公共科学图书馆一号。2012; 7（12）：e51431。
白细胞介素1β介导的异氟醚诱导啮齿动物学习障碍
,1,2 ,1 ,1,2和1,2,*
林曹
1美利坚合众国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学麻醉学系
2中山大学中山纪念医院麻醉科，广东广州
辽辽李
1美利坚合众国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学麻醉学系
林道伟
1美利坚合众国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学麻醉学系
2中山大学中山纪念医院麻醉科，广东广州
左志毅
1美利坚合众国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学麻醉学系
2中山大学中山纪念医院麻醉科，广东广州
谢忠聪，编辑器
1美利坚合众国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学麻醉学系
2中山大学中山纪念医院麻醉科，广东广州
美国马萨诸塞州总医院
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
构思并设计了实验：LC LL ZZ。执行实验：LC LL DL。分析数据：LC LL DL ZZ。撰写论文：LC LL ZZ。
2012年9月4日收到；2012年11月1日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
摘要
术后认知功能下降是一种临床综合征。挥发性麻醉剂通常在手术中使用。可以想象，挥发性麻醉药可能会导致术后认知功能下降。异氟醚在一定条件下会损害动物的认知功能。然而，这种损害的机制尚不清楚。在这里，18个月大的雄性Fisher 344大鼠或10周大的小鼠暴露于1.2或1.4%的异氟醚2小时。我们的研究表明，异氟醚损害了Barnes迷宫中大鼠的认知功能。在恐惧条件反射测试中，暴露于异氟醚的大鼠在训练期间的冷冻行为有所减少。利多卡因（一种具有抗炎特性的局部麻醉剂）减弱了这种异氟醚效应。参加训练并在30分钟后暴露于异氟醚的大鼠，其冷冻行为与对照动物相似。异氟醚增加了18个月大鼠海马中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6和活化的胱天蛋白酶3的表达。IL-1β阳性染色与神经元标志物NeuN共定位。利多卡因可减弱IL-1β和活化caspase 3（而非白细胞介素-6）的增加。异氟醚还损害10周龄C57BL/6J小鼠的认知功能，并增加海马中的IL-1β。然而，异氟醚并不影响IL-1β缺陷小鼠的认知功能。我们的结果表明，异氟醚会损害学习，但可能不会影响老年大鼠的回忆。IL-1β可能在这种异氟醚效应中发挥重要作用。
介绍
在美国，每年有2000多万患者在全身麻醉下接受手术。其中大多数患者在手术期间使用挥发性麻醉药作为主要麻醉药[1]挥发性麻醉药之所以如此受欢迎，是因为这些麻醉药具有许多特点。例如，它们易于使用，具有多种药理作用，如麻醉、镇痛和肌肉放松，这些都是全身麻醉的组成部分。由于它们通常会很快从体内消除，因此人们认为它们的药物效应在消除后很快就会消失。然而，这一假设受到了许多证据的质疑。例如，我们已经证明，暴露于异氟醚（一种常用的挥发性麻醉剂）30分钟后，激活/磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶的表达会在许多天内发生变化[2],[3]此外，研究表明，挥发性麻醉剂在接触后许多天会影响啮齿动物的学习和记忆功能[3],[4]，这表明挥发性麻醉药可能在术后认知功能下降（POCD）的发展中发挥作用，POCD是一种公认的临床实体，已引起科学界和公众的高度关注[5].
POCD指的是术后神经心理测试表现不如术前所反映的认知能力下降。POCD患者的死亡率可能会增加[6],[7]提前离开劳动力市场的可能性更大[6]虽然大多数患者的POCD在几天或几周内消退，但在非心脏手术后3个月，约10%的老年患者（≥60岁）仍存在POCD[7],[8].年龄是这一中期POCD的风险因素[7],[8]然而，年轻人和老年人一样可能患有短期POCD，但可能不会发展为中期POCD[7].
众所周知，神经炎会损害认知功能[9],[10]最近的一项研究表明，神经炎症对全麻下胫骨开放性骨折固定术后成年幼鼠认知功能障碍的发展至关重要[11]然而，全麻诱导认知损伤的机制尚不清楚。我们和其他人已经表明，异氟烷增加了大鼠或小鼠大脑中细胞因子的产生[3],[12]因此，我们设计本研究以确定促炎性细胞因子，如白细胞介素1β（IL-1β），在异氟醚诱导的认知障碍中是否发挥重要作用。此外，我们还确定了异氟烷对学习和记忆功能的哪些过程产生影响。为了模拟临床情况，研究中使用了18个月大的成年早期大鼠。此外，年轻的成年野生型和IL-1β缺陷小鼠被用于促进机理研究，因为年轻的成年患者也可能患有POCD，18个月大的IL-1β缺乏小鼠无法立即获得。
结果
异氟醚暴露对18月龄大鼠认知功能的影响
