恶性转化是由改变细胞生理学以产生增殖优势的突变引起的(1,2). 尽管癌症具有遗传异质性和复杂性(三)，转化细胞表现出许多拟议的共同特征，包括代谢重编程，表现为营养吸收和利用的改变(2,4). 虽然代谢重编程被认为对癌细胞的快速增殖至关重要，但对转化细胞中活跃的代谢途径缺乏系统描述，而且这些途径在促进癌细胞快速增殖方面的作用尚不清楚(4). 现有的癌症代谢研究只检测了相对较少的细胞系，并且主要集中在细胞内代谢物库的测量上(5)从中很难推断代谢途径的活性，或使用同位素示踪通过有限数量的反应估计代谢流量(6).
为了系统地描述癌细胞代谢，我们使用液相色谱-串联质谱来分析细胞有限公司消费和重新219种代谢物租赁（CORE）(表S1)在NCI-60小组中，跨越中间代谢的主要途径，收集了60个特征良好的原代人癌细胞系，这些细胞系是从9种常见肿瘤类型中建立的(7). 核心分析基于代谢足迹或外代谢组学(8,9)，并通过将培养细胞培养基中的代谢物浓度与基线培养基中代谢物的浓度相关联，对细胞代谢活性进行系统和定量评估，从而得出指数增长期内每种代谢物在每个细胞基础上的时间平均消耗和释放（CORE）曲线(). 通过CORE分析，我们鉴定了140种存在于新鲜培养基中或由至少一种癌细胞系释放的代谢物，其中111种代谢物在60种细胞系中表现出明显的差异，在生物复制品之间具有良好的再现性(). 111种代谢物中约三分之一被所有细胞株消耗，而其余三分之二的代谢物大部分持续释放到培养基中；只有少数代谢物在某些细胞系中被消耗，并被其他细胞释放(). 更大的完整注释版本提供于图S1.
代谢物消耗和释放（CORE）分析A： 用于测定代谢物CORE(有限公司消费和重新使用LC-MS/MS对细胞培养前（新鲜）和培养后（花费）4-5天的培养基样品进行代谢产物分析X（X），CORE值计算为归一化到该区域的摩尔丰度差A类生长曲线下。B： 葡萄糖消耗与乳酸释放；谷氨酰胺消耗与谷氨酸释放；以及60个细胞系中测得的总碳消耗量与总碳释放量。灰色线表示每对代谢物消耗的碳与释放的碳的摩尔比为1:1；连接的数据点代表生物复制。
NCI60细胞系的核心分析在重复培养的60个癌细胞系中111种代谢物的CORE谱的层次聚类。蓝色表示消耗，白色表示无变化，红色表示释放。灰色突出显示表示功能相关的代谢物。无法区分的代谢物表示为x/y。甘油_1和甘油_2代表独立的LC-MS/MS测量。
癌症代谢核心图谱(,S1（第一阶段）)可用于探索癌细胞的代谢表型和发现代谢物之间的关系。例如，白血病细胞释放鸟氨酸，黑色素瘤细胞释放腺苷和肌苷(图S2)反映了这些癌症特有的代谢活动。代谢物CORE数据的无监督聚类分析确定白血病细胞是一个独特的组，但没有根据来源组织更广泛地区分肿瘤细胞系(图S3). 功能相关代谢物在60个细胞系中表现出类似的消耗和释放模式。例如，包括葡萄糖、必需氨基酸和胆碱在内的主要营养物质形成一个单一的簇，代表糖酵解、柠檬酸循环、核苷酸和多胺的代谢物也形成了一个簇(,图S1). 主要营养素的消耗也与副产物的释放相关：例如，葡萄糖的消耗与乳酸的释放相关()与转化细胞中的Warburg效应相一致(4). 在其他营养素中也观察到类似的营养素消耗和副产品释放模式。谷氨酰胺的消耗量是氨基酸中最大的，与谷氨酸的释放密切相关(). 对所有监测代谢物的分析表明，测得的总碳消耗量也与测得的碳释放总量密切相关()这表明转化细胞具有共同的代谢表型，即主要营养素的不完全分解代谢伴随着副产物的释放。
