引言
甲型流感病毒的M2蛋白首次被发现是抗流感药物金刚烷胺的蛋白靶点。1这种模块化蛋白具有多种功能，定位于短97位序列的不同域。其高度保守的N末端23残基位于病毒的外部，有助于M2并入病毒。2该区域之后是跨膜（TM）螺旋()作为四聚体和质子导电结构域。质子导入病毒离子会在内吞作用后使病毒酸化，并引发病毒脱膜。6,7残基46-60形成下一个模块，这有助于诱导膜弯曲和膜断裂，从而从宿主细胞释放新组装的病毒。8最后，蛋白的C末端尾部与基质蛋白M1相互作用，对病毒包装和出芽至关重要。9在某些甲型流感病毒株中，M2对于平衡高尔基体内腔与细胞质的pH值，防止病毒血凝素的过早构象变化也很重要。10M2蛋白因其医学重要性而被广泛研究，尤其是在M2阻断药物金刚烷胺和金刚乙胺出现广泛耐药性之后。11M2的小尺寸和模块化结构也使其对生物物理研究具有吸引力。
（A） M2四聚体TM结构域的功能模型，显示关键侧链和药物金刚烷胺的位置。该模型是通过半胱氨酸扫描诱变获得的。三,4（B） 从SSNMR（PDB:2KQT）获得的DMPC双层中金刚烷胺结合M2TM的高分辨率结构。5功能模型中四聚体束的整体形状与高分辨率结构非常吻合；然而，存在特定差异，例如螺旋倾角和几个侧链的构象（例如Ser31和Trp41）。在这两幅图像中，为了清晰起见，“前”螺旋线已被删除。
这篇综述将主要关注M2（M2TM）的TM结构域的结构和功能，其中包含质子传导残基组氨酸37（His37），12和通道标记残基色氨酸41（Trp41）。13TM结构域再现了全长蛋白质的大多数电生理学、药理学和生物物理特征，例如低氢活化质子电导率、质子电流的金刚烷胺敏感性和蛋白质的四聚体化。14–16自发现到2008年，质子传导机制通过电生理学、定点突变和分子动力学（MD）模拟进行了广泛研究。三然而，虽然这些研究确定了关键侧链的总体拓扑结构和大致位置，但没有可用的高分辨率结构。2008年，随着溶液核磁共振和晶体结构的发表，这种情况发生了巨大变化。17,18随后是磷脂-双层结合M2的固态核磁共振（SSNMR）结构。5,19在这篇综述中，我们首先总结了我们基于生化和电生理研究对M2质子传导和抑制机制的理解。然后我们讨论了高分辨率结构是如何改变我们对质子通道的理解的。有时，如果高分辨率结构的结论得不到功能数据的支持，可能会产生误导性的结果。因此，为了区分基于生化数据的机械结论和来自高分辨率结构的机械见解，我们在不同的章节中对这些主题进行了回顾。由于结构是由几种实验方法产生的，我们还对不同方法的优点以及潜在的不确定性进行了简要的技术描述。
最后，我们指出了尚存的分歧和有待进一步研究的问题。M2领域的进展被质子传导和药物抑制位点的竞争模型所打断。由于这些相互竞争的模型被很好地定义和表达，它们激发了新的、更具鉴别力的实验和解释。第一场辩论涉及质子传导机制。早期模型设想了一个由pH值（快门机构）控制的连续水通道，20与目前公认的模型相比，在该模型中，质子沿着水线扩散，直到到达His37，然后由His37通过交替的质子化和去质子化事件“穿梭”。第二场争论集中在药物是否通过与水孔内或蛋白质表面的位点结合来抑制通道。这场争论引发了广泛的功能实验21–25和SSNMR调查。5,26,27SSNMR最终显示，生理上重要的部位位于孔隙中，突出了这种原子分辨光谱在近天然脂质双层膜蛋白结构测定中的实用性。
文献中剩下的主要争论集中在His37四分体质子化时电荷稳定的机制上。一个早期的模型关注于His37残基之间的低势垒氢键（LBHB），其动机是观察到高pK（K）一对于前两个质子化步骤。28然而，最近的一项研究表明，His37集群的基础性不如最初预期。29His37构象和动力学的魔角自旋（MAS）SSNMR测量，30结合晶体结构信息，31表明His37残基在平衡时通过主导结构中的水分子间接相互作用。我们提出了一个传导和抑制模型，该模型结合了我们对药理学的理解以及目前为该质子通道积累的结构和功能研究的完整集成。
M2的导电性能
