肝病学。作者手稿；PMC 2014年1月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院405340
一种新的小鼠肝星状细胞缺失模型揭示了其在肝脏损伤中的作用
,1,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1,2 ,4 ,1 ,三和1
胡安·普切
1美国纽约西奈山医学院肝病科
2西班牙马德里医学院CEU-San Pablo大学
乌苏拉·穆尼奥斯
1美国纽约西奈山医学院肝病科
2西班牙马德里医学院CEU-San Pablo大学
Hal F.Yee，Jr.小。
三美国加州大学旧金山分校医学系
1美国纽约西奈山医学院肝病科
2西班牙马德里医学院CEU-San Pablo大学
三美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学医学系
4美国纽约西奈山医学院微生物系
联系方式：Scott L.Friedman，医学博士，肝病科。西奈山医学院1123号信箱。麦迪逊大道1425号，1170C室。美国纽约州纽约市10029电话：（001）212 659 9501ude.msms@namdierF.ttocS - 补充资料
补充图S1：将7至8周龄WT和TG小鼠的HSC耗竭动物模型分为4组。为了耗尽HSC，用CCl治疗WT和Tk+小鼠4（0.25μL/g，第1、4、7和10天腹腔注射）、烯丙醇（0.0125μL/g，第2、5、8天腹腔注射）和更昔洛韦（100μg/g，第3天至第11天腹腔注射）。每组至少治疗6只动物。（B） HSC耗竭的BDL模型：8至12周龄的WT和TG在第1天接受BDL（或假手术），并在第2天至第11天接受GCV（100μg/g i.p.）或生理盐水。BDL治疗组n=5，sham+GCV组n=3，sham+盐水治疗组n=2。（C） HSC耗竭后慢性肝损伤模型：CCl一个月4在常规耗竭治疗（见A）后给药（0.25μL/g，i.p，三次/周）和GCV（100μg/g i.p，两次/周
GUID:B3381D04-8B3D-4231-B1D2-D923B5A88535
补充图S6：BDL模型中的HSC耗竭。BDL+GCV处理的TG小鼠结蛋白阳性组织面积的量化显示出显著减少，表明HSC成功耗竭。箭头：导管反应；星号：WT小鼠的坏死区域*p<0.05。
GUID:FC96D214-B58B-4B27-9DFD-F61D2AC43233
补充图S7：用耗尽治疗（CCl）处理的WT和TG动物的结蛋白（绿色）和GFAP（红色）共同免疫荧光4+AA+GCV）治疗6天（GCV的第4天）或9天（GCV7天），而不是常规的12天。使用GCV的持续时间，治疗6天后HSC数量减少了约40%，治疗9天后减少了约50%。原始放大倍数×100。
GUID:7D329DCC-E350-48D5-A4CB-464D27AEAEBA
补充图S8：CCl4+AA+GCV治疗4天的小鼠体内TUNEL染色显示，与WT小鼠相比，TG小鼠的非实质性细胞凋亡增加（A）分析了每只小鼠10个高倍视野。用结蛋白（HSC标记物）和TUNEL（B）染色的连续切片显示相同细胞有明显表达。原始放大倍数×200**p<0.01。
GUID:246D8288-8781-4866-96CD-8039B6741D8D
补充图S9：CCl4+AA+GCV治疗不会影响外周血白细胞计数、肾功能、Cyp2E1活性或30天存活率。在接受CCl耗竭治疗的WT和TG之间，血白细胞、肌酐水平、Cyp2A1活性或30天后存活率无显著差异4+AA+GCV。至少6只动物接受了治疗。
指南：803CF4BD-25BD-4548-A68C-4EADD7BDC4C2
补充表S1：PCR引物序列（5'和3'）。
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补充方法。
GUID:45FC990D-B3E3-4E8C-BDDF-1BF112F1205E
补充图S10：HSC耗竭小鼠的肠道组织学对完整肠道（空肠、回肠和结肠）的组织学分析显示，CCl治疗的WT或TG小鼠没有水肿、炎症或坏死的证据4+AA+GCV。
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补充图S11：嗯1非HSC-缺失WT小鼠肝脏中的表达增加。通过免疫印迹法评估，与CCl治疗的TG动物相比，WT的全肝裂解物中Hmgb1蛋白增加4+AA+GCV*p<0.05。
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补充图S12：HSC耗竭后肝细胞损伤的时间进程（A）CCl第一次给药后4+AA（GCV的第0天），WT和TG小鼠的球囊扩张或小叶中心坏死没有差异。然而，当加入GCV治疗以耗尽HSC时，TG小鼠在治疗6天和9天（分别为GCV治疗4天和7天）时表现出明显较少的坏死和气球状变。（B） 第一剂量CCl后，WT和TG小鼠的ALT水平相似4+AA（当HSC尚未耗尽时）。然而，一旦发生损耗（CCl4+AA+GCV），TG小鼠的ALT水平随后下降。原始放大倍数×100*p<0.05***p<0.001。