接下来，我们试图确定任何代谢物CORE谱是否与癌细胞增殖相关。此前报道的60个癌细胞系的倍增时间从17.0到79.5小时不等，并且具有高度的重复性(10)(图S4). 从111种代谢物CORE图谱中，两种代谢品，磷酸胆碱和甘氨酸与60个细胞系的增殖率显著相关（Bonferroni校正的P<0.01）(). 所有细胞释放的磷胆碱与必需营养素胆碱的消耗相关(图S5)，并据报道在转化细胞中积累，作为磷脂生物合成的底物(11). 相比之下，甘氨酸消耗量与增殖率之间的关系出乎意料，因为甘氨酸是一种可以内源性合成的非必需氨基酸。甘氨酸表现出一种不寻常的CORE特征，被快速增殖的细胞消耗，被缓慢增殖的细胞释放()这表明，在快速增殖的癌细胞中，甘氨酸需求可能超过内源性合成能力，而在缓慢增殖的细胞中，甘氨酸合成可能超过需求。在所有60个细胞系中观察到乙二醛消耗量增加，增殖速度加快()在包括卵巢、结肠和黑色素瘤细胞在内的特定肿瘤类型中更为明显(,图S6)，但在非粘附性白血病细胞中不明显(图S6). 为了确定甘氨酸消耗是转化细胞特有的还是快速增殖的一般特征，我们测量了培养的原代人乳腺上皮细胞（HMEC）、人支气管上皮细胞（HBE）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人活化CD4+T淋巴细胞中的甘氨酸消耗。这些未转化细胞在8至18小时内加倍，与分裂最快的癌细胞相当，但每种细胞类型都释放而不是消耗甘氨酸（HMEC:3.5±0.8；HBE 17.5±3.2；HUVEC 8.4±1.4；淋巴细胞1.9±0.3 fmol/cell/h）。因此，甘氨酸消耗似乎是快速增殖转化细胞特有的特征。
甘氨酸的摄入和合成与癌细胞的快速增殖相关A： 斯皮尔曼分布与60个癌细胞系111种代谢物CORE谱和增殖率之间的相关性。用红色突出显示的代谢物在P<0.05时显著，Bonferroni校正。B： 甘氨酸CORE与60种癌细胞株（左）和选定实体瘤类型（右）的增殖率。为后续实验选择的细胞系以红色突出显示。连接的数据点代表复制培养物。P值是对111种测试代谢物进行Bonferroni校正的值。C： 1425种代谢酶基因表达与60个癌细胞株增殖率之间的Spearman相关性分布。突出显示的是线粒体（红色）和细胞溶质（蓝色）甘氨酸代谢酶。D： 细胞溶质和线粒体甘氨酸代谢示意图。E： 100%细胞外生长的LOX IMVI细胞中未标记（0）和标记（+1）胞内甘氨酸和丝氨酸的丰度13C-甘氨酸。F.表达靶向SHMT2（sh1-4）或对照shRNA（shCtrl）的shRNA的LOX IMVI和A498细胞的生长，归一化为shCtrl细胞；甘氨酸。G.培养3天后，10个表达靶向SHMT2（sh4）的shRNA的癌细胞株在没有甘氨酸（−gly，填充条）或存在甘氨酸（+gly，开放条）的情况下生长。细胞数表示为相对于+gly细胞的比率。E、F、G中的误差条表示标准偏差。
为了补充代谢产物CORE分析，我们接下来检测了1425种代谢酶的基因表达(12)在之前生成的60个细胞系的微阵列数据集中(13). 这项独立分析表明，甘氨酸生物合成酶在快速增殖的癌细胞系中表达更高(). 细胞内甘氨酸的合成是在胞浆和线粒体之间进行的(14)，提供两条单独的酶促途径(). 线粒体甘氨酸合成途径包括甘氨酸合成酶丝氨酸羟甲基转移酶2，SHMT2号机组癌基因c-Myc的靶点(15)，以及MTHFD2型和MTHFD1L公司，再生辅助因子四氢叶酸（THF）用于SHMT2反应(). 