谷氨酸转运蛋白的死后蛋白质水解速率不同细胞间和转运子亚型间的显著差异

动物、免疫和组织采集

所有动物实验均按照美国国家科学院《实验动物护理和使用健康指南》（NIH出版物编号80-23），1996年修订，以及1986年11月24日的欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）。进行所述实验的正式批准来自我们机构的动物学科审查委员会。C57Black/6背景中的小鼠GLT-1缺陷（EAAT2；slc1a2）(Tanaka等人，1997年)或GLAST（EAAT1；slc1a3）(Watase等人，1998年)，以下简称GLT1-KO和GLAST-KO分别存放在政府的动物设施中公共卫生研究所（挪威奥斯陆）。这些小鼠被培育成杂合子，以便在同一窝中可以发现基因敲除小鼠和野生型小鼠。其他动物保存在基础医学研究所的动物设施中。绵羊是用合成肽免疫(表1)并按说明出血(Danbolt等人，1998年)而是用皮下注射而不是皮内注射。

组织准备

小鼠（34-71天龄）因颈椎脱位而死亡，并被斩首。头是在解剖大脑之前，在室温下存放在塑料袋中1至72小时。立即解剖对照组大脑（0小时）。未监测室温，但昼夜波动很小，可能在18-25摄氏度之间。组织是在32体积的1%十二烷基硫酸钠和10mM磷酸钠中均化缓冲液（pH 7.4）、5 mM EDTA和1 mM PMSF用于免疫印迹（见下文）或浸泡固定（6-10小时，4C；4%甲醛在0.1 M磷酸钠缓冲液中，pH 7.4）免疫细胞化学。浸没固定组织在蔗糖（10、20和30%w/v），使用Cryotome Microm HM450切割（厚度=40µm；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），并使用如下所述的抗体进行开发。来自野生型的节和敲除小鼠一起培养。

电泳和免疫印迹

蛋白质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（SDS-PAGE），并如所述电印迹到硝化纤维素膜上(Lehre等人，1995年). 这些斑点是在Tris-HCl缓冲盐水中清洗，在含有1%（w/v）的封闭溶液中培养牛血清白蛋白和0.05%（v/v）吐温20在Tris-HCl缓冲盐水中，然后用初级抗体孵育（过夜，室温）(表1)如所示，用碱性开发如前所述的磷酸酶结合二级抗体(Danbolt等人，1992年).

免疫细胞化学揭示非同步蛋白水解

当蛋白质片段化时，这在免疫印迹上很明显。然而，膜只要蛋白质位于膜中，它们就仍然可以结合在一起。这个因此，有可能在组织切片中甚至可以看到末端尽管它们在蛋白质印迹上已无法检测到。我们探测了老鼠的前脑具有谷氨酸转运体抗体的切片。抗B12(图2A)和抗B2(图2B1)N末端的抗体很强用野生型小鼠的对照组（0小时）进行标记。大多数免疫反应，然而，24小时后消失，48小时后完全消失用抗B563抗体观察到C末端(图2A). 相反，这两种不同的抗体残留物493–508（抗B493）在48小时后仍产生强烈的标记(图2A,​，B1）。地下一层). 因此，截面的总体标记强度似乎与免疫印迹的标记强度平行。

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图2。

小鼠脑组织切片中GLT-1免疫反应的死后变化。（A） 用兔GLT-1抗体（抗B12、抗B493和抗B563。（B1）用羊GLT-1抗体：抗B2和抗B493。GLT-1敲除（KO）小鼠（3周龄）切片用作阴性控件。（B2）免疫印迹显示羊抗B2和抗B493的特异性抗体。抗体的使用浓度如图所示。比例尺=2毫米。

然而，当在更高的放大倍数下检查切片时(图3)很明显，标签的丢失观察到末端抗体（抗B12和抗B563）的出现并不均匀在所有单元格中。有一个补丁状的标签丢失。12小时(图3)，一些贴片的标签没有改变，一些增加了标签，有些完全没有标签。染色模式看起来像是由不同颜色的瓷砖拼成的马赛克，直径约为50µm。这与小鼠星形胶质细胞结构域的报告大小一致(Oberheim等人，2009年). （星形胶质细胞域是由一个星形胶质细胞的分支所定义的组织体积。这是有限的相邻星形细胞结构域之间的重叠[Oberheim等人，2009年].)