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补充图S13：HSC耗竭后肝内白细胞的流式细胞术（A）Tregs和Ly6C+80层/四层+CD11b型+细胞（IL-10的潜在来源）和（B）树突状细胞、自然杀伤细胞、CD4+和CD8+T细胞（干扰素γ的潜在细胞来源）在CCl去除HSC的TG小鼠肝脏中显著增加4+AA+GCV*p<0.05**p<0.01。
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补充图S2：体外优化GCV剂量以激发HSC耗竭（A）JS1细胞，用指定浓度的GCV培养3天。剂量高于10μM对永生化HSC（JS1）和肝细胞（AML12）有毒，评估方法为三Hthymidine掺入。（B） AlamarBlue对JS1细胞中GCV毒性的确认。（C） 台盼蓝在JS1细胞中证实了选定的无毒剂量（5μM）和毒性剂量（500μM）用于进一步实验。（D） HSV-Tk mRNA的表达。从WT和TG肝脏中分离出HSC并培养7天。在不同的时间点（1、2、4和7天）HSV-Tk型用RT-PCR检测mRNA表达。只有TG小鼠表达HSV-Tk型基因。（E） 缺乏GCV对肝细胞DNA合成的影响：从WT和TG小鼠中分离出原代肝细胞，并用不同GCV浓度培养5天。各组之间未发现增殖差异。（F） 用同样的GCV剂量处理永生内皮细胞，组间无差异。数据是三个独立实验的平均结果*p<0.05。
GUID:44AC634C-C53D-4380-BCEE-CE2B8666721F
补充图S3：GCV肝毒性的测定用GCV（0、20、50、75、100和150μg/g体重）治疗WT和TG动物10天。（A） ALT水平没有增加。（B） 在用150μg/g体重GCV治疗的小鼠中，TG动物比WT动物的体重减轻更大，因此在随后的实验中使用100μg/g的剂量*p<0.05。
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补充图S4：烯丙醇治疗的优化使用不同剂量的烯丙醇（AA）（0.5、0.25、0.1、0.05和0.0125μL/g，稀释在100μL生理盐水中，每3天注射4次），以找到对（a）存活率、（B）基于组织学的肝损伤（H&E染色）和（C）影响最小的剂量通过α0-SMA染色评估HSC激活程度。原始放大倍数×100（B）和×200（C）。
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补充图S5：GCV和CCl4+AA处理小鼠组的Desmin（绿色）和GFAP（红色）共同免疫荧光对照组对应于图2A。各组间HSC数量无差异。原始放大倍数×100。
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摘要
我们开发了一种耗竭小鼠HSC的新模型，使我们能够阐明它们对肝损伤和纤维化的作用。表达单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因的转基因小鼠(HSV-Tk型)在小鼠GFAP启动子的驱动下，使增殖的HSC对更昔洛韦（GCV）产生杀伤反应。探讨GCV对原发性HSC和体内通过结合四氯化碳（CCl），引起全小叶损伤以最大限度地减少HSC耗竭4)（小叶中心损伤）和烯丙醇（AA）（门脉周围损伤），以及胆管结扎（BDL）模型。细胞耗竭就地采用双重免疫荧光（IF）定量结蛋白和GFAP。在从未经治疗的野生型（WT）和TG小鼠分离的原代HSC中，GCV诱导TG小鼠约50%的HSC细胞死亡，但WT小鼠没有。CCl治疗的TG小鼠4+AA+GCV，与WT小鼠相比，GFAP和结蛋白阳性细胞显著减少（约65%减少，p<0.01），同时伴有HSC活化标记物（α-SMA、β-PDGFR和I型胶原）的表达减少。BDL后也出现了类似的结果。如天狼星红/快速绿、H&E定量和血清ALT/AST所示，在两种纤维化模型中，与HSC耗竭相关，纤维化和肝损伤显著减轻。HSC耗竭后，肝脏IL-10和IFN-γ的表达增加。GCV在WT和TG小鼠中的毒性均不能解释损伤的差异。
结论
激活的HSC显著增强了肝脏对肝损伤的反应，进一步扩大了这种细胞在协调肝脏损伤和修复中的储备。
关键词：单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶（HSV-Tk），四氯化碳（CCl4)、纤维化、凋亡、胆管结扎（BDL）
肝星状细胞（HSCs）是一种特征鲜明的非实质性肝细胞，在纤维化、修复和免疫中具有既定作用(1). 在肝损伤期间，静止的HSC被激活，分泌一系列与细胞增殖、趋化性、炎症和纤维化等有关的分子。尽管HSC在纤维化形成中的作用已被证实，但其对急性肝细胞损伤和组织稳态的作用尚不清楚。
操纵HSC函数或数字的模型提供了一种吸引人的策略来澄清这个问题。然而，仅建立了两种模型来消耗HSC体内到目前为止，通过使用胶质毒素(2)或抗突触素的胶质毒素偶联抗体(三,4). 据报道，胶质细胞毒素通过破坏NF-κB介导的存活诱导HSC选择性凋亡(2)，可以减少纤维化并提高实验模型的分辨率，特别是当使用HSC特异性抗体作为靶点时(三–5). 然而，胶质毒素也有广泛的作用体内在培养中，不仅针对HSC，还针对免疫细胞、内皮细胞和肝细胞(5,6).