只有线粒体途径与增殖有显著相关性，而相应的胞浆酶没有()这表明线粒体在支持癌细胞快速增殖中起着关键作用。评估甘氨酸消耗的相对贡献与。内源性合成细胞内甘氨酸池，我们利用示踪分析13快速分裂LOX IMVI细胞中的C-标记甘氨酸。假设一个简单的稳态模型(13)，我们通过标记细胞内甘氨酸和丝氨酸池来估计()大约三分之一的细胞内甘氨酸来源于细胞外消耗，而剩余的甘氨酸是内源性合成的。因此，代谢物CORE分析和基因表达分析都独立地确定甘氨酸代谢与癌细胞快速增殖密切相关。
为了直接评估甘氨酸代谢对癌细胞快速增殖的贡献，我们采用了基因沉默和营养剥夺相结合的方法。我们稳定沉默了甘氨酸合成酶的表达SHMT2号机组在缓慢增殖的A498细胞和快速增殖的LOX IMVI细胞中()有四个不同的shRNA发夹(图S7A). SHMT2中突变的CHO菌株先前被证明对甘氨酸营养不良(16). 在没有细胞外甘氨酸的情况下沉默SHMT2可阻止LOX IMVI细胞的增殖()，并通过向培养基中添加甘氨酸而获救，这表明甘氨酸本身，而不是源于SHMT2反应的单碳单元()对这些细胞的增殖至关重要(). 培养基中添加肌苷，一种甘氨酸相关代谢物(17)或甲酸盐，细胞单碳单位的来源(18)，未能抢救LOX IMVI细胞(图S7B). 相反，缓慢增殖的A498细胞()没有受到以下因素的影响SHMT2号机组耗尽和细胞外甘氨酸剥夺，表明甘氨酸合成的其他方式可以满足这些细胞的要求。仅提取细胞外甘氨酸也会降低LOX IMVI细胞的增殖，但不会降低A498细胞的增殖(图S8)，尽管这种效果更微妙。总之，我们的数据表明，甘氨酸的线粒体生成在快速增殖的癌细胞中特别重要。为了确定这种对甘氨酸快速增殖的依赖是否延伸到其他癌细胞，我们测试了SHMT2号机组(图S7C)以及NCI-60小组中额外10个原代癌细胞株的细胞外甘氨酸剥夺(). 快速增殖的癌细胞在对抗甘氨酸代谢的情况下表现出较慢的增殖速度，并且可以通过添加细胞外甘氨酸来挽救，而缓慢增殖的细胞对这些扰动不太敏感()即使在以后的时间点进行评估，以允许与快速增殖的细胞相比较数量的细胞分裂(图S9).
接下来，我们试图探索甘氨酸代谢促进癌细胞快速增殖的潜在机制。代谢追踪13C-标记甘氨酸显示，在快速增殖的LOX IMVI细胞中，消耗的甘氨酸与嘌呤核苷酸结合，但在缓慢增殖的A498细胞中结合有限()表明摄入的甘氨酸部分支持从头开始这些细胞中的嘌呤合成。我们还注意到标记甘氨酸并入细胞谷胱甘肽(图S10A). 对60个癌细胞先前进行的大规模化疗敏感性分析(7)揭示了对谷胱甘肽合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺的敏感性(19)，与增殖率无关(图S10B)，而对抑制剂的敏感性从头开始嘌呤生物合成、霉酚酸酯、噻唑呋喃和丙氨酸(20)，与细胞系的增殖率高度相关(图S10C). 甘氨酸可用于从头开始嘌呤的生物合成有两种机制，直接并入嘌呤骨架或由甘氨酸裂解系统（GCS）进一步氧化，以生成用于核苷酸合成和细胞甲基化反应的单碳单元(). 由于GCS仅将甘氨酸的碳2转换为一碳单位()，我们在1-13C-甘氨酸或2-13C-甘氨酸区分这两种机制(21). 消耗2-13C-甘氨酸不会产生双标嘌呤()表明将消耗的甘氨酸并入嘌呤核苷酸不涉及GCS的氧化。为了更好地描述甘氨酸剥夺对细胞周期进展的影响，我们对表达双生蛋白-GFP报告子并用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色的HeLa癌细胞进行了细胞周期分析。SHMT2静音(图S11A)剥夺细胞外甘氨酸会减缓HeLa细胞的增殖(图S11B)类似于其他快速增殖的癌细胞()导致G延长1细胞周期的阶段(,S11C型)蛋白质合成相对完整(图S11D)与核苷酸生物合成缺陷一致(20). 总之，这些结果表明，消耗的甘氨酸部分用于从头开始嘌呤核苷酸生物合成在这些细胞中快速增殖，甘氨酸代谢的拮抗导致G延长1从而减缓扩散。
