化合物968处理的MDA-MB-231细胞从DMSO处理细胞迁移到膜下表面的百分比变化。(C类)用二甲基亚砜（白条）或化合物968（黑条）处理的MDA-MB-231细胞对阿霉素治疗的敏感性。数据以平均值±标准差（n=3）表示。星号表示与DMSO处理的细胞有显著差异。

化合物968对MDA-MB-231乳腺癌细胞的治疗显著降低了细胞的侵袭性(图4B). 此外，化合物969处理的MDA-MB-231细胞对阿霉素（DOX）（一种常用于治疗乳腺癌的药物）的敏感性增加。事实证明，化合物968显著降低了IC₅₀对于5.5μM至1.8μM的DOX，在MDA-MB-231细胞中为67%(图4C).

讨论

新的证据表明，通过小分子，例如化合物968和双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）或siRNA，靶向阻断癌细胞中的谷氨酰胺酶和谷氨酰胺代谢²¹可能会改善癌症（包括乳腺癌）的疾病转归。¹¹^,¹³^,²²在本研究中，我们证明用化合物968治疗人类乳腺癌MDA-MB-231细胞会降低癌细胞存活率，同时伴随着与乳腺癌进展密切相关的关键癌症相关基因的下调，特别是在凋亡、细胞周期、，细胞粘附和转移。大多数下调的基因参与了细胞凋亡的调控(表1). 重要的是，11个下调的凋亡途径基因是抗凋亡癌基因，数量远远大于两个下调的促凋亡肿瘤抑制基因。这可能会将MDA-MB-231细胞中凋亡和抗凋亡过程之间的平衡转向激活凋亡，从而增加化合物968的细胞毒性作用。这一建议得到了大量数据的支持，这些数据表明，一些抗凋亡癌基因被化合物968治疗下调，包括AKT1型,BCL2级,CCND1号机组,ERBB2号机组,ETS1型,6月和MYC、，诱导不同癌症类型的癌细胞（包括乳腺癌细胞）凋亡。²³^-³⁰此外，有令人信服的证据表明RB1型该基因是化合物968治疗下调的抑癌基因之一，可能触发非计划性凋亡。³¹^,³²

用化合物968处理MDA-MB-231细胞也导致参与细胞迁移、侵袭和转移的11个基因表达降低(表1). 此前，我们证明，通过激活凋亡程序，逆转MDA-MB-231癌细胞的高度转移间充质表型可以提高其对化疗药物的敏感性。³³同样，一些研究表明，通过抑制侵袭和转移基因的表达，可以发挥抗癌作用，包括AKT1型,CCND1号机组,E2F1系列,错误2和6月.²⁷^,³⁴^,³⁵这表明化合物968的细胞毒性也可能归因于促进侵袭和转移的基因的下调。重要的是，经化合物968处理的MDA-MB-231细胞中观察到的基因表达变化伴随着凋亡的激活，并降低了癌细胞对化疗药物阿霉素的侵袭性和耐药性。

考虑到我们之前的发现，即用化合物968治疗MDA-MB-231乳腺癌细胞会导致代谢敏感组蛋白H4K16ac和H3K4me3标记的显著改变⁹组蛋白修饰是基因表达变化的重要决定因素，³⁶^-³⁸我们研究了经化合物968处理的MDA-MB-231细胞中癌相关基因的下调是否与基因特异性组蛋白修饰改变有关。我们的研究结果表明，大多数下调基因的特征是基因特异性组蛋白H3K4me3减少，这是与转录激活相关的主要表观遗传修饰。³⁹^,⁴⁰因此，化合物968治疗导致基因表达降低的机制之一似乎是相应基因启动子处组蛋白H3K4me3的丢失。此外，我们发现组蛋白H3K4me3在全球和基因特异性水平的丢失与抑制设置D1和ASH2L公司基因。众所周知，ASH2在大多数人类肿瘤中过度表达，并抑制ASH2公司siRNA的表达显著降低了癌细胞的增殖。⁴¹此外，我们发现DNMT1（DNMT1）,DNMT3B、SETD1A、ASH2L和SIRT公司在化合物968处理的MDA-MB-231细胞中，染色质修饰基因的表达，包括DNMT1、DNMT3B,⁴² 设置d1⁴³和SIRT1公司,⁴⁴在凋亡过程中减少。

总之，本研究的结果提供了证据，证明化合物968的细胞毒性与关键癌基因的表达显著降低有关，尤其是抗凋亡和转移相关癌基因。我们的研究还表明，这种下调与影响代谢敏感性组蛋白修饰标记基因特异性水平的表观遗传机制有关，尤其是组蛋白H3K4甲基化的缺失。重要的是，本研究的结果为癌细胞代谢和表观遗传调控机制之间的相互依赖性提供了实验证据，并表明细胞内代谢的改变可以提高表观遗传治疗的效率。