另一种策略是体外表达单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-Tk型)靶细胞中的基因，这使它们容易被抗病毒药物更昔洛韦（GCV）杀死，但只有当细胞增殖时。这种可能性最初被报道为一种抗癌方法(7)并进一步完善(8)在小鼠肉瘤和淋巴瘤细胞中，引起凋亡和非凋亡细胞死亡(9,10). 该方法在肝损伤模型和培养的HSC中也有报道(11)，但尚未用于消耗HSC体内(12).
我们利用小鼠表达HSV-Tk型GFAP启动子驱动的基因，该启动子是啮齿动物肝脏HSC的标记(1). 该方法揭示了HSC在放大急性肝损伤中的一种新的、出乎意料的作用。
实验程序
（更多信息见补充材料和方法)
动物
7至8周龄男性Gfap-Tk小鼠（B6.Cg-Tg（Gfap-Tk）71Mvs/J，马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）用于体内根据机构动物护理和使用委员会协议进行实验。转基因小鼠表达疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-Tk型)由小鼠胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子驱动。HSV-Tk型阴性窝友作为对照（WT）。
HSC耗竭的体内肝损伤模型
所有处理方案如所示补充图1四氯化碳（CCl4)和烯丙醇（AA）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。用CCl治疗小鼠4（0.25μL/g，在第1、4、7和10天用50μL玉米油稀释）和烯丙醇（0.0125μL/g i.p.在第2、5、8天用100μL 0.9%NaCl稀释）诱导急性肝损伤并优化HSC增殖，同时只引起轻度肝损伤。诱导选择性杀灭HSV-Tk型-表达HSC的更昔洛韦（GCV）（Cytovene，CA）从第3天到第11天给药（100μg/g，i.p.稀释在0.9%NaCl中），n=6。
对于胆管结扎，8-12周龄的小鼠接受了BDL或如前所述的假手术(13). 从手术后第二天开始，WT和TG动物连续11天接受100μg/g/d GCV静脉注射，稀释至0.9%NaCl（或假动物仅0.9%NaCI）。每个BDL组至少治疗5只动物（n=5）；假手术+GCV（n=3）、假手术+生理盐水（n=2）。
细胞系和培养物
小鼠肝星状细胞系JS1先前已有描述(14)，小鼠肝细胞系AML12购自美国弗吉尼亚州ATCC，永生内皮细胞系TSEC由医学博士Vijay Shah捐赠(15).
原代HSC和肝细胞的分离培养
通过胶原酶和蛋白酶原位灌注肝脏和Percoll™梯度离心分离小鼠HSC。原代肝细胞通过胶原酶原位灌注，然后进行差速离心分离。
组织学分析
由专业病理学家（I.F.）进行组织学肝脏分析，对小叶中心和实质坏死的评分均为0-3，依据如下：0.无，1.分离肝细胞，2.肝细胞组，3.桥接。肝细胞起泡评分如下：0。无，1。轻度，2。中度，3。重度。对于每只小鼠，在100倍放大率下分析10个场，并计算每只小鼠的平均值。
统计分析
除非另有说明，数据表示平均值±SEM。统计分析由SPSS®软件（美国伊利诺伊州第17版）执行。显著性通过Student t检验或适当时通过方差分析（ANOVA）计算。如果p<0.05，则认为差异显著。
结果
HSV-胸苷激酶（HSV-Tk）表达和更昔洛韦（GCV）对培养原代细胞的特异性毒性验证
对从全肝提取的mRNA和从野生型（WT）和GFAP-HSV-Tk公司（TG）小鼠。只有TG样本一致表达HSV-Tk型在原代培养中长达7天的转录本(补充图2A).HSV-Tk型WT和TG原代肝细胞均无表达（数据未显示）。
培养细胞中GCV剂量的优化
在最初的研究中，我们首先在已建立的小鼠细胞系中建立了GCV的剂量依赖性毒性曲线，然后将相同浓度应用于从WT和TG小鼠分离的原代HSC。将永生化小鼠星状细胞（JS1）和肝细胞（AML12）与递增GCV浓度孵育3天。GCV介导的毒性与HSV-Tk型通过评估分析基因表达三H-胸腺嘧啶掺入和AlamarBlue分析。通过台盼蓝染色和测定活细胞百分比来确定细胞死亡。使用这种方法，GCV剂量高于10μM对细胞系有毒(补充图2B-D)因此，随后在原代细胞中进行的实验使用了5μM GCV，避免了非特异性毒性。
接下来，用GCV（5μM和500μM）或生理盐水培养WT和TG小鼠的原代HSC 5天。特定GCV毒性通过测量三H-胸腺嘧啶掺入和台盼蓝染色(). 只有TG HSC的胸腺嘧啶掺入量和细胞存活率显著降低，表明5μM时GCV介导的特异性杀伤，从而验证了该构建物的用途体内。
体外优化GCV剂量以激发HSC耗竭（A） GCV介导的TG小鼠HSC增殖特性的研究三H-胸腺嘧啶掺入。浓度为5μM的GCV可特异性降低TG-HSC增殖（B）。通过台盼蓝染色测定，大于10μM的剂量对WT和TG小鼠的原代HSC和肝细胞具有毒性。（C） 免疫印迹法检测WT和TG小鼠原代HSC中PARP的裂解表达。用GCV处理的TG HSC表达更多裂解的PARP，与细胞凋亡增加一致，这是细胞死亡的机制。（D） 用泛酶抑制剂z-VAD-fmx孵育可消除三TG-HSC上GCV的H-胸腺嘧啶掺入。数据是来自三个独立实验的平均值*p<0.05。
为了进一步确定GCV的特异性，我们还从WT和TG小鼠中分离出原代肝细胞，将其与相同浓度（5μM和500μM）的GCV孵育。在原代肝细胞中，5μM GCV对细胞没有影响，而500μM GCV仍然有毒，这突出了5μM浓度下细胞杀伤的特异性(补充图2E). 用相同GCV剂量处理的永生内皮细胞（TSEC）表现出与原代肝细胞相同的行为，但其表达量没有减少三H-胸腺嘧啶核苷在5μM GCV下掺入，但在500μM下有显著影响(补充图2F).