无缺氧发作[定义为脉搏血氧饱和度（SpO）]2)异氟烷暴露期间<90%，异氟烷麻醉期间大鼠的血压与我们之前报道的对照大鼠相似[13]随着巴恩斯迷宫训练的增加，对照组和异氟醚暴露组18个月大鼠找到靶孔的时间缩短(). 训练课程对大鼠找到靶孔的潜伏期的影响非常显著（P<0.001），表明对照组和异氟醚暴露组大鼠能够获取和回忆所学信息。异氟醚对大鼠在训练期间发现靶孔的潜伏期的影响没有达到统计学意义（P=0.111）。然而，在训练后1天或8天，暴露于异氟醚的大鼠识别靶孔的潜伏期明显长于对照大鼠(). 与此结果一致，与对照大鼠相比，暴露于异氟醚的动物在确定靶孔之前搜索了更多的非靶孔(). 在情境和色调相关的恐惧条件反射测试中，暴露于异氟醚的大鼠的冷冻行为也显著低于对照动物(). 这些结果表明，接触异氟醚的大鼠有明显的认知障碍。
通过Barnes迷宫和恐惧条件反射测量异氟醚诱导的认知损伤。18个月大的Fisher 344大鼠暴露于或不暴露于1.2%异氟醚2小时。2周后，他们接受Barnes迷宫测试或27天后进行恐惧条件反射。A： 巴恩斯迷宫测试训练课的表现。训练课程对识别目标洞的潜伏期有显著影响（双向重复测量方差分析P<0.001）。B： 在训练后1天或8天确定目标洞的延迟。C： 训练后1天或8天确定目标洞之前搜索的其他洞数。D： 恐惧条件反射测试的表现。结果为平均值±S。D.（n=6）*经t检验，与B、C和D组的相应对照组相比，P<0.05。
异氟醚暴露会损害18月龄大鼠的学习，但不影响其回忆能力
为了确定学习和记忆功能的哪一个过程受到了异氟醚的影响，我们在恐惧条件反射阶段测定了每对三色调足部电击对（训练试验）后的间隔（1分钟）内的冻结行为。通过更多的训练试验，大鼠有更多的冷冻行为(). 这种效果非常显著（P<0.001）。训练试验前接触异氟醚显著降低了学习过程（P=0.002）。利多卡因的使用，一种具有抗炎作用的局部麻醉剂[14]，在我们之前的研究中，异氟烷暴露期间已显示可以减轻异氟烷诱导的认知损伤[13]这种利多卡因的使用也逆转了训练试验期间异氟醚诱导的冷冻行为（这种利多辛效应的P=0.003）(). 这些结果表明，异氟醚会损害学习过程，而利多卡因会减弱这种异氟醚效应。
通过恐惧条件反射测试测量异氟醚引起的学习障碍。A： 27天前，18个月大的Fisher 344只大鼠在有或无利多卡因的情况下暴露于异氟醚，在训练期间的冷冻行为。结果为平均值±S。D.（对照组和仅异氟醚组n=6，异氟醚+利多卡因组n=7）。训练试验（P<0.001，在对照动物和暴露于异氟醚加利多卡因的动物中）、异氟醚使用（P=0.002，对照动物与仅暴露于异氟醚的动物相比）和利多卡因使用（P=0.003，仅暴露于异氟醚的动物与暴露于异氟醚和利多卡因的动物）的冷冻行为。采用双向方差分析进行统计分析。B： 对18个月大的Fisher 344大鼠进行情境和语气相关恐惧条件测试时的冷冻行为，这些大鼠首次进行训练，并在训练后30分钟在利多卡因存在或不存在的情况下暴露于异氟烷。结果为平均值±S。D.（对照组n=4，仅异氟醚组和异氟醚+利多卡因组n=5）。
为了确定异氟醚是否影响学习/获得后的过程，大鼠首先接受三种色调的足部电击对。30分钟后，他们接触到异氟醚，并在接触异氟醚48小时后测量环境和色调相关的恐惧条件反射反应。在背景和色调相关恐惧条件反射测试中，对照组、暴露于异氟醚和暴露于异氟醚+利多卡因的动物的冷冻行为没有差异(). 这些结果表明，异氟醚可能不会影响这些动物对学习信息的回忆。
异氟醚暴露增加18月龄大鼠海马IL-1β、IL-6和活化Caspase 3的表达
暴露于异氟醚的动物在暴露后6 h海马中IL-1β和激活的caspase 3表达增加。利多卡因减弱了这种增加。三组大鼠海马和大脑皮层中肿瘤坏死因子α（TNFα）含量无显著差异(). 异氟醚暴露后6小时，海马和大脑皮层中的IL-6显著增加，且这种增加不受利多卡因的影响。小胶质细胞活化标志物分化簇11b（CD-11b）的表达[11]，未被异氟烷和利多卡因改变().
异氟醚对大鼠脑组织中白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）含量的影响。A和B：18个月大的Fisher 344大鼠在有或无利多卡因的情况下暴露于或不暴露于1.2%异氟醚2 h。麻醉暴露后6 h采集海马和大脑皮层，进行IL-1β或TNFα含量的ELISA检测。C组和D组：18个月大的Fisher 344大鼠接受了恐惧条件反射测试训练，30分钟后在有或无利多卡因的情况下暴露或不暴露于1.2%异氟醚2小时。麻醉暴露后48小时采集海马和大脑皮层，进行IL-1β或TNFα含量的ELISA检测。结果为平均值±S。D.（n=4）*与对照组相比P<0.05？与单独使用异氟醚相比，P<0.05。统计分析采用单因素方差分析。
异氟醚对大鼠脑组织中白细胞介素6（IL-6）、活化/裂解半胱天冬酶3和分化簇11b（CD-11b）表达的影响。18个月大的Fisher 344大鼠在有或无利多卡因的情况下暴露于或不暴露于1.2%异氟醚2小时。麻醉暴露后6小时采集海马和大脑皮层进行Western印迹。A： 典型的Western blot图像。B、 C和D：IL-6、裂解半胱天冬酶3和CD-11b蛋白丰度的图示，通过整合每种实验条件下4只大鼠的放射自显影体积进行量化。图表中的值表示为对照动物平均值的倍数变化，并表示为平均值±S。D.*与对照组相比，P<0.05？与单独使用异氟醚相比，P<0.05。统计分析采用单因素方差分析。C： 对照组，I：异氟醚，I+L：异氟烷加利多卡因。
与暴露异氟醚后6 h的变化模式类似，恐惧条件训练试验后48 h和暴露异氟烷后48 h大鼠海马中IL-1β和激活的caspase 3显著增加。利多卡因减弱了这种增加(和). 恐惧条件反射试验后48小时，海马和大脑皮层中IL-6的表达增加，然后暴露于异氟醚，这种增加不受利多卡因的影响。在此时间点，TNFα和CD-11b的表达也不受异氟醚和利多卡因暴露的影响(和).