质子电导通过M2的速率和pH依赖性似乎在进化上得到了调整，以提供足够的电导来调节包裹在内体中的病毒粒子的酸化，而不是过度或非选择性电导，这可能会在细胞产生病毒子代之前对细胞造成毒性。M2传导质子～105–106比钠等其他离子更有效。32–35然而，选择性不是绝对的，K+离子的浓度比质子高得多，随着病毒内部酸化，离子慢慢被带出病毒。36这个小K+电导可以防止形成较大的电梯度，否则在酸化完成之前会抵消质子通量。经典地，通道的电导由其半径、长度、离子选择性以及最重要的是双层两侧离子的浓度来描述。通常，离子电导的速率与其在双层膜给定侧的浓度成线性比例，并且只有在不对称离子浓度或存在TM电势的情况下才能观察到净通量。M2的质子电导与K相比相对较小+或Na+通道，主要是因为质子的浓度很低（10−5M（M）在pH 5下）相对于碱金属离子（0.15M（M）)在一个牢房里。接近中性时，M2传导质子的速率接近由α-螺旋四聚体形成的通道的预期速率；37～10的二阶速率常数7–108M（M）−1秒−1可以计算离子进入和穿过通道的净扩散。然而，当pH值降低到pH值6以下时，电导并没有线性增加，反而趋于稳定，这让人联想到转运蛋白中的米氏-芒顿行为。在磷脂囊泡中重组M2的研究中也观察到这种饱和行为。36,38
因此，M2被认为是通过一种机制来工作的，其中His37是TM域中唯一的可电离残基，用于将质子穿梭到通道中。三,34当一个或多个His37残基完全质子化时，建议在低pH值下发生饱和。传导曲线显示在pH 6附近的中点，33,39被认为是pK（K）一指挥His37。在低pH值下观察到的水平表明，速率限制步骤从扩散到通道（在高pH值下）转换到低pH值时的另一个步骤。考虑到蛋白质中组氨酸的已知解离率，这一步骤被指定为从His37中进行质子解离。带p的组氨酸K（K）一近6的质子解离率为～104秒−1在室温下。40在像M2这样直径狭窄的河道中，流速预计会慢一到两个数量级，102–10三秒−1.37该值与实验测得的M2最大电导（约为10–1000 s）吻合良好−1.
在报道该残基的前两个质子化步骤发生在pK（K）一接近8.2。28该值具有相当大的不确定性，因为它是在残留肽运动保持的温度下，在二粒糖基磷脂酰胆碱（DMPC）/二粒糖基磷脂酰甘油（DMPG）双层中测量的，以拓宽15N光谱。最近，pK（K）一His37四分体的’s是使用在脂质成分更类似于病毒的膜中重组的样品来更准确地测定的，前两个质子化步骤用pK（K）一第7.6和6.8节。29两项研究都发现，第三个质子的结合发生在pH/电流曲线的中点附近，这表明当His37四分体在+2和+3状态之间循环时发生传导。然而，在一些变体中，中性pH附近存在二次电导，需要考虑+1至+2循环的低电导。最近的数据表明，在pH<5时，+3至+4周期也可能导致产生质子通量（马春龙，劳伦斯·平托，个人通讯）。
M2的自然和人工序列变体
虽然甲型流感病毒是一种进化速度相对较快的病毒，其基因组不断变异和洗牌，但与基因组编码的其他蛋白质相比，M2蛋白在很大程度上是保守的。有大量关于1918年病毒M2序列变异的记录，其中TM区域的变异特别小。从实际角度来看，重要的是要理解为什么该蛋白如此保守，以及它如何耐受少数观察到的孔衬残基突变，因为这些信息可以指导新药的设计，并预测新耐药性的潜在来源。从更基本的角度来看，M2的天然和人工突变体都提供了有关参与质子传导和抑制的残基的宝贵信息。幸运的是，M2的四聚体结构很简单，甚至在获得高分辨率结构之前就可以预测这些突变的可能位置。
M2的TM区结构的第一个模型来自Cys-扫描突变和无限制MD模拟。4,20,41这些模型指导了十多年的电生理实验的设计和解释，直到晶体结构和核磁共振结构可用为止。这些早期模型三捕捉到了在随后的高分辨率结构中看到的孔隙的整体形状[（A） ]。从病毒的外部开始，序列的N末端半部分形成了一个充满水的毛孔，由Val27、Ala30、Ser31和Gly34排列。这些位点在金刚烷胺抗性突变体中经常发生突变。孔被His37和Trp41中断，它们投射到通道的中心。Asp44定义孔的C端。下面，我们将首先讨论N端孔的突变，这对质子向His37扩散很重要，其次是关键残基His37、Trp41和Asp44，它们对电荷存储和质子转移很重要。
N端水孔
早期对金刚烷胺耐药机制的研究主要集中在选择可在细胞培养中在孔道阻断药物金刚烷碱存在下复制的病毒。引起抗性的突变发生在排列在N末端水孔的Val27、Ala30、Ser31和Gly34处。1,42在用金刚烷胺治疗后的感染患者中发现这些突变的一个子集，43携带各种孔壁突变的反向工程病毒能够复制在体外在老鼠模型中。44然而，这些突变中的许多会产生一些减弱的病毒，这些病毒的传播性比野生型（WT）低，并且在没有药物压力的情况下往往会恢复。42,45事实上，1918年至2010年传播性病毒的大规模测序表明，只有在TM螺旋第26、27和31位的第一圈内才允许孔衬残基突变[（A） ]。S31N一直是M2中主要的金刚烷胺耐药突变，46–49占过去十年从人类、鸟类和猪中分离出的耐金刚烷胺的H1N1、H5N1和H3N2可传播毒株的98-100%。11,50–60V27A和L26F的出现频率较低，通常在非流行性金刚烷胺耐药H1N1中发现。48,61,62
