成人胰腺需要PERK，对维持葡萄糖平衡至关重要

胰岛素分泌与胞浆钙²⁺孤立胰岛的测量。

胰岛分离、融合和胞浆钙（[Ca²⁺]_我)前面描述了测量(27,28). 简而言之，通过胶原酶消化从每个基因型的2或3只小鼠中分离出胰岛，并在RPMI 1640培养基（Sigma）中与10 mM葡萄糖培养3至4天。将胰岛以1 ml/min的流速在含有0.25%牛血清白蛋白（BSA）的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRBB）中包绕。用放射免疫法测定胰岛素。[加利福尼亚州²⁺]_我使用蔡司AxioVision系统通过双波长荧光显微镜进行测量。

免疫组织化学、BrdU掺入和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）分析。

处死小鼠，采集组织并将其固定在4%多聚甲醛中12至16小时。组织用PBS清洗，在梯度乙醇中脱水，并包埋在石蜡中。组织切片（5μm）使用针对以下各项的主要抗体进行免疫染色：胰岛素（Invitrogen）、胰岛素原（Ole D.Madsen，Beta Cell Biology Consortium）、谷氨酸（Millipore）、谷氨酰胺（Abcam）、溴脱氧尿苷（BrdU）（Rockland）和载脂蛋白E（Abcam）。石蜡包埋组织切片与抗BrdU抗体孵育。在一级抗体孵育后应用标记有Cy2、Cy3或Cy5的二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）。用4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Promega）进行核染色。

用含1 mg/ml BrdU（Sigma）的瓶子代替饮用水，连续1或2周，用BrdU标记小鼠。进行免疫染色，并使用哈马松Orca ER数码相机拍摄显微照片。

使用Cy5标记试剂（Roche）对再水化和胰蛋白酶消化的胰腺切片进行TUNEL。随后根据上述描述对切片进行胰岛素和适当二级抗体染色。

qPCR。

按照制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen）从纯化的小鼠胰岛提取总RNA。根据制造商的协议，使用Moloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶III和随机引物（Invitrogen）合成cDNA。通过使用Sybr PCR混合物（Applied Biosystems）和ABI Prism 7000序列检测系统（AppliedBiosystes）进行扩增，并使用以下引物进行定量实时PCR（qPCR）检测：Bip（F），5′-ACCTTACTCGGGCCAAATT-3′；Bip（R），5′-AGAGCGGAACAGGTCCATGT-3′；组94（F），5′-CTGGGTCAAGCAAAGGAG-3′；Grp94（R），5′-TTCTCTGTTGCTTCCCGACTT-3′；EDEM（F），5′-TTCCAGCCTTTGAAAACACC-3′；EDEM（R），5′-TGCTGCAGGAGGAAACACCT-3′；CHOP（F），5′-CCACACAGAGGTCACACGCAC-3′；CHOP（R），5′-TGACTGGAATCTGGAGAGCGA-3′；Der1（F），5′-CACACAGCCATGCTAAGCAGA-3′；Der1（R），5′-TCAGTTGGGTCAGGTCCAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（F），5′-GGAGCGAGACCCCACTAACA-3′；和GAPDH（R），5′-ACATACTCAGCACCGGCCTC-3′。

西方分析。

在含有50 mM HEPES（pH 8.0）、150 mM NaCl、2.5 mM EGTA、1 mM EDTA、0.1%Tween 20以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1 mM苯甲基磺酰氟、20 U抑肽酶/ml、5 mg亮氨酸肽/ml、1 mM-二硫苏糖醇[DTT]）的吐温20缓冲液中对每个基因型3至5只小鼠纯化的胰岛进行裂解、0.4 mM NaF和10 mMβ-甘油磷酸）。在通过4°C离心30分钟进行清理之前，对裂解液进行超声波处理。通过双钦尼克酸（BCA）分析测定裂解液蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE对蛋白质进行分解，转移到硝化纤维素膜上，然后进行免疫印迹。使用的抗体包括抗p-eIF2α（S51）、Bip、eIF2 a（Invitrogen）、cyclin D1小鼠单克隆D1-72-13G、ATF6（Abcam）、XBP1（Santa Cruz）、Cul4a（Bethyl）、Ire1α（Cell Signaling）、β-肌动蛋白（Sigma）和p-JNK抗体的抗体，这些抗体来自Cell Signoling Corp。