异氟醚对大鼠脑组织中白细胞介素6（IL-6）、活化/裂解半胱天冬酶3和分化簇11b（CD-11b）表达的影响。18个月大的Fisher 344大鼠接受了恐惧条件反射训练，30分钟后在有或无利多卡因的情况下暴露或不暴露于1.2%异氟醚2小时。麻醉暴露后48小时采集海马和大脑皮层进行Western印迹。A： 典型的Western blot图像。B、 C和D：IL-6、裂解半胱天冬酶3和CD-11b蛋白丰度的图示，通过整合每种实验条件下4只大鼠的放射自显影体积进行量化。图表中的值表示为对照动物平均值的倍数变化，并表示为平均值±S。D.*与对照组相比，P<0.05？与单独使用异氟醚相比，P<0.05。统计分析采用单因素方差分析。C： 对照组，I：异氟醚，I+L：异氟烷加利多卡因。
IL-1β阳性染色与NeuN阳性染色共定位，NeuN是一种神经元标记物，但与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性染色、星形细胞标记物或小胶质细胞标记物电离钙结合适配器分子1（Iba1）似乎没有共定位(). 另一方面，IL-6或活性caspase 3的阳性染色与NeuN、GFAP和Iba1共定位(). 对照组和异氟醚暴露组大鼠齿状回中Iba1的密度分别为23±3和25±2（任意单位，n=4，经t检验P=0.482）。异氟醚暴露对18月龄大鼠神经元特异性蛋白的表达没有显著影响。
大鼠脑组织中白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6和活化/裂解半胱天冬酶3的表达。18个月大的Fisher 344大鼠暴露于或不暴露于1.2%异氟醚2小时。异氟醚暴露后48小时采集海马，对IL-1β（红色）、IL-6（红色）、裂解的胱天蛋白酶3（红色）、NeuN（绿色）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP，绿色）进行免疫荧光染色和电离钙结合适配器分子1（Iba1，绿色）。合并的面板还包括Hoechst染色（蓝色）以显示细胞核。A： IL-1β与GFAP、Iba1和NeuN的联合染色。B： IL-6与GFAP、Iba1和NeuN的联合染色。C： 裂解caspase 3与GFAP、Iba1和NeuN共染色。反对：对照，异氟烷。
NeuN（一种神经元特异性蛋白）、drebrin（一种树突棘蛋白）和突触素（一种突触蛋白）的表达没有差异在对照大鼠或进行恐惧条件训练试验的大鼠的海马和大脑皮层中，然后在采集组织进行Western印迹前48小时在利多卡因存在或不存在的情况下暴露于异氟烷().
异氟醚对大鼠脑组织中NeuN、drebrin和突触素表达的影响。18个月大的Fisher 344大鼠接受了恐惧条件反射训练，30分钟后在有或无利多卡因的情况下暴露或不暴露于1.2%异氟醚2小时。麻醉暴露后48小时采集海马和大脑皮层进行Western印迹。A： 典型的Western blot图像。B、 C和D：通过整合每种实验条件下4只大鼠的放射自显影体积来量化NeuN、drebrin和突触素蛋白丰度的图示。图表中的值表示为对照动物平均值的倍数变化，并表示为平均值±S。D.C：对照，I：异氟醚，I+L：异氟烷加利多卡因。
异氟醚暴露增加了野生型小鼠IL-1β的表达并损害了其认知功能，但不影响IL-1β缺乏小鼠的认知功能
与插管和机械通气以维持正常潮气末CO的大鼠不同2在异氟烷暴露期间，小鼠在暴露期间自发呼吸。一个担忧是，异氟醚会导致严重的呼吸抑制，从而导致CO2在这些小鼠中积累。在异氟烷暴露2小时后，从小鼠左心采集的血液样本显示pH值、PCO2和采购订单2为7.325±0.037，PCO246.5±0.9 mmHg和PO2分别为224±49 mmHg（n=4）。这些pH值和PCO2值几乎与正常成年幼鼠或未使用全身麻醉的幼鼠的值相同[15],[16].