甘氨酸代谢支持从头开始嘌呤核苷酸生物合成A： 从1到嘌呤环的碳结合示意图-13C-甘氨酸或2-13C-甘氨酸；四氢叶酸；甘氨酸切割系统。B： 100%生长的LOX IMVI或A498细胞中的嘌呤核苷酸+1和+2同位素-13C-甘氨酸或2-13C-甘氨酸，作为总细胞内代谢物池的一部分。C.在缺乏甘氨酸（−gly，填充条）或存在甘氨酸（+gly，开放条）的情况下生长，表达靶向SHMT2（shSHMT2）或控制shRNA（shCtrl）的shRNA的HeLa细胞的细胞周期分析。通过双生蛋白表达和DAPI染色，根据每个细胞周期阶段的细胞百分比计算细胞周期相长度(图S11C).
为了探讨甘氨酸代谢与癌症的潜在相关性，我们检测了线粒体甘氨酸合成酶的表达，SHMT2号机组,MTHFD2型和MTHFD1L公司()，在之前生成的微阵列数据集中，共有1300多名早期乳腺癌患者在6个独立的大队列中存活(22–27). 我们定义了两组个体：线粒体甘氨酸生物合成途径中位数以上基因表达的个体和中位数以下基因表达的群体。线粒体甘氨酸生物合成途径中位数以上的表达与较高的死亡率相关()对所有六个数据集进行的正式荟萃分析表明，总体危险比为1.82（95%可信区间：1.43–2.31；)，与其他已确定的因素（如淋巴结状况和肿瘤分级）相当，这些因素会导致癌症预后不佳(25). 线粒体甘氨酸合成酶SHMT2号机组单独用药也与死亡率显著相关，而其胞浆副作用上海地铁1号线不是(图S12). 这些数据强调了线粒体甘氨酸代谢在人类乳腺癌中的潜在重要性。
线粒体甘氨酸生物合成途径的表达与乳腺癌患者的死亡率相关左，Kaplan-Meier对六个独立乳腺癌患者队列的生存分析(22–27). 患者被分为线粒体甘氨酸代谢酶中位数表达的上（红线）和下（蓝线）(SHMT2号机组,MTHFD2型、和MTHFD1L公司,). 破折号，审查事件。对，这六项研究的Cox危险比荟萃分析。实线表示95%置信区间；方框表示每个研究对结果的相对影响（平方反比标准误差）。钻石标志着总体95%的置信区间。
总之，我们使用CORE分析生成了一个大规模、定量的癌细胞代谢图谱。这种方法和数据集可能在研究细胞代谢以及确定癌症代谢生物标记物和药物反应性方面具有广泛的用途。在当前的研究中，我们利用该图谱探讨了代谢和增殖之间的关系，发现快速增殖癌细胞对甘氨酸代谢的依赖性意外增加，这是在快速增殖的非转化细胞中未观察到的表型。虽然我们发现甘氨酸被用于从头开始快速增殖的LOX IMVI细胞中嘌呤核苷酸的生物合成，替代机制包括利用甘氨酸衍生的单碳基团进行细胞甲基化反应(17)可能对其他类型的癌细胞很重要。重要的是，最近的工作已确定甘氨酸和相关代谢物，包括肌氨酸、丝氨酸和苏氨酸，或其相关代谢途径，对癌症转移至关重要(5)，细胞转化(17,28,29)，和小鼠胚胎干细胞增殖(30). 因此，甘氨酸代谢可能代表快速增殖的癌细胞的代谢脆弱性，原则上可以作为治疗益处的靶点。
补充材料
图S1。CORE数据的扩展热图如所示.