GCV通过凋亡杀死HSV-Tk表达的HSC
接下来，我们通过Western blot检测PARP裂解，以反映细胞凋亡，从而确定GCV介导的TG HSC杀伤的机制。使用这种方法，只有经GCV处理的TG HSC显示出特异性PARP裂解(). 泛酶抑制剂z-VAD-fmx也完全抑制了转基因HSC的杀伤，进一步确立了凋亡是GCV介导的杀伤机制().
GCV给药后体内HSC耗竭的优化
接下来我们确定了GCV效应的特异性体内给WT和TG小鼠每日ip不同浓度（20–150μg/g体重）的GCV，持续10天，以确定剂量范围。这些小鼠均未表现出行为或形态变化（数据未显示），或血清ALT水平升高(补充图3A). 相反，使用更高剂量的GCV（≥150μg/g）延长治疗时间后，TG小鼠的体重显著下降，但WT小鼠的重量没有显著下降(补充图3B). 这一发现以及之前发表的研究(16)，导致我们在随后的实验中选择100μg/g的最终剂量以耗尽TG HSC体内。
由于HSC必须增殖以使其易受GCV介导的杀伤，我们接下来优化了所需的肝损伤方法，以最大限度地减少HSC。为此，我们使用了CCl4和烯丙醇（AA）分别诱导选择性损伤小叶中心区和门脉周围区。因此，我们根据小鼠存活率、HSC活化程度（α-SMA IHC）和肝损伤（H&E），在4次AA剂量（每3天一次）后，选择0.0125μL/g作为最终剂量，绘制了剂量依赖性毒性曲线，以刺激最广泛的HSC增殖，同时最小化肝细胞损伤(补充图4). 0.25μL/g CCl剂量4使用50μL油优化小叶中心HSC激活。处理方案如所示补充图1A。
TG小鼠HSC耗竭的验证
CCl治疗的TG小鼠4+AA+GCV（“耗尽治疗”），与接受相同治疗的WT小鼠相比，结蛋白和GFAP共表达细胞显著减少，减少约65%，经免疫荧光共定位分析评估，p<0.01(和补充图5). 蛋白质表达的减少伴随着GFAP公司HSC耗竭小鼠的mRNA().
CCl治疗的TG小鼠体内HSC耗竭的验证4+AA+GCV（A） CCl治疗的TG小鼠中结蛋白（绿色）和GFAP（红色）阳性细胞以及合并图像（黄色）减少65%（p<0.01）4+AA+GCV，通过双重免疫荧光法与WT小鼠进行比较。（B） 相对GFAP公司mRNA表达（通过qPCR）表明，在HSC耗竭的TG小鼠中显著降低。数据是三个独立实验的平均值，这些实验均以盐处理小鼠为标准。GCV治疗（无CCl4+AA）与生理盐水治疗组无差异。原始放大倍数×100*p<0.05。
为了进一步分析耗尽治疗的疗效，我们评估了HSC激活标记物，包括α-SMA免疫组织化学和β-PDGFR公司和胶原蛋白ImRNA定量。与WT小鼠相比，HSC耗竭的TG动物中α-SMA阳性细胞耗竭>90%。始终，β-PDGFR公司和胶原蛋白I与WT小鼠相比，HSC耗竭后TG小鼠的mRNA表达水平降低(). 感兴趣的是，CXCR4系列最近与HSC激活有关(17)在HSC耗竭的TG小鼠中，其mRNA表达也降低().