异氟醚在暴露后6 h显著增加年轻成年小鼠海马中的IL-1β（对照组和异氟醚暴露组小鼠脑组织蛋白分别为4.6±0.3和5.1±0.6 pg/mg，对照组n=8，异氟醚接触组n=7，t检验P=0.048）。在恐惧条件训练试验前48小时暴露于异氟烷的小鼠在上下文和语气相关的恐惧条件测试中的冷冻行为较少。这种异氟醚效应在IL-1β缺乏小鼠中不存在()表明IL-1β在异氟醚效应中发挥作用。
异氟烷对认知功能的影响通过恐惧条件反射进行评估。将10周龄雄性C57BL/6J（野生型）小鼠或白细胞介素1β（IL-1β）缺陷小鼠暴露于1.4%异氟醚2 h，48 h后进行恐惧条件反射试验。结果为平均值±S。D.（野生型小鼠n=15，IL-1β缺乏小鼠n=6）*与相应对照组相比，P<0.05。#与野生型对照小鼠相比，P<0.05。采用t检验进行统计分析。
讨论
我们在这里显示，如果18个月大的大鼠之前接触1.2%异氟醚2小时，则被认为处于老年早期或中年晚期的大鼠的认知能力较差，通过巴恩斯迷宫和恐惧条件反射测试进行评估。大鼠中异氟醚的一个最小肺泡浓度（50%的动物对疼痛刺激没有运动反应的浓度）为～1.5%[17]许多手术通常需要2小时以上才能完成。因此，我们的结果表明，以临床相关方式使用异氟醚会损害大鼠的认知功能。这一发现与我们之前的报告和其他人的报告一致[3],[4],[13]我们研究的一项新发现是，异氟醚可能会损害学习/获得，但可能不会影响所学信息的回忆。学习和记忆功能需要各种过程，包括获得、巩固和回忆。我们的结果表明，在恐惧条件反射训练期间，预先接触异氟醚可以减少大鼠的冷冻行为。利多卡因阻断了这种异氟醚效应，利多卡因是一种局部麻醉剂，在我们之前的研究中，它可以减弱异氟醚诱导的大鼠认知功能[13]另一方面，如果他们先进行训练，然后只暴露于异氟醚、异氟醚加利多卡因或氧气，那么在情境和色调相关的恐惧条件作用下，冻结行为没有差异。这些结果表明，异氟醚不会影响所获得信息的回忆。
我们研究的一个重要且新颖的发现是，IL-1β可能在异氟醚诱导的认知障碍中发挥关键作用。挥发性麻醉剂已被证明会损害动物的认知功能[3],[4],[13]尽管在动物研究中，尤其是使用成年幼年动物时，这些麻醉药对认知功能没有影响或改善的报道[4],[17],[18],[19]在接触挥发性麻醉剂后的急性期，观察到大脑中caspase 3激活和淀粉样β生成增加[20]然而，目前尚不清楚这些大脑变化是否会导致麻醉暴露后的认知功能障碍。我们已经证明，当大鼠暴露于异氟醚后出现明显的认知障碍时，其大脑中淀粉样β的含量并没有增加[13]提示β淀粉样蛋白在认知功能障碍中可能不起重要作用。我们在这里显示，异氟醚增加了IL-1β，利多卡因减弱了这种增加以及异氟醚诱导的18个月大鼠认知功能障碍。与之前的研究类似[21]，在我们的研究中，异氟烷也损害了野生型年轻成年小鼠的认知功能。此外，异氟醚增加了海马中的IL-1β。然而，异氟醚并不影响IL-1β缺陷小鼠的认知功能。这些结果强烈表明IL-1β在异氟醚诱导的认知障碍中起着关键作用。与我们的研究结果一致，最近的一项研究表明，在全麻下对年轻成年小鼠进行开放性胫骨骨折固定术后，认知功能障碍由IL-1β介导[11]然而，该研究并没有表明单独全身麻醉（2.1%异氟醚20分钟+0.1 mg/kg丁丙诺啡）会影响年轻成年小鼠的认知功能，这与我们的结果和先前研究的结果不同[21]此外，同样的研究也没有显示单独麻醉会增加小鼠大脑中的IL-1β。最近的一项研究表明，2.1%异氟醚15分钟加上0.1 mg/kg丁丙诺啡不会影响海马依赖性记忆，但会损害年轻成年小鼠的远端新皮质依赖性记忆[22]研究结果不同的原因尚不清楚。然而，之前的研究没有显示麻醉剂对认知和大脑中IL-1β水平的影响，因此使用的异氟醚暴露时间比我们短得多。短时间接触可能不足以引起这些大脑变化。此外，用于测试动物的不同学习和记忆范式可能有助于研究中的不同发现。
除IL-1β外，异氟醚还增加了大脑中的IL-6。IL-6是一种促炎和抗炎细胞因子[23],[24]IL-6增加与人类认知能力下降相关[25],[26]可以想象，IL-6在异氟烷诱导的大鼠认知功能障碍中发挥作用。然而，利多卡因减轻了异氟烷诱导的认知功能障碍，但没有改变异氟烷导致的IL-6升高。此外，异氟醚不会对IL-1β缺陷小鼠的学习和记忆造成损害。这些结果表明，IL-6在异氟醚诱导的认知障碍中可能没有发挥主要作用。在本研究中，我们没有观察到促炎细胞因子TNFα的变化[10]异氟醚暴露后6和48小时。可能需要在其他时间点测量TNFα，以确定异氟醚对TNFα表达的影响以及TNFα在异氟醚诱导的认知障碍中的作用。
IL-1β是一种促炎细胞因子[11]在大脑中暴露于异氟烷后，其增加表明神经炎症。然而，CD-11b和Iba1的表达是反应性小胶质细胞的指标[11]，在接触异氟醚后没有显著变化。与我们的发现一致，之前的一项研究表明，通过免疫组织化学方法评估，异氟醚不会改变小鼠脑中CD-11b的表达[11]这些发现表明，暴露于异氟醚后，促炎性细胞因子的少量增加可能不会导致CD-11b或Iba1表达评估的显著神经炎症。
我们观察到，暴露于异氟醚后，大鼠海马中裂解/激活的caspase 3显著增加。利多卡因减弱了这种增加。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活可能是细胞凋亡的生物标志物[27],[28]我们的结果并不表明异氟醚会导致显著的神经元死亡，因为在异氟醚暴露48小时后，neuN、drebrin和突触素的表达没有显著变化。此外，我们之前的研究表明，在暴露后29天，异氟醚没有改变18个月大鼠海马神经元密度和海马放射层突触密度[13]总之，这些结果表明，接触异氟醚可能不会显著改变海马的神经结构。
我们的免疫组织化学结果表明，IL-1β可能来自神经元，IL-6和活化的caspase 3在对照大鼠海马的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中表达。细胞因子的这种细胞类型特异性分布不受异氟醚的影响。与我们的结果一致，小鼠大脑皮层中的TNFα主要存在于神经元中，但不存在于星形胶质细胞中[12].