对M2孔衬残基的点突变进行了广泛的研究，以探索电导机制并确定可能导致金刚烷胺耐药性的其他位点。21,63尽管电导的大小和pH依赖性不同，但N端水孔中数量惊人的突变体仍然能够选择性地传导质子而不是其他离子。只要突变没有破坏通道的四聚体结构，就可以观察到功能性通道64或者引入一个大的疏水残基，它可能会阻断通向His37的水通道。虽然这些“功能性”突变产生了质子选择性通道，但它们在质子传导的幅度和pH-电流曲线的形状上与WT不同。只有少数突变-V27A、S31N和L26F具有与WT非常相似的特性。这些突变也是相同的突变，在报告的可传播病毒耐药性中占99.9%以上。M2序列保守性的严格反映了孔壁残基的严格功能限制，其中单体的单一突变在四聚体孔的非常狭窄的区域内导致四种变化。
质子选择性和门控残基：His37、Trp41和Asp44
不变残基His37的突变增加了通道的电导并消除了其严格的质子选择性。12,32,65有趣的是，H37G的质子选择性可以通过添加外源性咪唑来恢复，该咪唑可能与His通常占据的位点结合。65
Trp41的突变将该残基确定为“质子门”13大多数流感病毒株都有M2蛋白，当pH值为外面的小于pH值在里面，有一个强大的向内质子通量，远大于当情况逆转时观察到的向外质子流。当Trp41被除Tyr外的其他侧链取代时，这种不对称性就消失了，Tyr还具有能够稳定阳离子-π相互作用的富电子芳香环。66,67这些数据表明，Trp41的侧链是一个可以阻止质子从病毒内部扩散而不是从病毒外部扩散的门。只要这个门关闭，质子就不能从病毒内部快速进入His37，这解释了为什么在低pH值下向外的通量很慢在里面和高pH值外面的然而，来自外部的质子可以进入His37四分体，使其达到阈值质子化状态，即现在已知的+3状态。这导致Trp41门的打开和向内的质子通量。
Asp44是通道传导路径中的最终残留物，在pH值为5-7的范围内影响质子传导。罗斯托克病毒有更具传导性的变种D44N。68,69这种病毒含有一种特别的酸性血凝素，M2通过防止晚期高尔基体酸化来保护这种血凝素。残基44上的其他取代也会导致更大的质子通量，这表明Asp44有助于稳定封闭形式的Trp41，并且这种相互作用的破坏会导致质子通量的增强。
M2的高分辨率结构
高分辨率结构将对M2蛋白的机械理解提升到了原子水平。所有三种主要的高分辨率技术，X射线晶体学、溶液核磁共振和SSNMR都已用于确定M2的结构。由于这些技术对样品的要求不同，结构在不同的膜模拟溶剂中得到了解决，使得M2成为了解膜蛋白对环境的构象依赖性的罕见案例。70,71到目前为止，M2的高分辨率结构包括洗涤剂辛基葡糖苷中TM结构域的三种晶体结构，从pH 5.3到pH 7.5；18,31甲型流感M2（18-60）的溶液NMR结构17和AM2-BM2嵌合体72在pH 7.5的二己酰磷酸胆碱（DHPC）胶束中；pH为7.5时，M2（22–62）在二烯醇磷脂酰胆碱（DOPC）/二烯醇磷酰乙醇胺（DOPE）双层膜中的SSNMR取向结构19和酸性条件下DMPC双层中的M2（22-46）73中性pH值；74DMPC双层中M2（22–46）的MAS SSNMR结构5和二脲基磷脂酰胆碱（DLPC）双层26在中性pH下，除M2（22–62）定向结构外，其他SSNMR结构在抗病毒药物金刚烷胺存在下溶解。
重要的是要检查各种M2结构的实验约束类型和数量以及基本假设。对于晶体结构，晶体衍射至3.5–1.65º，其最高分辨率允许检测孔隙中的结合水分子31而最低分辨率不能确定金刚烷胺极性胺的方向。18对于M2（18–60）的溶液核磁共振结构，最重要的限制是27个单体和药物蛋白NOE、23个侧链二面角和27个残留的N-H偶极偶联。17SSNMR实验和结构约束分为两类。定向膜SSNMR实验涉及在数据采集期间保持静止的玻璃板对准或双腔对准膜。75,76