HSC耗竭后HSC活化标记物减少（A） 通过免疫组织化学评估HSC耗竭的TG小鼠中α-SMA阳性细胞减少。（B） 与HSC激活相关的相对mRNA表达基因（β-PDGFR公司和胶原蛋白I). 在HSC缺乏的TG小鼠中，这些标记物显著减少。（C） 相对mRNA表达CXCR4系列在HSC耗竭的TG小鼠中减少。原始放大倍数×200*p<0.05。
我们在胆管结扎（BDL）模型中证实了这些发现。在WT和Tg小鼠（n=5）中进行BDL（或假手术）(补充图1B). 小鼠接受100μg/g/d GCV ip。（或0.9%NaCl）持续11天。在经BDL+GCV治疗的Tg小鼠中，与WT小鼠相比，结蛋白阳性细胞显著减少，这表明表达GFAP的活化纤维生成细胞也在BDL后增殖，因此GCV可以在BDL中成功耗尽这些细胞Gfap-HSV-Tk公司+老鼠(补充图6).
确定细胞凋亡是否是HSC耗竭的原因体内与培养一样，我们对接受CCl治疗的小鼠进行了TUNEL染色4+AA+GCV治疗4天而不是10天，因为我们预计此时接受凋亡的HSC数量会更高。事实上，在第4天和第7天，HSC耗竭是明显的（分别减少约40%和50%，p<0.05），尽管程度较低(补充图7). 正如预期的那样，在耗尽治疗后，TG小鼠与WT动物相比，非实质性TUNEL阳性细胞明显增加(补充图8A). 为了进一步确定这些非实质性TUNEL阳性细胞是HSC，我们用TUNEL和结蛋白染色分析了连续切片(补充图8B)虽然需要双重免疫荧光和共聚焦显微镜才能严格确认共表达，但它们在相同的细胞中表现出明显的表达。
值得关注的是，使用CCl消耗HSC4+在其他GFAP表达人群中，AA+GCV未伴随任何可检测到的GCV非肝脏效应。具体而言，动物行为、30天存活率、白细胞计数、血清肌酐、Cyp2E1活性（代谢CCl）没有差异4和烯丙醇）(补充图9)或HSC耗竭后宏观或微观胃肠道外观(补充图10). 具体而言，WT和TG小鼠的肠道没有水肿、坏死或炎症。补充的肠道净化报告了关于HSC耗竭的相同结果（数据未显示），排除了肠道通透性改变作为可能原因的可能性。
HSC耗竭的功能后果
在建立了一种特定的、可重复的HSC耗竭方法后，我们接下来探讨了HSC耗损对两种模型中纤维化、肝损伤和肝炎症的功能影响。
减轻肝纤维化
由于活化的HSC是肝损伤期间主要的胶原蛋白生成细胞，因此我们在其耗竭后通过胶原蛋白形态计量学评估纤维化。CCl后11天4+AA+GCV治疗后，胶原沉积在GFAP-HSV-Tk公司通过天狼星红/快速绿染色和形态计量学测定小鼠与野生动物的比较(). 这一发现也可以在BDL+GCV治疗的小鼠中观察到（参见).
HSC缺乏对小鼠肝纤维化的减轻作用（A） 通过天狼星红/快速绿染色和Bioquant计算机形态计量法对（A）CCl4+AA+GCV治疗小鼠和（B）BDL+GCV处理小鼠的纤维化含量进行量化。原始放大倍数×100*p＜0.05**p<0.01。
减少肝脏损伤
基于组织学和血清化学的纤维化模型显示，TG中HSC缺失后肝坏死的程度显著降低。盲法病理评分显示两种CCl的坏死评分均显著降低4+AA+GCV()和BDL+GCV治疗的TG动物()，从而强调了这种删除方法对两种不同机制的纤维化模型的适用性。CCl患者AST/ALT水平显著降低4+AA+GCV治疗的动物表明肝损伤较少(). BDL+GCV治疗的动物也可以观察到同样的趋势()而血清总胆红素或总蛋白无显著差异（数据未显示）。与组织学结果一致，HMGB1（肝损伤标志物）的表达显著降低(18))HSC缺乏的TG动物(补充图11). 肝损伤的程度（通过小叶中心坏死、气球状变、血清AST/ALT水平的组织学评分评估）在时间上与CCl治疗0、4和7天的小鼠HSC耗竭程度一致4+AA+GCV，加强HSC在引发损伤中的作用(补充图12).
减少HSC缺乏小鼠的肝坏死（A） H&E染色及其组织学评分显示CCl去除HSC的TG小鼠小叶中心和实质坏死均显著减少4+AA+GCV缺失处理。（B） BDL后GCV治疗导致HSC耗竭的TG小鼠肝坏死程度持续下降。原始放大倍数×100*p<0.05。
HSC和肝脏4-HNE表达小鼠血清AST/ALT水平降低经（A）CCl治疗的TG小鼠的ALT和AST水平较低4+与WT小鼠相比，BDL+GCV治疗动物中的AA+GCV和（B）。（C） 通过Western blot分析全肝组织中的蛋白质的4-HNE表达。在HSC耗竭的TG小鼠中观察到的氧化损伤少于WT小鼠*p<0.05。
为了解决减少肝损伤的潜在原因，我们通过免疫印迹法分析了CCl全肝裂解物中的脂质过氧化标记物4-羟基-2-壬醛（4-HNE）4+AA+GCV动物，显示HSC耗竭的TG小鼠中4-HNE修饰蛋白显著减少().