我们之前的研究表明，2小时的异氟醚暴露会损害老年大鼠的认知功能，而利多卡因可以减轻这种损害。然后我们发现，在异氟醚暴露29天后，大脑中没有观察到显著的生化或结构变化[13]在这项研究中，我们提供了异氟烷导致大脑中促炎细胞因子增加的数据。使用利多卡因作为工具，我们的数据还表明，在当前实验条件下，异氟醚诱导的认知损伤可能主要发生在学习过程中，并且这种损伤可能由IL-1β介导。这些新发现为轻度神经炎症导致异氟醚诱导的认知障碍的假说提供了证据。
我们目前的研究表明，利多卡因可减轻异氟醚诱导的认知障碍，并增加海马IL-1β和激活的caspase 3水平。利多卡因可抑制核因子κB信号传导，从而减少促炎细胞因子的产生[29]我们的结果清楚地表明利多卡因对大脑的影响。利多卡因可以利用运输系统穿透血脑屏障进入大脑[30]此外，外周巨噬细胞进入大脑可诱导大脑产生IL-1β[31]由于利多卡因具有抑制炎症细胞（包括巨噬细胞）活动的能力[32]利多卡因可能通过其对周围组织/细胞的影响而对大脑产生本研究中观察到的影响。利多卡因的消除半衰期相对较短（～90分钟）。在这里，我们观察到，与只暴露于异氟醚的大鼠相比，应用异氟醚和利多卡因后数周，大鼠的认知能力有所改善。这一现象可能是由于在早期阶段抑制了异氟烷的有害影响，因此不会发生导致延迟性认知功能障碍的后续事件。活性利多卡因代谢物，如单乙基甘氨酰亚胺，其半衰期比利多卡因长，也可能导致这种现象。
我们观察到，在对照条件下，IL-1β缺陷小鼠比野生型小鼠具有更好的音调相关学习和记忆。这一发现与我们的建议一致，即IL-1β增加是异氟烷诱导认知障碍的关键步骤。同样，IL-1β被认为是年龄依赖性认知障碍的调节剂[33].
我们在这里表明，异氟醚导致大鼠和小鼠的认知障碍。人们必须非常谨慎地将这些发现推断给人类，因为可能存在对异氟醚反应的显著物种差异。此外，大多数患者因手术而接受麻醉，尽管有些患者可能在没有手术的情况下接受全身麻醉（例如，全身麻醉下的放射学图像研究）。在有或无应激刺激（如手术）的情况下，细胞或生物体的麻醉效果可能不同。需要进一步研究以确定麻醉剂/麻醉剂和手术之间的相互作用及其对POCD发展的贡献。
总之，我们的研究表明，异氟烷损害了老年大鼠的获取/学习，但不影响它们对学习信息的回忆。这种异氟醚效应可能由IL-1β介导。利多卡因可通过抑制轻度脑炎症的早期阶段，减轻异氟烷暴露后老年大鼠的长期认知损伤。
材料和方法
该动物方案由弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准（弗吉尼亚州夏洛茨维尔；方案编号3114）。所有动物实验均按照1996年修订的《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》（NIH出版物编号80-23）进行。
动物
18个月大的雄性Fisher 344只大鼠，体重470-550克，来自美国国立卫生研究院（马里兰州贝塞斯达）。10周龄雄性C57BL/6J小鼠（库存号000664）和IL-1β缺陷小鼠（库存编号005576）来自Jackson Laboratories（ME Bar Harbor）。这些IL-1β缺陷小鼠的基因背景与C57BL/6J小鼠相似。
异氟烷暴露
如前所述，大鼠暴露于异氟醚[34]简单地说，麻醉是通过将大鼠置于含3%异氟醚的氧气室中诱导的。然后用14号导管对他们进行插管，并用100%氧载异氟醚进行机械通气2保持潮气末异氟醚浓度在1.2%。使用DatexTM红外分析仪（芬兰赫尔辛基Capnomac）连续监测吸入和呼出气体浓度。呼吸机的设置通常如下：潮气量和呼吸频率为2 ml，每分钟60次。调整这些设置以保持潮气末CO2约32毫米汞柱。直肠温度维持在37°C±0.5°C。心率和SpO2在麻醉期间使用MouseOx™脉搏血氧计（马萨诸塞州霍利斯顿哈佛仪器公司）连续测量。使用CODA监测仪（康涅狄格州托林顿肯特科学公司）测量无创血压。在异氟烷暴露2小时后，停止使用异氟烷。大鼠反应时拔管。在一个充满100%O气体的室内回收20分钟2并在37°C的温度下，将其放置在家中的笼子中。
将小鼠置于一个用1.4%异氟醚在氧气中充气2小时的小室中，使其接触到异氟醚。将小室的一部分浸入37°C的水浴中。MouseOx™脉搏血氧计也对动物进行监测，以确保其血氧饱和度2异氟醚暴露期间>96%。在异氟烷暴露结束时，用4只动物从左心采集血液进行血气分析。其他动物被放回了自己的笼子。
由于异氟醚由100%O携带2，对照组中的大鼠或小鼠被保存在用100%O充气的腔室中2持续2小时。
利多卡因对大鼠的应用
异氟醚加利多卡因组的动物通过尾静脉接受利多卡因。和我们以前一样[13]在异氟烷暴露2h期间，静脉注射利多卡因，剂量为1.5mg/kg，然后为2mg/kg/h。利多卡因以8 mg/ml的速度溶于生理盐水中。只给异氟醚组大鼠等量的生理盐水。
巴恩斯迷宫
在异氟烷暴露两周后，以与我们之前描述的相同的方式对动物进行巴恩斯迷宫[13]测试他们的空间学习和记忆。巴恩斯迷宫是一个圆形平台，有20个等间距的洞（加州圣地亚哥SD Instruments）。一个洞连接到一个称为靶盒的暗室。每次，动物都被放置在平台的中间，并通过平台上的厌恶噪音（85 dB）和强光（200 W）来鼓励它们找到目标盒。他们经历了一个空间获取阶段，包括4天的训练，每天2次试验，每次试验3分钟，每次试验之间15分钟。在第5天（短期记忆）和第12天（长期记忆）测试动物的参考记忆。这两天各进行一次试验。从第5天到第12天，大鼠未接受任何测试。在ANY-Maze视频跟踪系统（SD Instruments）的帮助下，记录每次试验中找到目标盒的延迟时间和错误次数。
恐惧调节