15N个-1H偶极耦合反映了N–H键的方向，反过来也反映了双层法线的螺旋方向，它是从二维相关谱测量的。在固态下15N个-1与溶液中弱排列分子的范围小得多的范围相比，H偶极耦合展现了全部可能值；77因此，SSNMR提取的N-H偶极偶联物对蛋白质取向更敏感。与定向膜SSNMR相比，MAS NMR实验使用了无定向水合蛋白质脂质体，该蛋白质脂质体围绕与磁场倾斜54.7°的轴快速旋转。MAS SSNMR提供了广泛的结构信息，包括原子间距、扭转角、旋转体结构、寡聚物数、分子运动和化学结构。75,78–82金刚烷胺结合M2（22–46）的MAS SSNMR结构的输入5[（B） ]包括药物蛋白距离、侧链旋转体、，83,84化学位移，85单体间距离，84以及N–H键方向。74一般来说，SSNMR结构比溶液NMR和晶体结构具有更少的约束，但这些稀疏约束是在更自然的脂质双层环境中测量的，通常具有较高的精度和准确性。
尽管在各种高分辨率研究中，各种环境因素如pH、模拟膜溶剂和药物有所不同，但TM结构域的总体形状基本上得到了保留(). 所有结构均显示四个螺旋组装成一个左手平行束，大多数情况下螺旋的N端半部分倾斜角度为30°–35°。唯一的例外是DHPC-分子结合溶液核磁共振结构，其倾斜角小得多，为～15°。17在低氢晶体结构和高氢SSNMR结构之间，螺旋的C端半部分的倾斜角相差约10°。所有结构都商定了面向孔的侧链与面向脂的侧链的相对位置；然而，His37和Trp41的旋转体状态存在关键差异。17,30,31,84值得注意的是，侧链构象不能从定向膜SSNMR实验中获得，因为它们只测量主链N–H键的方向。M2（22–62）最新定向膜SSNMR结构中的His37和Trp41转子异构体基于计算建模。19
M2的TM域结构。（A） N端孔由Ser31的羟基和主链羰基组成（图中结构为pH 6.5，PDB:3LBW时的1.65μl晶体结构）。通道的分子表面用红色的氧原子、灰色的碳原子和蓝色的氮原子进行了彩色编码。为了清晰起见，“前”螺旋已被移除。（B） pH7.5（2L0J，黄色）下的叠加固态核磁共振结构，pH6.5（3LBW，蓝色）下的1.65-Ω晶体结构，以及pH5.3（3C9J，红色）下的3.5-Ω晶体结构。图中显示了His37和Trp41侧链（杆）和Gly34 Cα（球）。
与TM结构域相比，溶液核磁共振结构之间的细胞质螺旋结构变化更大17定向膜SSNMR结构。19在DHPC胶束中，四个细胞质螺旋形成一个螺旋束，通过动态环与TM结构域和假定的胶束表面很好地分离。17相反，在DOPC/DOPE双层中，这种细胞质螺旋通过刚性Leu46–Phe47转紧密连接到TM结构域19位于膜-水界面。界面位置与早期的H/D交换数据一致，该数据显示该域中疏水残基的交换非常缓慢。86
高分辨率结构的质子转移机制
高分辨率结构的可用性提供了对质子传导的结构和动力学基础的原子级理解。有了这些结构数据，我们现在可以解决质子如何通过水孔传输到His37四分体，His37簇中电荷如何稳定，以及质子如何释放到病毒内部。
N端水孔
TM结构域的结构表明，孔中充满了氢键受体，但缺乏氢键供体。孔隙由小的侧链（Val27、Ala30、Ser31和Gly34）排列，允许主链原子大量暴露在孔隙中。螺旋中的羰基能够接受两个氢键，一个来自主链酰胺NH，另一个来自溶剂水或位于一个转角处的Ser/Thr，而酰胺NH基团只能提供一个氢键。因此，N端水孔的壁被定位为接受而非捐赠氢键。在四聚体的中性状态下，His37四聚体具有向孔投射的Nδδ的孤对，准备接受氢键[（B） 和（A） ]。相比之下，当形成等量的氢键供体和受体时，水处于最低能量状态。因此，当His37为中性时，通道中的水会出现氢键供体不足，这为结合氢键供质提供了强大的驱动力，例如药物中的铵基团或质子传导期间的离子型氢物种。这为p升高提供了理论依据K（K）一His37四分体的前两个质子化事件，将氢键供体引入系统。
His37四分体中电荷的动态、水介导的稳定