我们还确定了是否可以通过用减少的CCl剂量继续进行消耗治疗来维持HSC消耗长达一个月4和GCV，以评估对生存率、非肝脏影响、纤维化和损伤的影响（治疗总结于补充图1C). 与之前的结果一致，纤维化仍有统计学上的显著下降()组织学坏死评分评估的肝脏损伤()和ALT水平()在TG小鼠中。有趣的是，TG小鼠的球囊变性明显增加，而小叶中心坏死减少。TG或WT小鼠的总体存活率或体重减轻没有显著差异（数据未显示）。
HSC耗竭对CCl慢性肝损伤的影响4（A） 与WT动物相比，HSC耗竭的TG小鼠慢性肝损伤后纤维化沉积减少。将数值标准化为盐水处理的WT和TG小鼠。（B） 肝细胞坏死和膨胀的H&E染色和组织学评分。与WT动物相比，TG小鼠表现出坏死减少，但膨胀增加。（C） 在慢性肝损伤后，与WT动物相比，经历HSC耗竭的TG小鼠具有较低的血清ALT水平。CL，小叶中心。原始放大倍数×100*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
肝内白细胞数量和肝内细胞因子表达的改变
使用细胞因子珠阵列分析进行的初步筛选显示，CCl中诱导了两种关键的抗炎细胞因子，IL-10和IFN-γ4+AA+GCV HSC缺失TG小鼠()BDL+GCV治疗的TG小鼠中IL-10和IFN-γ(). 未观察到IL-6或TNF-α浓度的变化（数据未显示）。为了确定IL-10和IFN-γ的可能来源，我们分析了肝内白细胞群并进行了多色流式细胞术分析。树突状细胞、自然杀伤细胞和CD4+和CD8+T细胞是干扰素-γ的主要潜在来源，在TG-HSC缺失小鼠中显著增加。在产生IL-10的免疫细胞中，Tregs和Ly6C+/80层/四层+/在HSC耗竭期间，CD11b+细胞显著聚集到肝脏(补充图13).
HSC缺乏后全肝IL-10和IFN-γ增加（A） CCl降低HSC的TG小鼠IL-10和IFN-γ的相对mRNA表达和蛋白浓度增加4+AA+GCV。（B） BDL+GCV治疗小鼠的全肝裂解物中IL-10和IFN-γ的蛋白浓度。qPCR数据是三个独立实验的平均值，标准化为盐处理小鼠。GCV治疗（无CCl4+AA）与生理盐水治疗组无差异*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
讨论
目前正在努力用细胞特异性试剂靶向HSC，作为潜在的诊断或治疗工具。同时，其他细胞类型也利用了细胞特异性缺失来确定其对器官内环境稳定（如巨噬细胞）的贡献，一些研究检测了HSC缺失(2–5). 迄今为止，这些研究加强了HSC在纤维化形成中的已知作用，但并未扩大其对肝脏损伤和炎症的潜在贡献。胶质毒素，即使是通过与突触素抗体偶联而靶向HSC，也可能具有广泛的作用体内对尚未完全鉴定的免疫细胞进行检测，例如通过分析F4/80以外的巨噬细胞标记物+（如CD68）或通过肝内白细胞的FACS分析(三,4).
我们在此报道了一种新的HSC耗竭小鼠模型，该模型揭示了先前未知的在放大肝损伤中的作用，使用表达HSV-Tk型由小鼠GFAP启动子驱动的基因。该系统限制细胞耗竭至增殖的HSC，从而揭示仅激活的HSC对肝脏损伤和修复的影响，因为静止的非增殖HSC不受影响。
初步分析证实，用GCV治疗TG小鼠分离培养的HSC时，HSC增殖减少（约50%），凋亡增加，这与以前利用HSV-Tk型`自杀基因策略(12)并模拟HSC在解决急性肝损伤期间的自然命运(19). 值得注意的是，大约70%的HSC表达GFAP(20)，因此GCV介导的杀伤作用影响大多数，但不是所有的HSC。重要的是，无论是WT还是TG小鼠的肝细胞，还是永生化窦内皮细胞，都没有被相同的治疗耗尽，这增强了该模型的细胞特异性。因为GFAP-HSV-Tk型在肝脏外的特定细胞（例如肠神经胶质细胞）中表达。我们排除了其他组织中GFAP表达细胞丢失或代谢改变导致肝脏效应的可能性。GCV的致死效应(16)在这些小鼠中通过皮下泵连续服用GCV（100μg/g/d）14天后报告。因此，我们将GCV治疗限定为11天，每天静脉注射一次。根据其药代动力学，GCV的毒性血清水平预计持续时间更短，从而将不良影响降至最低。事实上，在我们的治疗方案中，我们没有发现死亡率或死亡率增加，也没有发现小肠病理改变。
一旦体内HSC耗尽，通过测量HSC激活标记物来评估其功能影响。在HSC耗竭的TG小鼠中，α-SMA阳性细胞以及其他HSC增殖标记物（即β-PDGFR和I型胶原）显著减少，表明耗竭影响了那些对纤维化形成和修复最关键的HSC（即活化的HSC）。有趣的是，在HSC耗竭的TG小鼠中，CXCR4表达也降低。这种细胞因子受体是活化HSC的另一个特征，也有助于促纤维化和增殖反应(17).