大鼠或小鼠在不同时间接受与异氟醚暴露相关的恐惧条件反射测试，以测试其非费力依赖性学习和记忆[35]。正如我们之前所描述的[13]，将每只动物置于一个用70%酒精擦拭过的试验室中，并进行3次足部电击配对（音调：2000 Hz，85 db，30 s；足部电震：1 mA，2 s），间隔1 min，置于相对黑暗的房间中（训练课）。条件反射训练30秒后，动物回到家中的笼子，24小时后，在没有紧张和休克的情况下，将其放回房间8分钟（大鼠）或6分钟（小鼠）。在8 s（大鼠）或6 s（小鼠）间隔内记录冷冻行为的时间量。2小时后，将动物置于环境和气味与第一个试验室不同的试验室中，并置于相对较轻的房间中。在没有听觉条件刺激的情况下，记录3分钟的冷冻行为。然后开启听觉刺激3个周期，每个周期持续30秒，然后间隔1分钟（共4.5分钟）。记录了这4.5分钟内的冻结行为。视频中记录的冻结行为由一名对小组分配一无所知的观察者进行评估。这些实验测试海马依赖性（上下文相关）和海马非依赖性（音调相关）的学习和记忆功能[35].
脑组织收获
暴露异氟醚6小时后，用异氟醚对大鼠进行深度麻醉，并用生理盐水经心灌注。立即解剖右侧海马和皮层，进行各种蛋白质的Western印迹。取左侧海马和皮层进行IL-1β和TNFα的酶联免疫吸附试验（ELISA）。
同样，在异氟醚暴露6小时后，采集野生型小鼠的海马，进行IL-1β的ELISA检测。
在第三个实验中，大鼠首先进行了恐惧条件反射测试的训练。30分钟后，他们接受了异氟烷暴露。在异氟醚暴露48小时后采集海马和大脑皮层，进行IL-1β和TNFα的ELISA检测，以及各种蛋白质的Western blotting检测。
西方印迹法
将脑组织在含有蛋白酶抑制剂混合物（目录号：P2714；Sigma，St Louis，MO）和蛋白酶抑制剂混合物（目录号：1697498；Roche Applied Science，Indianapolis，in）的RIPA缓冲液（目录号：89900；Thermo Scientific，Worcester，MA）中匀浆。将匀浆在4°C下13000 g离心20 min。保存上清液并通过Bradford分析测定其蛋白质浓度。
在聚丙烯酰胺凝胶上分离每道50微克蛋白质，然后将其印在聚偏二氟乙烯膜上。用无蛋白T20封闭缓冲液（目录号：37573，Lot LB141635；Thermo Scientific，Waltham，MA）封闭膜，并与以下主要抗体孵育：兔多克隆抗突触素抗体（1∶1000；目录号：4329；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA），小鼠单克隆抗drebrin抗体（1∶1000；目录号：ab12350；Abcam，Cambridge，MA），小鼠单克隆抗体NeuN，克隆抗体A06（1∶500；目录号；MAB377；Millipore Cor.Billerica，MA）、兔多克隆抗裂解caspase-3抗体（1：1000；目录编号：9664；Cell Signaling Technology，Inc.），兔多克隆抗CD-11b（1∶500；目录号：ab75476；Abcam）、兔多克隆抗白细胞介素-6（1∶500:目录号：ab6672；Abcam:）和兔多克隆β-肌动蛋白多克隆抗体（1∶2000；目录号为A2228；Sigma）。使用适当的二级抗体。使用Syngene（Frederick，MD）的基因组和蛋白质组凝胶文档（Gel-Doc）系统可视化蛋白质带。将NeuN、裂解casase 3、CD-11b、IL-6、突触素和drebrin的蛋白带强度归一化为来自同一样品的相应β-肌动蛋白带强度，以减少加载误差。然后，通过相应对照动物的平均值对动物在各种实验条件下的结果进行归一化。
IL-1β和TNFα的定量
将脑组织在含有蛋白酶抑制剂（10µg/ml抑肽酶、5µg/ml胃蛋白酶、5μg/ml亮氨酸蛋白酶和1 mM苯甲烷磺酰基氟化物）的20 mM Tris–HCl缓冲液（pH=7.3）中在冰上均质。在4°C下以13000 g离心20 min。保存上清液，并对每个样品进行上清液的Bradford蛋白分析。根据制造商的说明，使用用于测量大鼠IL-1β和TNFα的ELISA试剂盒（产品编号分别为DY501和RTA00；明尼阿波利斯R&D Systems公司）量化样品中这些细胞因子的含量。将每个脑样本中IL-1β和TNFα的数量标准化为蛋白质含量。
免疫组织化学
大脑切片免疫荧光染色的组织制备如我们之前所述[36]简单地说，在异氟醚暴露48小时后，用异氟醚对18个月大鼠进行深度麻醉，然后用生理盐水和4%磷酸盐缓冲多聚甲醛经心灌注。收集大脑，并将其保存在相同的固定液中24小时。用切片机在bregma−3.80 mm处切割5微米厚的石蜡冠状切片。在含有0.05%吐温-20的Tris碱/乙二胺四乙酸（Tris/EDTA）缓冲液（pH=9.0）中，通过微波加热20分钟进行抗原回收。切片在Tris缓冲盐水（TBS）加0.025%triton-X 100中清洗。然后在室温下用10%驴血清和1%牛血清白蛋白在TBS中封闭2小时。所用的主要抗体为：兔多克隆抗IL-6抗体（1∶200；目录号：ab6672；Abcam）、兔抗裂解caspase-3抗体（1比400；目录号9664；细胞信号技术）、兔多克隆抗体（1：50；目录编号：sc-7884；Santa Cruz Biotechnology）、，小鼠单克隆抗GFAP抗体（1∶500；目录号：MAB360；Millipore）、小鼠单克隆抗体抗Iba1抗体（1：100；目录编号：ab15690；Abcam）和小鼠单克隆对抗NeuN抗体（1比500；目录号码：MAB377；Millipore）。在4°C下与一级抗体孵育过夜后，用0.025%的triton-X 100在TBS中清洗切片。将与荧光染料NL493偶联的驴抗小鼠IgG（H+L）抗体（1∶200；目录号：NL009；R&D Systems）和与荧光染料NL557偶联的驴抗兔IgG（H+L）抗体（1∶200；目录号：NL004；R&D Systems）在室温下施用1h。在TBS中清洗后，在Vectashide安装介质（目录号：H-1000；Vector labs，加利福尼亚州伯灵盖姆）的帮助下安装节段并盖住。图像由带有CCD相机的荧光显微镜采集。用Image J软件测量齿状回区Iba1染色的荧光强度。对海马体两侧齿状回中随机选择的7-12个区域的密度进行平均，以反映每只大鼠的值。该量化由一名对动物分组不了解的人员进行。