pH 6.5时的1.65Ω晶体结构31提供了中等pH值下蛋白质的高分辨率快照，该蛋白质似乎处于+2状态(). 该结构显示，导电所必需的残基散布在有序的水分子层中。通道的N端部分显示出扩散密度区域，暗示着无序的水分子[网状（A） ]。在该区域下方，在面向孔的Gly34、His37、Trp41和Asp44之间发现了三层水簇，形成了质子传导的连续路径。His37的四条侧链被包装成一个箱形结构。咪唑分子不是通过直接氢键连接的，而是通过上面和下面高度结构化的水分子连接的，这支持了质子穿梭的His37水模型。在His37和Trp41之间可以看到两个桥接的水分子。由于通道在pH 6.5时大致处于+2状态，因此假设这些桥接水分子会使多余的质子离域，从而降低脂质膜疏水部分质子储存的能量屏障。晶体结构是在冷冻水的低温下获得的。互补SSNMR30,87和二维红外实验88在环境温度下进行，以及MD模拟，89,90据报道，His37附近的水分子实际上是动态的。基于2D，发现His37和Trp41之间的水分子也是动态的15N个-1H相关SSNMR谱。30这些动态水分子可能会溶解铜2+最近决定在这个His-Trp芳香笼中结合。91二维MAS SSNMR谱表明，水与M2的相互作用依赖于pH值：水-蛋白质交叉峰在低pH值下比在高pH值下建立得更快，并且不同的建立速率表明，四聚体的水暴露表面积在低pH（开放状态）下比高pH值（闭合状态）下大约33%。87因此，通道孔在低pH下变宽，这与在低pH时观察到的螺旋倾角增加一致。18,31,73,74综上所述，这些结果表明His37四分体在多电荷态下高度溶解。
（A） 质子传导途径见于1.65奥分辨率的晶体结构中，包括三簇结晶水。（B–D）垂直于膜平面的外部（B）、桥接（C）和出口（D）簇的第二个透视图。（E） 孔隙表面（浅蓝色阴影）与结晶水（红色球体）一起显示。Val27、His37和Trp41残留物分别呈现为蓝色、橙色和品红色。绘制了高分辨率晶体结构（3LBW，蓝色实线）、低H（3C9J，蓝色虚线）和金刚烷抑制结构（红色虚线）的孔径分布图。
SSNMR实验得出了三个结论性的证据，证明His37能迅速地与周围的水分子交换质子。第一，15N光谱表明，咪唑氮在未调质态和质子化态之间的交换表现为15N强度介于N和NH峰值的极限频率之间。29的线宽15N个交换峰表示交换率为4.5×105秒−1这种N<–>NH交换率大约比质子传导率大两个数量级，这表明大多数交换事件不会导致质子传导到病毒中，而是通过干预水在多个His37残基之间发生(见下文). 与质子传导率相比，His-water质子交换率更大，支持质子在His37四分体和周围水上的离域。这个15N交换峰在pH5和6之间最高，这是内体的pH范围，其中+2和+3状态占主导地位。29其次，作为15N交换峰本身并不表明His37的交换伙伴是水，咪唑H的化学位移N个最近对质子进行了测量，发现质子在高温下处于水的频率。92这一观察表明，His37的质子交换伙伴是水，而不是另一种组氨酸。第三，发现咪唑环的N–H键长度在低pH下从共价键长度拉长（1.11º），30而在高pH值下，中性His37的Nε2-H键保持短且强共价（1.03 Au）。因此，低pH咪唑鎓与水分子形成氢键。
微秒级的His37-水质子交换伴随着咪唑环在酸性pH下的重新定向。30在固定TM螺旋骨架的含胆固醇的复合脂质膜中，咪唑啉侧链显示出运动平均的偶极耦合。取决于运动重取向角的降阶参数表明，咪唑啉围绕Cβ-Cγ键重取向约45°。该运动将未质子化的氮指向酸性N末端侧，将质子化的氮指向高pH C末端侧，以促进质子与水的转移。30环重新定向至少发生10次5次/秒，能量屏障测量值至少为60 kJ mol−1基于偶极耦合的温度依赖性。该最小势垒与50–120 kJ mol的能量势垒一致−1,93,94用于咪唑模型化合物的180°环翻转。此外，最小能量屏障与～100 kJ mol的质子传导屏障一致−1根据温度相关的单通道质子电导率估算，95表明His37侧链的构象变化是传导过程中最高的能量屏障。
His37残基之间的低势垒氢键？
虽然上述实验数据表明His37与水形成氢键，但第二个模型表明，His37通过中性咪唑的Nδ1和阳离子咪唑在通道+2状态下的Nε2-H之间的LBHB直接相互氢键。19,28该模型的主要原理是早期观察到高pK（K）一（8.2）对于His37四分体的前两个质子化步骤，表明His残基的碱度很高，并提示需要解释在传导发生之前过量质子是如何稳定的。然而，测量到的现象学pK（K）一这些值不仅反映了侧链的本征碱度，而且还包括一个统计因子，这是由于在四聚体中排列质子时能量简并排列的数量。特别是，第一质子化可以发生在四个组氨酸中的任何一个；因此，每个His37实际上都比四分体p的可原生质体少K（K）一建议。第一个p的统计因子K（K）一是log（4）=0.6，因此单个His37的碱度降至7.6，在平均值p的一个标准偏差内K（K）一（6.6±1.0），对于部分或完全埋藏在蛋白质中的组氨酸。96对于第一个四分体pK（K）一在病毒膜中测得的7.6中，修正值为7.0，更接近组氨酸p的平均值K（K）一在蛋白质中。我们认为，酰胺羰基极化的水分子的稳定相互作用，His37和Trp41之间的阳离子-π相互作用，以及Asp44的静电相互作用，解释了第一个pK（K）一第37页。