图S2。60个细胞系与原始组织的鸟氨酸、腺苷和肌苷核心图谱。红色高光组织在所示的假发现率（FDR）下是显著的，该假发现率是使用该组织与所有其他组织的Mann-Whitney U检验计算的，然后对所进行的测试总数进行Benjamini Hochberg校正。
图S3。111种代谢物CORE谱的多维标度分析。
图S4。答：由核细胞计数确定的6个选定细胞系的生长曲线。蓝线表示指数增长期。B类：与NCI报告的相应加倍时间相比，通过对数细胞计数线性回归，根据（A）中的数据估计加倍时间(http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html).抄送：60个细胞系的加倍时间（NCI）与来源组织。
图S5。顶部：60个细胞系磷胆碱释放与体外增殖率的比较。底部：磷酸胆碱的释放与胆碱的消耗。P值表示斯皮尔曼秩相关检验。对于磷胆碱与增殖率，P值为Bonferroni修正值。
图S6。60个细胞系的甘氨酸消耗/释放（CORE）与体外增殖率的关系，分别为每个来源组织绘制。给出了每个组织的皮尔逊相关系数R。*非零皮尔逊相关P<0.05。
图S7。答：A498和LOX IMVI细胞中四个shRNA发夹（sh1-4）沉默后SHMT2转录水平的RT-PCR分析，表达为对照发夹的折叠变化（shCtrl）。发夹如中所列.B类：shSHMT2细胞在缺乏细胞外甘氨酸的情况下生长，用载体对照、甘氨酸（140μM）、肌氨酸（140μM）或甲酸盐（140μL）挽救，表示为细胞数在0小时内的倍数变化。A、B中的误差线表示标准偏差。抄送：sh4发夹沉默10个癌细胞株后SHMT2转录水平的RT-PCR分析，如.
图S8。A498和LOX IMVI细胞系在含有140μM甘氨酸（填充圈）或缺乏甘氨酸（开放圈）的培养基中的生长曲线。误差条表示95%置信区间。
图S9。靶向SHMT2（发夹sh4，如)并在不含甘氨酸（−gly填充条）或存在140μM甘氨酸（+gly，开放条）的情况下生长6天。细胞计数标准化为每个细胞系的+gly培养平均值。误差线表示标准偏差。
图S10。答：。分数13C-label掺入A498和LOX IMVI细胞中的氧化/还原谷胱甘肽-13C-甘氨酸（140μM）或2-13C-甘氨酸（140μM）。误差条表示4个独立区域性之间的标准偏差。B。在60个细胞系中，对谷胱甘肽合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺的敏感性与细胞增殖率的关系。C、。对抑制剂的敏感性德诺沃嘌呤生物合成与细胞增殖率，跨越60个细胞系。
图S11。答：sh4发夹沉默后SHMT2转录物水平的RT-PCR分析（如)在HeLa细胞中。B类：在没有或存在细胞外甘氨酸（gly，140 mM）的情况下培养的shSHMT2 HeLa细胞中的细胞计数，表示为与对照细胞的比率（shCtrl）。抄送：在没有甘氨酸（-gly）或存在甘氨酸（+gly）的情况下生长的shSHMT2或shCtrl-HeLa细胞中，使用双生蛋白表达和DAPI染色进行细胞周期分析。显示每个象限中的单元格百分比。医生：根据（C）中给出的门定义，用琥珀酰亚胺酯化Alexa-647染料测量G1期HeLa细胞每个细胞的蛋白质含量分布。
图S12：。乳腺癌患者生存率与SHMT2或SHMT1表达的Kaplan-Meier分析。红曲线，对患者组中层以上基因的表达进行分析；蓝色曲线，中下表达组。人力资源、考克斯比例风险评估。*P<0.01，log-rank检验。患者研究如.
表S1。监测的代谢物