急性PERK切除可引发糖尿病。

为满足成年小鼠、8周龄和6个月龄Cre-ERT2在维持葡萄糖稳态方面对PERK的任何要求；PERK公司^升/升对照组小鼠接受TAM治疗，并保持正常饮食；随后定期监测血糖水平(图1D和​和2A）。2安培). 无论切除年龄，PERK^Δ/Δ小鼠术后1个月出现中度高血糖（～200mg/dl），2个月内出现严重高血糖（>500～600mg/dl）。葡萄糖耐量试验（GTT）显示PERK无能力^Δ/Δ小鼠调节血糖水平(图1E); 敲除小鼠也表现出对葡萄糖挑战的胰岛素分泌减少(图1F). 关键是，我们注意到PERK^+/Δ小鼠在喂食状态下血糖正常，在GTT中反应正常(图1E)尽管与PERK野生型（WT）小鼠相比，激发后胰岛素分泌减少(图1F). 我们还注意到，与年龄匹配的对照组相比，PERK缺乏小鼠的血浆胰岛素水平显著降低，而PERK与PERK之间没有显著差异^+/Δ观察到野生型小鼠（参见补充材料中的图S1B）。此外，胰岛素耐受试验（ITT）显示，急性PERK切除并没有消除外周组织中的胰岛素敏感性（见图S1C），这表明糖尿病表型反映了胰岛素生成和/或分泌不足。PERK丢失后的后期体重显著下降，这可能反映了PERK在胰腺以外的其他分泌细胞室中的作用（见图S1D）(29,42).

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图2

6个月大时切除PERK会在术后4周引发糖尿病。（A）珀克对6个月大的小鼠进行了急性切除。在最后一次TAM治疗后的第0天定期测量血糖(n个=每种情况下4至9只小鼠，平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠与PERK^+/Δ和PERK^升/升老鼠）。（B） TAM治疗后10周处死小鼠，采集整个胰腺进行苏木精-伊红染色（40×）。（C） 从PERK收获的全胰脏^Δ/Δ和对照组小鼠在TAM治疗16周后。（D） PERK中的TUNEL染色^Δ/Δ和对照小鼠(n个=每种情况下4至5只小鼠，平均值±SEM）。*，P（P）<0.05（PERK^Δ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt、PERK^+/Δ和PERK^升/升老鼠）。（E） 在TAM治疗后3周处死小鼠之前，连续给小鼠饮用含有BrdU（1 mg/ml）的饮用水1周。**，P（P）< 0.01 (n个=每种情况下4至5只小鼠，平均值±SEM）。

PERK切除伴随胰腺萎缩和产生胰岛素的β细胞死亡。

鉴于PERK丢失对葡萄糖稳态的深刻影响，我们推断胰腺功能障碍应该是一个促成因素。事实上，切除PERK后发现胰腺萎缩加剧(图2C和​和3B）3B公司)与年龄和体型无关。由于腺泡细胞占胰腺的大部分，我们推断PERK的缺失会引发腺泡细胞的缺失，并且由于葡萄糖水平的显著升高，内分泌细胞可能会死亡。事实上，切除PERK的小鼠胰腺苏木精-伊红染色切片显示胰岛大小和完整性显著降低(图2B和​和3A）。3A级). 我们还通过电子显微镜评估了单个β细胞和腺泡组织的结构完整性。在β细胞中，成熟分泌颗粒的数量减少，同时未成熟颗粒的数量增加(图3C). 细胞核通常被膜结合池扭曲和挤压。内质网严重扩张，充满电子致密物质，表明新合成的蛋白质异常滞留，与胰岛素原在核周结构中的积聚相一致(图4A). 我们还注意到，敲除β细胞中胰岛素原的水平和分布与野生型胰岛中成熟胰岛素生成细胞的水平和分配明显不同（参见补充材料中的图S3），这与蛋白质成熟受损导致的胰岛素原积累以及缺乏PERK时翻译控制降低的潜在后果一致。因此，胰岛素mRNA水平没有增加（数据未显示）。Acinar细胞也表现出ER结构和完整性的显著破坏(图3C).