虽然这些精力充沛的统计考虑在很大程度上消除了提出His–His LBHB的必要性，但实验数据也表明没有LBHB。原件15N MAS核磁共振谱缺少LBHB所需的特定峰。28在没有实验侧链约束的情况下，计算了含有LBHB的M2（22–62）的定向核磁共振结构，19假设的LBHB被用作起始距离约束，以在MD模拟期间强制执行预期的几何结构。测得的His37转子酶在两个χ中均为反式1和χ2,30这使得Nδ1-Nε2矢量平行于通道轴，因此不可能建立Nε2-H…Nδ1氢键。最后，在提议含有LBHB的+2状态下，没有咪唑-咪唑啉13C类-13二维光谱中观察到C个交叉峰，29表明His37环不是紧密堆积的。因此，迄今为止的所有实验证据表明，LBHB稳定的二聚体模型虽然有趣，但并不代表M2在+2电荷态下的主导平衡结构。
质子释放到病毒内部
质子传导的最后一步是将质子从His37团簇释放到病毒内部。这一步骤是通过构象形式的短暂形成发生的，该构象形式“打开”Trp门，然后在质子扩散到病毒内部时关闭。溶液和SSNMR谱表明M2变得越来越动态17,30,97,98毛孔越来越水化87,88随着pH值的降低，支持一种构象交换模型，即螺旋随着质子化程度的增加而分开。由于质子通量沿电化学梯度下降是一个蛋白质在不同质子化状态之间循环的动态过程，因此质子传导可以预期蛋白质构象的变化。对M2的多重高分辨率结构的研究表明，可能的主链运动有助于质子从通道中移出。中的对齐结构（B） 显示了通道的C末端随着pH值的降低而膨胀的趋势。例如，0到+2之间质子化状态下的溶液NMR、SSNMR和X射线结构显示出一个封闭的C末端，而在更酸性的pH值下的晶体结构显示出更开放的C末端。在最扩张的结构中，TM螺旋线是直的，导致螺旋线在N端附近偏离最接近的公共点，导致C端附近扩张。这种C末端扩张与低pH下蛋白质的水合作用和动力学增强相一致。在扩张较小的结构中，Gly34附近出现轻微弯曲，这使得C末端的螺旋紧密相连。有人认为M2束的低pH结构中的膨胀是由束间堆积引起的晶体伪影，但最近脂立方相的晶体结构证实了无束间接触的晶体中的这种结构（未发表的结果）。
观察到TM域的不对称束18在完全扩张的束和更受限的束之间具有杂交特性。因此，只有一个螺旋可能会暂时改变构象以释放质子。双向SSNMR谱98和MAS，97显示关键残基（如His37、Gly34和Val27）存在多重构象。这些构象的确切性质以及它们之间的相互转化速率尚不清楚，需要进一步研究。到目前为止，低氢光谱的较大谱线展宽表明微秒时间尺度上的小振幅构象动力学，而不同状态之间的大振幅运动（应表现出较大的化学位移差异）尚未被检测到。
除了在不同pH值下的主链结构差异外，还观察到不同结构的Trp41侧链构象存在显著差异。在pH值为7.5的溶液NMR中，17吲哚的六元苯环指向孔的中心，并紧密堆积在一起，封闭通道的C末端[（A） ]。该旋转异构体（t-105，带χ1反式构象和χ2约−120°）是从残余的Nε1-Hε1偶极耦合和NOEs中获得的。17相比之下，pH 6.5晶体结构显示出更开放的Trp栅极31由于t90转子流量计（χ2=+80°，即从t-105旋转异构体翻转约180°）。这将极性五元吡咯环投射到通道中[（B） ]。这台t90转子照相机也是从19F类-19使用SSNMR测量Hζ3-氟化Trp41之间的F距离。84然而，这些19F SSNMR实验是在高pH下进行的，因此与溶液NMR结果相矛盾。这种差异可能是由于溶液和SSNMR样品中使用的不同溶剂（洗涤剂与脂质双层）或M2结构体的不同长度造成的，因此需要进行额外的实验来澄清Trp41的旋光体状态。即使使用相同的t90旋转异构体，由于主链膨胀，在pH 5.3下溶解的晶体结构显示吲哚环之间的分离比在pH 6.5下大[（B） ]。这些变化支持了最初的模型，即当His37达到临界质子化状态时，Trp41充当一个门，从而使质子进入病毒。