这些发现加强了治疗性HSC耗竭的理论基础，尽管不一定是自杀基因策略。此外，不仅纤维化减少，急性损伤也减轻，这表明活化HSC的耗竭对纤维化程度和损伤程度都有双重有益影响。与损伤减轻相关的是4-HNE减少，这与氧化应激减少一致，尽管我们的研究结果没有阐明WT和TG小鼠中这些前氧化剂的来源。具体而言，4-HNE的减少可能反映出HSC释放减少，因为HSC耗尽，或HSC向其他生成4-HNE细胞类型（包括肝细胞或炎性细胞）的旁分泌信号丢失。此外，4-HNE直接与人类HSC中的JNK亚型相互作用，刺激I型前胶原的表达和合成(21). 因此，4-HNE减少导致JNK介导的胶原蛋白表达减少的反馈回路也可能导致胶原蛋白生成减少。值得注意的是，以前使用胶质毒素的研究并未揭示HSC耗竭对损伤的影响(2,5)可能是因为胶质毒素的作用没有那么特异，而胶质毒素对其他细胞类型的同时作用可能减弱了表型。
在HSC缺乏的情况下减轻损伤的机制尚未完全阐明，但IL-10和IFN-γ的增加可能有助于减少损伤，因为这两种细胞因子同时下调HSC活化和纤维化的产生(22). 肝内免疫细胞群的多色流式细胞术显示，已知的IL-10细胞来源（Tregs和单核细胞）数量增加(23)以及IFN-γ（DC、NK、CD4+和CD8+T细胞）(24). 具体而言，Tregs的增加伴随着IL-10的增加，这与IFN-γ在两种HSC耗竭模型中的增加不同，表明Tregs在减轻肝损伤方面具有潜在作用，尽管在缺乏HSC的情况下，一些免疫细胞的数量增加了。进一步研究以分析这些初步发现，并通过特定耗竭研究确定负责的免疫细胞群体内目前正在进行中。
重要的是，HSC耗竭后，不仅在急性损伤中，而且在慢性损伤中（持续CCl耗竭HSC 30天后4和GCV），以及BDL纤维化模型，表明结果具有普遍性，且不限于单一损伤模型。慢性损伤后HSC耗竭的小鼠都存活了下来，证明了这种策略在慢性HSC耗竭中的实用性。有趣的是，TG小鼠的损伤减少与更多的肝细胞气球化有关，这增加了气球化变性而非坏死可能是有益的前景，因为气球化先前被认为表明损伤后细胞恢复的可能性更大(25).
我们的研究进一步表明HSC（而不是门脉肌成纤维细胞，据报道不表达GFAP(26)BDL诱导的纤维化中的主要成纤维细胞群体与早期通过微阵列分析不同模型中HSC的研究一致(27).
总之，我们描述了一种新的HSC耗竭方法，该方法证实了这些细胞在纤维化生成中的首要作用，但也揭示了在放大肝细胞肝损伤和降低保护性细胞因子方面的意外作用。该模型为探索肝内稳态的其他特征提供了前景，这些特征可能依赖于肝干细胞，包括肝外来源的肝干细胞的再生及其对肝再生和肿瘤形成的贡献。
补充材料
补充图S1
HSC耗竭的动物模型：（A） 7~8周龄WT和TG小鼠分为4组。为了耗尽HSC，用CCl处理WT和Tk+小鼠4（0.25μL/g，第1、4、7和10天静脉注射）、烯丙醇（0.0125μL/g静脉注射，第2、5、8天）和更昔洛韦（从第3天到第11天静脉注射100μg/g）。每组至少治疗6只动物。（B） HSC耗竭的BDL模型：8至12周龄的WT和TG在第1天接受BDL（或假手术），并在第2天至第11天接受GCV（100μg/g i.p.）或生理盐水。BDL治疗组n=5，sham+GCV组n=3，sham+盐水治疗组n=2。（C） HSC耗竭后慢性肝损伤模型：CCl一个月4在常规耗竭治疗（见A）后给药（0.25μL/g，i.p，三次/周）和GCV（100μg/g i.p，两次/周
补充图S6
BDL模型中的HSC消耗：定量结蛋白阳性组织面积显示BDL+GCV治疗的TG小鼠的结蛋白阳性区域显著减少，表明HSC成功耗尽。箭头：导管反应；星号：WT小鼠的坏死区域*p<0.05。
补充图S7
用耗尽治疗（CCl）处理的WT和TG动物的结蛋白（绿色）和GFAP（红色）共同免疫荧光4+AA+GCV）6天（GCV的第4天）或9天（GCC的第7天），而不是常规的12天：使用GCV的这个持续时间，治疗6天后HSC数量减少40%，治疗9天后减少50%。原始放大倍数×100。
补充图S8
细胞凋亡是体内HSC耗竭的原因：用CCl4+AA+GCV治疗4天的小鼠的TUNEL染色显示，与WT小鼠相比，TG小鼠的非实质细胞凋亡增加（A）分析了每只小鼠10个高倍视野。用结蛋白（HSC标记物）和TUNEL（B）染色的连续切片显示相同细胞有明显表达。原始放大倍数×200**p<0.01。
补充图S9