统计分析
结果以平均值±S表示。D.（n≥4）。通过双向（异氟烷与非异氟烷暴露）重复测量方差分析，然后进行Student-Newman-Keuls测试，对Barnes迷宫训练课和恐惧条件反射测试的结果进行分析。其他结果通过双向方差分析进行检验，通过单向方差分析，在确认数据呈正态分布后进行Student-Newman-Keuls检验，通过Kruskal-Wallis等级方差分析，然后在数据非正态分布时进行Student-Newman-Geuls检验，或根据情况通过学生t测试。P≤0.05被认为是显著的。所有统计分析均使用SigmaStat（Systat Software，Inc.，Point Richmond，CA，USA）进行。
致谢
这项研究工作是在美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔市弗吉尼亚大学麻醉学系进行的，应归于该系。
资金筹措表
这项研究得到了马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的资助（R01 GM065211 to ZZ），俄亥俄州克利夫兰国际麻醉研究协会的资助（2007年麻醉研究前沿奖授予ZZ），美国心脏协会大西洋中部附属机构的资助（10GRNT3900019 to ZZ），马里兰州巴尔的摩和弗吉尼亚大学罗伯特·爱泼斯坦教授基金会。资助机构在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
1.Silva AC、ORyan F、Poor DB（2006年）正颌外科术后恶心呕吐的回顾性研究及文献综述.口腔颌面外科杂志
64: 1385–1397. [公共医学][谷歌学者] 2郑S，左Z（2004）异氟醚预处理通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶诱导缺血神经保护.分子药理学
65: 1172–1180. [公共医学][谷歌学者] 三。林德左（2011）异氟醚诱导成年大鼠海马细胞损伤和认知功能障碍.神经药理学
61: 1354–1359.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Culley DJ、Baxter M、Yukhananov R、Crosby G（2003）全麻对年轻和老年大鼠的记忆影响持续数周.麻醉与镇痛
96: 1004–1009. [公共医学][谷歌学者] 5Baranov D、Bickler PE、Crosby GJ、Culley DJ、Eckenhoff MF等人（2009年）共识声明：第一届麻醉剂与阿尔茨海默病国际研讨会.麻醉与镇痛
108: 1627–1630.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Steinmetz J、Christensen KB、Lund T、Lohse N、Rasmussen LS（2009）术后认知功能障碍的长期后果.麻醉学
110: 548–555. [公共医学][谷歌学者] 7Monk TG、Weldon BC、Garvan CW、Dede DE、van der Aa MT等（2008）重大非心脏手术后认知功能障碍的预测因素.麻醉学
108: 18–30. [公共医学][谷歌学者] 8Moller JT、Cluitmans P、Rasmussen LS、Houx P、拉斯穆森H等人（1998年）老年ISPOCD1患者术后长期认知功能障碍的研究。ISPOCD调查员。术后认知功能障碍的国际研究.柳叶刀
351: 857–861. [公共医学][谷歌学者] 9Sanderson DJ、Cunningham C、Deacon RM、Bannerman DM、Perry VH等（2009年）亚热原性全身炎症和海马损伤对学习的影响之间的双重分离.行为大脑研究
201: 103–111. [公共医学][谷歌学者] 10Terrando N、Monaco C、Ma D、Foxwell BM、Feldmann M等人（2010年）肿瘤坏死因子α触发细胞因子级联，导致术后认知功能下降.美国国家科学院程序
107: 20518–20522.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Cibelli M、Fidalgo AR、Terrando N、Ma D、Monaco C等人（2010年）白细胞介素-1β在术后认知功能障碍中的作用.神经病学年鉴
68: 360–368.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Wu X、Lu Y、Dong Y、Zhang G、ZhangY等（2012）吸入麻醉剂异氟醚增加促炎性TNF-α、IL-6和IL-1β的水平.神经生物老化
33: 1364–1378.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13林德、曹立、王Z、李杰、华盛顿JM等（2012）利多卡因减轻老年大鼠异氟烷麻醉后的认知功能障碍.行为大脑研究
228: 319–327.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14加拉加斯HC、Maciel JV、Martins PM、de Souza MM、Maia LC（2009）利多卡因作为抗炎物质的应用：系统综述.J凹痕
37: 93–97. [公共医学][谷歌学者] 15赵鹏，左Z（2004）异氟醚预处理诱导新生大鼠神经保护，该保护依赖于诱导型一氧化氮合酶.麻醉学
101: 695–702. [公共医学][谷歌学者] 16Zhou Z、Kozlowski J、Schuster DP（2005）小鼠急性肺损伤的生理生化和影像学特征.美国呼吸急救医学杂志