Trp41旋转体和Trp41-Asp44在（A）高pH、药物结合溶液核磁共振结构（2RLF）和（B）pH 6.5 X射线晶体结构（3LBW）中接触。由于180°χ，在B中发现Trp41处的孔径较大2角度变化。Trp41侧链显示为Trp41的球形（绿色表示C，蓝色表示N），Asp44的球形和棒状（粉色C，蓝色O）。图中，His37呈球形，C为橙色，N为蓝色。His37的侧链几乎被（A）中的Trp41完全封闭；在（B）中，它的可访问性稍高。结晶定义的水分子显示在B中的红色小球中，氢键显示在虚线中。
Asp44似乎在稳定Trp41吲哚的不同构象中起着关键作用。在高氢溶液核磁共振结构中，Asp44被定位为与结构系综约一半成员中的吲哚质子直接相互作用。17在pH 6.5的晶体结构中，Asp44侧链通过一小簇水分子与Trp41间接相互作用。31因此，Asp44可以通过将Trp41门稳定在完全关闭和/或部分关闭状态来促进门控，直到His37四分体上积累了临界数量的质子。此外，Asp44的负电荷可能会稳定His37四分体上积累的正电荷。这些结论与电生理学数据一致，表明Asp44突变导致质子选择性和金刚烷胺敏感性通道，在生理pH范围内电导增强，21,68,69表明His37、Trp41和Asp44都相互作用，调节电导和通道门控的pH依赖性。
高分辨率结构中的药物结合位点及其抑制机制
如上所述，诱变和全细胞电生理学长期以来表明N末端孔是药物结合区域，如抗金刚烷胺突变，如V27A、A30T、S31N和G34E21,99都位于这个地区。因此，当M2（18-60）的溶液核磁共振结构显示，在TM结构域的C末端附近，金刚乙胺NOE与Leu40和Arg45之间的脂代谢残基有关，而与N端孔残基无关时，这是一个重大的惊喜。17相反，在pH值为5.3时，M2TM的晶体结构发现，该药物在孔道中的电子密度具有合适的形状和大小，周围环绕着Val27、Ala30、Ser31和Gly34。18随后的结构和功能实验表明，孔隙部位是生理相关部位，而表面部位是非特异性的，亲和力低，在解决这一争议的过程中，我们学到了很多。
由于溶液核磁共振和晶体结构都是使用在洗涤剂胶束中重建的样品获得的，这是一种不完美的模拟脂质双层的方法，因此通过SSNMR展示药物如何在真正的双层环境中与M2结合非常重要。测量13C类-2H之间的距离13C-标记的M2TM和脂质双层中的全氘化金刚烷胺揭示了药物浓度如何影响结合位点。5在每四聚体一种药物的化学计量比下，只有N末端残基（Val27、Ser31和Gly34）通过氘自旋表现出REDOR偶极脱相。只有当过量添加金刚烷胺时，表面部位的Asp44才显示出偶极脱相。因此，第一当量的药物与N-末端孔结合，而过量的药物与亲和力较低的表面部位结合。作为2氢四极分裂对分子运动和取向很敏感2全氘化金刚烷胺的H-光谱揭示了药物在两个结合位点的取向。Ser31-近端药物大多直立，三重分子轴平行于通道轴[（B） ]，而与Asp44结合的药物与正常细胞膜倾斜37°或80°。在没有蛋白质的情况下，脂质结合药物也采用相同的倾斜取向；因此，表面结合位点是由于脂质膜上多余药物的非特异性结合。定量分析13C类-2H REDOR数据导致全氘化金刚烷笼与Val27侧链、Ser31和Gly34之间存在六个距离约束。这些蛋白质-药物距离为仅利用基于双层的SSNMR数据的高分辨率结构提供了关键的限制[（B） ]。5
虽然这些数据清楚地表明药物以高亲和力结合到脂质双层中的N末端孔，但仍有可能由于TM结构缺乏细胞质两亲性螺旋而导致结果出现偏差。这引发了一系列使用截短和位点特异性突变的生物实验，最终表明细胞质螺旋对通道功能并不重要，但对稳定病毒萌发期间的膜曲率非常重要。8,16,24结果表明，在用于结构测定的条件下，细胞质螺旋实际上破坏了药物结合所需的TM构象。支持这一结论，周和同事解决了一种嵌合蛋白的结构，该嵌合蛋白由M2的N末端区域和B型流感病毒同源物的C末端螺旋区域组成，其中金刚乙胺仅在孔隙中结合。72只要膜不含胆固醇和鞘磷脂，磷脂双层中较长的M2结构中也发现了相同的孔结合位点。100这些结果揭示了细胞质螺旋和膜模拟溶剂之间的复杂相互作用。31核磁共振波谱和脂蛋白相关性MAS实验表明，两亲螺旋、胆固醇和鞘磷脂共同促进直径小于～30 nm的各向同性膜结构域。101这种高曲率可能会扰乱TM螺旋组件，进而干扰药物与毛孔的结合。膜曲率高与药物与孔隙结合较少之间存在相关性。因此，两亲性螺旋对TM螺旋束的药物活性构象起变构作用。