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图3

8周龄时切除PERK会触发β细胞死亡。（A） PERK的胰腺切片^Δ/ΔTAM治疗后12至16周，对照组小鼠用苏木精-伊红（40×）染色。（B） 在TAM治疗12至16周后，从小鼠中分离出整个胰腺，并称重(n个=每种情况下4至9只小鼠；平均值±SEM）。胰腺与体重的比值已确定。*，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt和PERK^升/升接受或不接受TAM治疗的小鼠）。（C） 来自PERK的β细胞（图像a到e）或腺泡细胞（图像f到h）的电子显微照片^升/升和PERK^Δ/ΔTAM治疗后12周的小鼠。N、 核；内质网；SG，分泌颗粒；AV，自噬小泡(n个=每种情况下3只小鼠）。水平条对应于500 nm。

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图4

8周龄小鼠的PERK切除会触发β细胞ER中胰岛素原和Glut2的异常积聚。（A）最上面一行显示PERK中Glut2（红色）的代表性免疫荧光染色^升/升或PERK^Δ/ΔTAM治疗3周后β细胞；最下面一行提供了β细胞中胰岛素原（绿色）和谷氨酰胺（红色）的典型免疫荧光染色。（B） 从PERK分离的胰岛中测量细胞浆钙^升/升（蓝色）和PERK^Δ/ΔTAM治疗后1周（i和ii）、2周（iii）或3-5周（iv）时的（红色）小鼠。从每种基因型的1或2只小鼠中分离出原代胰岛，并从每个基因型中随机选择12个胰岛用于本实验。基底[Ca²⁺]_我观察葡萄糖（G；5、10和25 mM）逐步刺激的水平和反应。彩色实线表示平均值，垂直灰色线表示SEM。*，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠与PERK^升/升老鼠）。

为了确定PERK切除是否引发糖尿病的发生是细胞自主的，我们将Pdx1-CreER小鼠与PERK交叉^升/升小鼠产生具有Pdx1-CreER的小鼠；PERK公司^升/升基因型(14). 至关重要的是，Pdx1的表达仅限于成年小鼠的胰腺β细胞(22). Pdx1-核心；PERK公司^升/升对照组小鼠用TAM或载体治疗(图5A). 我们证实，PERK仅在β细胞中被切除，而在β特异性PERK的相邻腺泡中未被切除^Δ/Δ老鼠(图5B). 至关重要的是，β-特异性PERK^Δ/ΔTAM治疗后1个月小鼠出现糖尿病(图5C). 全局PERK和β特异性PERK胰腺组织的分析^Δ/Δ小鼠的胰岛组织学相似，包括胰岛数量和大小减少(图5D)但没有出现全PERK切除后出现的胰腺萎缩（数据未显示）。这一结果表明，PERK缺乏以细胞自主的方式调节β细胞稳态。

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图5

年轻成年小鼠中β细胞特异性PERK基因敲除导致快速出现高血糖。（A） 实验设计示意图。（B） Pdx1-Cre小鼠在8周龄时接受TAM治疗。在TAM治疗5天后，对分离的原代胰岛或腺泡进行PERK切除PCR。（C） 血糖浓度的时间进程(n个=每种情况下4至8只小鼠，平均值±SEM；P（P）< 0.01). （D） TAM治疗后9周处死所有小鼠，并分析整个胰腺。胰腺切片用苏木精-伊红染色并拍照（40×）。

胰腺细胞减少可能反映了细胞死亡增加、增殖减少或两者兼而有之。以前关于β细胞死亡增加与β细胞增殖减少对胰岛大小和功能减少的贡献的报告是基于传统的PERK基因敲除小鼠模型或在胚胎发育后期PERK被删除的模型(18,43). 关于β细胞增殖，重要的是要考虑到在出生后早期发育之后，β细胞是有丝分裂后的，只有不到1%的细胞循环(13,40). 根据这一知识，我们推断，β细胞增殖的减少不太可能对观察到的表型产生显著影响。我们最初在TAM治疗后3周使用TUNEL分析评估β细胞死亡(图6A8周时切除；图2D，6个月时切除）。之所以选择这个时间点，是因为此时血糖水平只是略有升高。此时，我们注意到TUNEL阳性细胞显著增加，与细胞死亡增加一致。我们还观察到，TAM治疗后1周，PERK切除的胰岛中TUNEL阳性的β细胞增加（参见补充材料中的图S2A），这表明PERK切断后，β细胞死亡迅速诱导。