CCl4+AA+GCV治疗不会影响外周血白细胞计数、肾功能、Cyp2E1活性或30天存活率：接受CCl耗竭治疗的WT和TG在血白细胞、肌酐水平、Cyp2E1活性或30天生存率方面没有发现显著差异4+AA+GCV。至少6只动物接受了治疗。
补充图S10
HSC缺乏小鼠的肠道组织学：完整肠道（空肠、回肠和结肠）的组织学分析显示，用CCl治疗的WT或TG小鼠没有水肿、炎症或坏死的证据4+AA+GCV。
补充图S11
嗯1非HSC-缺失WT小鼠肝脏中的表达增加：通过免疫印迹法评估，与CCl治疗的TG动物相比，WT全肝裂解物中Hmgb1蛋白增加4+AA+GCV*p<0.05。
补充图S12
HSC耗竭后肝细胞损伤的时间进程：（A） 第一次服用CCl后4+AA（GCV的第0天），WT和TG小鼠的球囊扩张或小叶中心坏死没有差异。然而，当加入GCV治疗以耗尽HSC时，TG小鼠在治疗6天和9天（分别为GCV治疗4天和7天）时表现出明显较少的坏死和气球状变。（B） 第一剂量CCl后，WT和TG小鼠的ALT水平相似4+AA（当HSC尚未耗尽时）。然而，一旦发生损耗（CCl4+AA+GCV），TG小鼠的ALT水平随后下降。原始放大倍数×100*p<0.05***p<0.001。
补充图S13
HSC耗竭后肝内白细胞的流式细胞术：（A） Tregs和Ly6C+80层/四层+CD11b型+细胞（IL-10的潜在来源）和（B）树突状细胞、自然杀伤细胞、CD4+和CD8+T细胞（干扰素γ的潜在细胞来源）在CCl去除HSC的TG小鼠肝脏中显著增加4+AA+GCV*p<0.05**p<0.01。
补充图S2
体外优化GCV剂量以激发HSC耗竭：（A） JS1细胞在GCV指示浓度下培养3天。剂量高于10μM对永生化HSC（JS1）和肝细胞（AML12）有毒，评估方法为三Hthymidine掺入。（B） AlamarBlue在JS1细胞中对GCV毒性的确认。（C） 台盼蓝在JS1细胞中证实了选定的无毒剂量（5μM）和毒性剂量（500μM）用于进一步实验。（D） HSV-Tk mRNA的表达。从WT和TG肝脏中分离出HSC并培养7天。在不同的时间点（1、2、4和7天）HSV-Tk型用RT-PCR检测mRNA表达。只有TG小鼠表达HSV-Tk型基因。（E） 缺乏GCV对肝细胞DNA合成的影响：从WT和TG小鼠中分离出原代肝细胞，并用不同GCV浓度培养5天。各组之间未发现增殖差异。（F） 用同样的GCV剂量处理永生内皮细胞，组间无差异。数据是三个独立实验的平均结果*p<0.05。
补充图S3
GCV肝毒性的测定：用GCV（0、20、50、75、100和150μg/g体重）治疗WT和TG动物10天。（A） ALT水平没有增加。（B） 在用150μg/g体重GCV治疗的小鼠中，TG动物比WT动物的体重减轻更大，因此在随后的实验中使用100μg/g的剂量*p<0.05。
补充图S4
烯丙醇处理的优化：使用不同的烯丙醇（AA）剂量（0.5、0.25、0.1、0.05和0.0125μL/g，稀释在100μL生理盐水中，每3天注射4次），以找出对（a）存活率、（B）基于组织学（H&E染色）的肝损伤和（C）HSC活化程度影响最小的剂量，通过α0-SMA染色评估。原始放大倍数×100（B）和×200（C）。
补充图S5
GCV和CCl4+AA处理小鼠组的Desmin（绿色）和GFAP（红色）联合免疫荧光：对照组对应于图2A。各组间HSC数量无差异。原始放大倍数×100。
致谢
我们感谢Virginia Hernandez Gea博士、Feng Hong和Stephanie Gillespie博士的技术支持，感谢Vijay Shah博士慷慨捐赠TSEC细胞，感谢Inma Castilla de Cortázar博士的有益建议。
财务支持：在阿方索·马丁·埃斯库德罗基金会（给J.P）的资金支持下，德意志联邦基金会（DFG）（给Y.L.）和NIH（给S.L.F.）分别拨款DK56621和P20AA017067。
缩写词表
| 4-HNE公司 | 4-羟基-2-壬醛 |
| α-SMA | α-平滑肌肌动蛋白 |
| 全球现金流量 | 更昔洛韦 |
| GFAP公司 | 胶质纤维酸性蛋白 |
| HMGB1标准 | 高迁移率族蛋白B1 |
| HSC公司 | 肝星状细胞 |
| HSV-Tk型 | 单纯疱疹病毒胸苷激酶 |
工具书类
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