在充满水的通道孔中放置疏水残基的突变会物理上阻塞通道，并大幅降低其电导。以类似的方式，金刚烷胺的金刚烷部分以优异的几何互补性进入通道，无疑有助于质子的阻塞。药物结合导致通道的结构和动态变化级联。水-蛋白质交叉峰强度显著降低，表明通道脱水。87未经调整的15His37的N峰持续降低pH值，表明His37 p降低K（K）一.28这个15药物结合后，低pH下的氮交换峰消失。低H蛋白的主干化学位移采用高H值。最后，咪唑偶极耦合恢复到刚性极限值，表明His37侧链被固定。28因此，药物结合会使通道脱水，从而阻止His37的质子化和化学交换，进而阻止骨架扩张，从而阻止侧链重新定向。所有这些效应都消除了质子进入病毒的过程。
高亲和力广谱药物的设计
迫切需要新的药物来抑制耐药突变体，特别是S31N。通过上述结构研究以及大量探测结合位置和驱动力的计算研究，新药的设计得到了极大的进步。21,25,31,90,102–110金刚烷胺和金刚乙胺具有两亲性结构，具有极性胺头和非极性金刚烷基或金刚乙基。结构-活性关系表明，多种非极性取代基可以取代金刚烷基取代基，阳离子初级铵基团最适合于高亲和力结合，因为叔胺、醇和其他中性基团的亲和力往往较低（在某些情况下，可以容忍二级胺）。111伯胺的有效性表明，带电荷的胺（铵）基团可能会模拟氢离子，当质子通过外孔渗透到His37时形成。事实上，对通道中金刚烷胺的MD模拟表明，其铵基团平均由四个水分子在方形平面阵列中水合，并且该水合物通过Ala30与四个羰基的氢键合进一步稳定。25,90,107
因此，我们现在可以根据螺旋表面羰基的性质来理解金刚烷胺对通道的亲和力。螺旋中大约一半的溶剂可及羰基与水有额外的氢键。它们可以与水形成氢键，以稳定水合铵或氢离子。然而，它们很容易脱水，以疏水稳定金刚烷基取代基的结合。Val27的非极性异丙基覆盖了该位点，导致与WT中的金刚烷胺和金刚烷胺具有几何和理化互补性。
对其他配合物的MD模拟表明，在由Val27的羰基和Ser31的羟基形成的位置，存在能够稳定铵或氢的额外位置，其中一个位于Ala30的螺旋中，或者，一组四个水分子被Gly34的羰基和His37的咪唑强烈氢键结合。通过将铵基团定位于袋中较深的较低推测氢结合位点()，可以设计对WT M2具有更大亲和力的螺环化合物。107
金刚烷胺与WT的模拟快照（最左边）。水分子（红色）以正方形平面阵列与羰基（绿色/红色棒）结合。这种水分子阵列可以稳定金刚烷胺（绿色和蓝色结合药物）的结合铵基团或位于中心的水分子（品红）。其余的面板以示意图的形式显示了通道的垂直切片，显示了一种比金刚烷胺更长的抑制剂如何将其铵基团放在通道中更深的位置，并置换更多的水分子。
对于耐药突变体，MD模拟表明，V27A和L26F在通道顶部附近具有更宽的开口，导致金刚烷胺金刚烷基团的拟合较差，疏水埋藏减少。107然而，河道中部和下部的水结构似乎被保留了下来。这导致了螺二环胺和螺金刚烷胺的设计107不仅针对WT，还针对带有IC的V27A和L26F突变体50与金刚烷胺对WT通道的抑制作用相似或更好。在MD模拟中，这些药物在V27A中向上移动，以使其烷基填充通道入口附近的较大空腔；它们的铵基团占据了V27A的上部位置，但在WT中占据了较低的水位置。SSNMR数据证实，这些药物直接与靶点结合。107结合和斑块减少试验进一步证明了这些抑制剂的效力。这些结果证明了MD模拟在探索药物结合机制和指导设计以前似乎无法理解的靶点抑制剂方面的威力。
除金刚烷类药物外，还对M2的其他抑制剂进行了功能性研究，其中一些抑制剂进行了结构表征。在二价金属离子中，Cu2+显示出显著的抑制作用，平衡解离常数为～2μM4（参见金刚烷胺的IC50约16μM22). 铜2+抑制作用表现出与金刚烷胺类似的功能特征：它对pH值和施加电压敏感，与疏水性药物BL-1743竞争，112并抑制内向和外向电流。4铜的SSNMR研究2+-利用顺磁弛豫增强效应结合M2TM表明，Cu2+结合位点是His37和Trp41之间的His37 Nε2，这解释了Cu相对缓慢的解离2+离子。91因此，与金刚烷胺相比，铜2+直接靶向质子传导的His37的心脏，而不是N末端面向孔的残基，这为针对S31N突变体的抑制剂设计提供了新的途径。