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图6

8周龄时切除PERK可诱导β细胞凋亡和增殖。（A） TAM治疗后3周，采用TUNEL评估β细胞死亡。箭头表示TUNEL（红色）、胰岛素（绿色）和DAPI三重阳性细胞。该图表示TUNEL阳性和胰岛素阳性细胞的定量(n个=每种情况下4至6只小鼠；平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt、PERK^+/Δ和PERK^升/升老鼠）。（B和C）小鼠在治疗前1周连续饮用饮用水中的BrdU，在TAM治疗后3周处死（B）(n个=每种情况下5只小鼠；平均值±SEM）或治疗前2周和治疗后12周处死（C）(n个=每种情况下3至6只小鼠；平均值±SEM）。**，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt、PERK^+/Δ和PERK^升/升老鼠）.*，P（P）<0.05（PERK^Δ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt和PERK^升/升接受或不接受TAM治疗的小鼠）。绿色，胰岛素；红色，BrdU。（D） TAM治疗后3周取小鼠石蜡包埋胰腺切片，用抗细胞周期蛋白D1抗体进行免疫染色。箭头表示细胞周期蛋白D1、胰岛素和DAPI三重阳性细胞或细胞周期蛋白D2和胰岛素双阳性细胞。绿色，胰岛素；红色，cyclin D1。

也有人认为胀亡是一种以细胞肿胀、空泡化、染色质断裂和膜通透性增加为特征的细胞死亡(31)，发生在PERK切除后。我们确实注意到PERK缺乏的β细胞中的这种形态，尽管这种形态也可以反映分泌细胞器中累积错误折叠蛋白的更一般的细胞形态（参见补充材料中的图S2B）。为了更直接地评估胀亡的影响，我们对胰腺进行了载脂蛋白E（ApoE）染色，这是一种血清蛋白，在胀亡细胞死亡期间可以通过受损的质膜被动吸收(24). 我们确实注意到，在TAM治疗后3周，一些ApoE阳性的腺泡细胞分散在PERK缺陷小鼠的胰腺中（见图S2C），但阳性的β细胞相对较少（尽管数量与对照组相比具有统计学意义）（见图S2D）。我们得出的结论是，细胞凋亡死亡和在较小程度上的肿瘤导致胰腺细胞数量减少。

虽然β细胞和胰岛数量的减少明显反映了细胞死亡的增加，但鉴于之前对增殖在胚胎胰腺发育后期的作用的评估，我们不得不直接评估PERK缺陷β细胞的增殖能力(43)以及PERK缺失对肿瘤细胞增殖特性的影响(4). 从糖尿病前期（TAM治疗后2周）开始，用BrdU连续标记小鼠1周，或在糖尿病前期持续标记小鼠2周。无论切除PERK的年龄如何，PERK缺陷小鼠的所有胰腺中增殖β细胞的百分比都显著增加(图2E和​和6B6亿和​和C）。C类). 这一结果表明，β细胞丢失不是增殖减少的直接结果。PERK切除后增殖增加可能反映了PERK已建立的调节关键细胞分裂蛋白（如细胞周期蛋白D1）的能力，从而防止不当增殖(6,16). 为了验证这一假设，我们通过免疫荧光和纯化胰岛的免疫印迹来评估细胞周期蛋白D1的表达。细胞周期蛋白D1在PERK切除的β细胞中的表达显著升高(图6D); 重要的是，对仅轻度升高血糖而非晚期糖尿病小鼠进行评估，以消除高糖水平对细胞周期蛋白D1表达的混杂影响(11,12). 免疫印迹法也发现细胞周期蛋白D1的积累显著增加；这种增加伴随着磷酸化Rb的协同增加，与功能活性增强的细胞周期蛋白D1依赖性激酶复合物一致(图7A，右侧）。

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图7

8周龄时PERK基因敲除胰岛Ire和ATF6的激活。从PERK分离出原代胰岛^升/升和PERK^Δ/Δ三苯氧胺治疗后1～2周。蛋白质印迹（A）或qPCR(n个=9，平均值±SEM）（B）用于评估Ire和ATF6或其下游效应器的激活情况。用thapsigargin治疗T细胞淋巴瘤6814 16 h，作为阳性对照。ATF6、sXBP1和cyclin D1印迹使用相同的负载控制。*，P（P）<0.05（PERK^Δ/Δ小鼠与PERK^升/升老鼠）。（C） TAM治疗后3周，采用TUNEL评估β细胞死亡。从TAM给药开始，小鼠每天接受一次胰岛素（5 IU/kg或10 IU/kg/kg）或PBS。绿色，胰岛素；红色，TUNEL。箭头表示TUNEL、胰岛素（insulin）和DAPI三重阳性细胞。该图表示TUNEL阳性和胰岛素阳性细胞的定量(n个=4至6，平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠[ins，5IU/kg或10IU/kg]与PERK^Δ/Δ小鼠[PBS]）。#，P（P）<0.01（PERK^Δ/Δ小鼠[ins，5IU/kg或10IU/kg]与PERK^升/升小鼠[PBS或ins]）。