172: 344–351.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Stratmann G、Sall JW、Bell JS、Alvi RS、May LV等人（2010年）异氟醚不影响老年大鼠的脑细胞死亡、海马神经发生或长期神经认知结果.麻醉学
112: 305–315.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18小松H、野谷佳彦J、阿纳布基D、横野洋子S、基诺西塔H等人（1993年）训练后暴露于氟烷、安氟醚和异氟醚对ddN小鼠记忆的促进作用.麻醉与镇痛
76: 609–612. [公共医学][谷歌学者] 19Rammes G、Starker LK、Hasender R、Berkmann J、Plack A等人（2009年）异氟醚麻醉通过上调NMDA受体2B亚单位的表达可逆地改善认知功能和长期增强（LTP）.神经药理学
56: 626–636. [公共医学][谷歌学者] 20谢Z、卡利DJ、董毅、张庚、张斌等（2008）普通吸入麻醉剂异氟醚诱导体内caspase活化并增加淀粉样β蛋白水平.神经病学年鉴
64: 618–627.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Vizcaychipi议员，Xu L，Barreto GE，Ma D，Maze M等（2011）热休克蛋白72过表达防止小鼠全麻下骨科手术后早期记忆下降.麻醉学
114: 891–900.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Fidalgo AR、Cibelli M、White JP、Nagy I、Wan Y等人（2012年）异氟醚可导致小鼠新皮质记忆损伤，但不会导致海马依赖性记忆损伤.麻醉扫描学报
56: 1052–1057. [公共医学][谷歌学者] 23Scheller J、Chalaris A、Schmidt-Arras D、Rose-John S（2011）细胞因子白细胞介素-6的促炎和抗炎特性.Biochim生物物理学报
1813: 878–888. [公共医学][谷歌学者] 24Xing Z、Gauldie J、Cox G、Baumann H、Jordana M等（1998）IL-6是控制局部或全身急性炎症反应所需的抗炎细胞因子.临床研究杂志
101: 311–320.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Wright CB、Sacco RL、Rundek TR、Delman JB、Rabbani LE等人（2006）白细胞介素-6与认知功能相关：北曼哈顿研究.中风脑血管病杂志
15: 34–38.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Weaver JD、Huang MH、Albert M、Harris T、Rowe JW等（2002）白细胞介素-6与认知能力下降的风险：麦克阿瑟成功老龄化研究.神经病学
59: 371–378. [公共医学][谷歌学者] 27谢Z、董毅、前田U、莫尔路、夏伟等（2007）吸入麻醉剂异氟醚诱导细胞凋亡和淀粉样β蛋白蓄积的恶性循环.神经科学
27: 1247–1254.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28李磊、彭磊、左Z（2008）异氟醚预处理增加大鼠脑缺血半影线粒体B细胞淋巴瘤-2的表达并减少细胞色素c的释放.欧洲药理学杂志
586: 106–113.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Lahat A、Ben-Horin S、Lang A、Fudim E、Picard O等（2008）利多卡因下调核因子-κB信号转导并抑制细胞因子产生和T细胞增殖.临床实验免疫学
152: 320–327.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Pardridge WM、Sakiyama R、Fierer G（1983年）普萘洛尔和利多卡因通过大鼠血脑屏障的转运：球蛋白结合药物的主要作用.临床研究杂志
71: 900–908.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Terrando N、Eriksson LI、Ryu JK、Yang T、Monaco C等（2011）解决术后神经炎症和认知能力下降.神经病学年鉴
70: 986–995.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Dickstein RA、Kiremidjan-Schumacher L、Stotzky G（1984）利多卡因对迁移抑制因子产生和巨噬细胞运动的影响：豚鼠淋巴细胞和巨噬细胞的体外暴露.白细胞生物学杂志
36: 621–632. [公共医学][谷歌学者] 33.林奇文学硕士（1998）海马长期增强中的年龄相关损伤：细胞因子白细胞介素-1β的作用？
神经生物进展
56: 571–589. [公共医学][谷歌学者] 34Lee JJ、Li L、Jung HH、Zuo Z（2008）异氟醚后处理减轻大鼠缺血诱导的脑损伤.麻醉学
108: 1055–1062.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Kim JJ，Fanselow MS（1992年）模式特异性逆行性恐惧健忘症.科学类
256: 675–677. [公共医学][谷歌学者] 36李杰、邓杰、盛伟、左Z（2012）二甲双胍减轻肥胖、瘦素抵抗小鼠的阿尔茨海默病样神经病理学.药物生物化学行为
101: 564–574.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