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图3。

以下部分图2以更高的放大倍数显示。（A） 请注意用GLT-1末端抗体观察到的新皮质（N）。这是在与用抗B493抗体观察到的标记相比。还要注意纹状体（S）的标记比新皮质更均匀。然而，在24岁时hr，抗B12和抗B563的斑片状标记也出现在纹状体中抗体。此时，这些抗体几乎没有任何标记在新皮质中，而用抗B493抗体标记几乎是保持不变。（B） 尸检12小时后新皮质的高倍图像。比例尺=100μm（A）和50μm（B）。

由于抗B493抗体的标记大多被保存下来，因此一些包含截断GLT-1的单元格(图。三：比较12小时和24小时的新皮质图像）。这已由确认双重标签。在0小时时，细胞对所有使用的GLT-1抗体均呈阳性，但在24小时时hr时，他们几乎只对抗B493抗体呈阳性（数据不是如图所示）。

在最初的6小时内，切片的标签没有显著变化(图4). 相比之下在接下来的6小时内发生变化。海马CA1–3是具有最早的更改。

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图4。

前12小时内GLT-1标记的变化。将小鼠大脑保存0、6和如图所示，12小时后使用GLT-1抗体进行培养（相同浓度，如图2).注意，所有抗体在最初的几个小时内标记都相当稳定，但12小时时，海马体（R层）出现未标记的斑块（箭头）放射状（CA1）和新皮质（N）。蒙太奇。比例尺=100μm。

死后蛋白水解可能涉及多种酶

我们在小鼠中复制了之前在大鼠身上的免疫印迹观察结果(Beckström等人，1999年)那个GLT-1末端的降解比中心的降解快得多蛋白质的一部分。此外，C末端裂解位点位于表位之间由抗B493抗体和抗B518抗体识别。这是一致的在505和506残基之间有一个caspase-3裂解位点(G.Gegelashvili等人，2002年;M.Gegelashvili等人，2002年;Boston Howes等人，2006年). 这个然而，GLT-1的位点是唯一的，因此不能解释GLAST的降解，也不能解释N末端的降解。因此，似乎更多酶参与其中。值得注意的是，EAAC1没有受到同样的影响学位。

截断的GLT-1仍处于活动状态

重要的是要注意(莱尼韦伯等，2011年)GLT-1既没有通过半胱氨酸蛋白酶-3位点的裂解而失活（导致去除最后68个氨基酸残基）也不是通过消除第一个N端有26个残基。这些调查结果与以下调查结果一致：约80%的转运活性在48小时后仍能在脂质体中重建(Beckström等人，1999年)和人类尸检制备的突触体中存在功能性谷氨酸摄取死亡后2天以上的样本（例如。，施瓦茨1981).

不同蛋白质水解速率的后果

如上所述，观察到的蛋白水解可能涉及几个不同的酶以不同的速率运行。这意味着不同的表位随着死亡间隔的变化而变化。特别是GLAST的C末端和GLT-1的C末端之间的变化比率特别大尸检后12至24小时内明显可见。此时，仍有许多细胞当用GLT-1末端的抗体检测时，GLAST呈阳性，但呈阴性。这个GLT-1末端在海马体中的片状消失已经在几个小时后开始。人体样本（参见图5E在里面Mathern等人[1999])，这个在死亡后7小时固定的海马体中已明显可见。重要的是，这个补丁在这个时间点，其他研究的转运体没有出现标记。

由于酶的表达和调节在疾病中可能发生改变，因此可以得出如下结论对照组和患病组的死后退化速度可能不同大脑。原则上，也可以假设蛋白水解可能是由体内试验。事实上，已经提出了蛋白水解活性的差异。例如，Beckström等人（1999）建立抗B12免疫反应与抗B493免疫反应之间的关系是来自对照组和阿尔茨海默病患者的样本不同。因此在每种情况下，需要确定可接受的尸检间隔的长度。

GLT-1和GLAST的细胞分布在人类和纳特群岛

大量文章描述了谷氨酸转运体在人脑中的分布样本已发布。在这里，我们随机浏览了其中一些文章选择了一些包含良好图像和关键参数的良好描述的(Milton等人，1997年;Fray等人，1998年;Tessler等人，1999年;Mathern等人，1999年;Proper等人，2002年;Banner等人，2002年;Matute等人，2005年;Björnsen等人，2007年;Woltjer等人，2010年;Melone等人，2011年;Desilva等人，2012年). 查看时这些文章中的数据结合在一起，呈现出一幅清晰的画面。标签手术中获得并立即修复的样本中的模式与这些相似这里显示的是老鼠死后立即修复的大脑。此外，随着尸检延迟，标记变得越来越不完整，就像这里显示的那样老鼠。

这个荟萃分析的结果并不排除物种表达差异不同转运体亚型和剪接变异体的水平和比例建议(Williams等人。2005)但它清楚地表明Melone等人（2011年）中的分布老鼠和人类非常相似，因此需要进行控制良好的定量测量以便识别差异。

我们感谢Henriette Danbolt的技术援助，感谢田中小喜的GLT-1(Tanaka等人，1997年)和GLAST(Watase等人，1998年)淘汰赛老鼠。