PERK切除导致内质网功能障碍和UPR信号的激活。

由于PERK切除导致β细胞功能和存活率的快速而显著的损害，我们推断PERK的丢失会损害内质网中的蛋白质质量控制，导致错误折叠的蛋白质的积累，其中错误折叠的胰岛素、胰岛素原和葡萄糖转运蛋白（如谷氨酸）具有特别重要的意义。与这个假设一致，我们注意到在PERK的核周区有谷氨酸的积累^Δ/ΔPERK切除后3周胰岛和1周胰岛素原(图4A). 在血糖水平出现明显异常之前，出现了不适当的累积，这表明ER功能障碍发生在早期糖尿病前期细胞中。在肝脏或周围组织（如脂肪或肌肉组织）中未观察到葡萄糖转运蛋白的内质网蓄积（参见补充材料中的图S4A、B和C）。此外，我们在PERK基因敲除小鼠的唾液腺中未检测到明显的病理变化（见图S4D），这突出了PERK功能在胰岛中的重要性。尽管此时血糖水平只有轻微升高，但从PERK纯化的胰岛^Δ/Δ随着基础胰岛素分泌正常，葡萄糖浓度逐渐增加（葡萄糖斜率），小鼠的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）没有出现统计学意义上的显著减少（参见补充材料中的图S5A），表明胰岛素分泌在此早期点受到损害。这些结果表明内质网中的蛋白质成熟普遍存在缺陷。

ATP敏感K⁺（K）_{列车自动防护系统})通道在将膜兴奋性与GSIS耦合以将胰岛β细胞中的血糖维持在狭窄的生理范围内方面起着关键作用。葡萄糖代谢增加导致细胞内[ATP]:[ADP]升高，K_{列车自动防护系统}通道和膜去极化，从而诱导电压依赖性钙²⁺从而触发胰岛素分泌。相反，代谢信号的减少打开K_{列车自动防护系统}通道和抑制胰岛素分泌的电触发(25,33). 确定蛋白质成熟缺陷是否延伸至K_{列车自动防护系统}渠道，我们评估了K_{列车自动防护系统}通过使用格列本脲（K的拮抗剂）实现功能_{列车自动防护系统}通道）有效抑制K_{列车自动防护系统}在评估胰岛素释放之前，β细胞膜上的通道活性。如补充材料中的图S5B和C所示，与对照胰岛相比，PERK切除胰岛的胰岛素释放与格列本脲斜坡或细胞质膜最大去极化（KCl，30 mM）激发的对照胰岛没有显著差异。

内质网是主要的细胞钙储存细胞器，内质网钙稳态对蛋白质折叠和加工至关重要(35). 低葡萄糖浓度导致[Ca浓度依赖性降低²⁺]_急诊室这与PERK激活的增加平行(32)暗示PERK是潜在的Ca²⁺然而，没有明确的证据表明Ca在何时以及如何²⁺胰岛PERK急性丢失后信号表现异常。我们监测了[Ca²⁺]_我PERK切除后1周、2周和3-5周（血糖>300 mg/dl）纯化胰岛的调节。而基底[Ca²⁺]_我被抬高了(图4B，图i），Ca²⁺PERK切除胰岛对连续葡萄糖浓度（5、10和25 mM）的反应性振荡减少(图4B，图ii至iv），支持[Ca中的扰动²⁺]_我糖尿病前期PERK缺乏胰岛的稳态。

我们感谢Margarita Romero提供的杰出技术援助，感谢Douglas R.Cavener（宾夕法尼亚州立大学）提供的PERK^{液氧磷/液氧磷}小鼠、Eric J.Brown（宾夕法尼亚大学）提供CRE-ERT2小鼠、Xianxin Hua（宾夕法尼亚大学，提供PDX-CRE小鼠）和AFCRI组织学核心。

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助P01 CA104838号（M.C.S.和J.A.D.）和白血病与淋巴瘤学者奖（J.A.D。