材料和方法

细胞系和化合物968的治疗

MCF-10A、MDA-MB-361、T-47D、Hs-578T和MDA-MB-231乳腺细胞系取自美国型培养物收集（ATCC），并根据ATCC的建议进行维护。GLS1抑制剂化合物968{5-[3-溴-4-（二甲氨基）苯基]-2,2-二甲基-2,3,5,6-四氢苯并[a]菲咯啉-4（1H）-one}购自SPECS。在使用化合物968的实验中，将含有10μM化合物968并补充有1%胎牛血清的培养基在接种后5 h添加到细胞中。在治疗2和4天后，通过使用台盼蓝排除法计数活细胞来确定细胞存活率。重复实验，在每个时间间隔对每个细胞系进行三次测试。

RNA分离和定量逆转录PCR（qRT-PCR）阵列分析

用化合物968处理2和4天后，用0.05%胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen Corporation）处理细胞，在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，然后立即分离RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen）从MDA-MB-231乳腺癌细胞中提取总RNA。cDNA由1μg RNA合成，使用RT²第一股套件（Qiagen）。使用人类致癌基因和肿瘤抑制基因RT，通过qRT-PCR测定未经处理和化合物968处理的MDA-MB-231细胞的基因表达谱²Profiler™PCR阵列（Qiagen）符合制造商的协议。

qRT-PCR分析

使用随机引物和高容量cDNA档案试剂盒（Applied Biosystems）逆转录总RNA（2μg）。以下基因表达分析（Applied Biosystems）用于qRT-PCR：DNMT1（DNMT1）（Hs00154749_m1）；DNMT3A型（Hs01027166_m1），DNMT3B公司（Hs00171876_m1），设置1A（Hs00322315_m1），ASH2L公司（Hs00983120_m1），EHMT2型（Hs00198710_m1）和SIRT1公司（Hs01009005_m1）。使用7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）以96周的分析格式进行反应。每个平板包含一个实验基因和一个看家基因GAPDH公司（Hs02758991_g1），所有样品一式两份。使用2^-ΔΔCt方法。⁴⁵

染色体免疫沉淀分析法

使用Magna染色质免疫沉淀测定试剂盒（Millipore），用组蛋白H4K16ac（Millipore）和H3K4me3（Millipore）的一级抗体进行甲醛交联和染色质免疫沉淀（ChIP）测定。根据制造商的协议，用人类癌基因和肿瘤抑制基因EpiTect ChIP PCR阵列（Qiagen）对来自免疫沉淀和输入DNA的纯化DNA进行定量PCR（qPCR）分析。

细胞凋亡测定

化合物969处理MDA-MB-231细胞24小时后，用caspase-Glo活化caspase 3/7测定细胞凋亡^®3/7检测试剂盒（Promega）符合制造商协议。通过Bradford分析（Pierce）测定蛋白质浓度，并将所有样品的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性归一化为相等的蛋白质量。实验重复两次，每个细胞系测试三次。

细胞侵袭试验

根据制造商的说明，使用BD BioCoat™Matrigel™侵袭室（BD Biosciences）评估经化合物968处理的MDA-MB-231细胞的细胞侵袭活性。电池（5×10⁴细胞/ml）被加载到含有8-μm孔径膜和薄基质凝胶基质层的腔插入物中。细胞在48小时内迁移到膜下表面，用100%甲醇固定。然后用苏木精对带有迁移细胞的膜进行染色、扫描，并用Aperio Scanscope System（Aperio Technologies）获得数字图像。

药物敏感性试验

为了检测药物敏感性，MDA-MB-231细胞被二甲基亚砜和0.1、1.0或10.0μM DOX或化合物968和0.1、1.0或10.0µM DOX处理。培养48小时后，IC₅₀测定了产生50%细胞死亡的抑制浓度。实验重复两次，每个细胞系测试三次。

统计分析

结果以平均值±标准偏差表示。统计分析采用单向方差分析，成对比较采用Student-Newman-Keuls检验。

补充材料

其他材料

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词汇表

缩写：

GLS1级	谷氨酰胺酶
HDAC9公司	组蛋白脱乙酰酶9
帽子	组蛋白酰基转移酶
挪威船级社	DNA甲基转移酶
HMT公司	组蛋白甲基转移酶
HDM公司	组蛋白去甲基化酶
H4K16ac型	H4赖氨酸16乙酰化
H3K4me3型	H3赖氨酸4三甲基化
定量RT-PCR	定量逆转录PCR
炸薯条	染色质免疫沉淀
美国公共广播电视公司	磷酸盐缓冲盐水

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

补充材料

补充材料可在此处找到：www.landesbioscience.com/journals/epigenetics/article/22713

脚注

以前在线发布：www.landesbioscience.com/journals/表观遗传学/文章/22713

工具书类

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文章来自表观遗传学由以下人员提供泰勒和弗朗西斯