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《公共科学图书馆·生物》。2004年5月；2（5）：e104。
2004年2月24日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pbio.0020104
预防性维修识别码：PMC350667型
PMID：15024409

植物小RNA通路的遗传和功能多样性

谢志新，#1 丽莎·约翰森，#1 亚当·古斯塔夫森，1 克里斯汀·卡绍（Kristin D Kasschau），1 安德鲁·D·莱利斯，1 丹尼尔·齐尔伯曼，2 史蒂文·雅各布森，2，三和詹姆斯·卡林顿通讯作者1
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补充资料

摘要

多细胞真核生物产生两种常见的小RNA分子（约21–24个核苷酸），即microRNA（miRNA）和short interference RNA（siRNA）。它们共同发挥序列特异性指南的作用，沉默或调节基因、转座子和病毒，并修改染色质和基因组结构。小RNA的形成或活性需要属于编码DICER（或DICER-LIKE[DCL]）和ARGONAUTE蛋白质的基因家族的因子，在某些siRNAs的情况下，还需要RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）蛋白质。与许多动物不同，植物编码多种DCL和RDR蛋白。使用一系列插入突变体拟南芥鉴定了三种DCL蛋白在miRNA（DCL1）、内源性siRNA（DCL3）和病毒siRNA（DC L2）生物生成中的独特功能。所有内源性siRNAs分析都需要一个RDR蛋白（RDR2）。内源性siRNA的丢失dcl3型和rdr2号机组突变体与异色标记丢失和一些位点转录物积累增加有关。芜菁皱缩病毒诱导的siRNA-generation活性缺陷dcl2突变植物与病毒敏感性增加有关。我们的结论是DCL公司和印度存托凭证植物进化过程中的基因有助于小RNA导向的发育、染色质结构和防御途径的专门化。

在植物中，RNA介导的沉默途径以独特的方式多样化。这项研究阐明了一些关键调控因子在发育、染色质结构和病原体防御中的特定功能

介绍

约21–24个核苷酸的真核小RNA在一系列广泛的生物过程中发挥引导分子的作用，包括发育时间和模式、异染色质的形成、基因组重排和抗病毒防御(卡林顿和安布罗斯2003;Finnegan和Matzke 2003年;赖2003). 它们至少属于两大类，微RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）。miRNAs（约21–22个核苷酸）存在于动植物中，通常在各自的王国中保存下来。它们来自非蛋白编码基因，通过前体转录物的形成，然后经过一个或多个核溶解处理步骤(赖2003). 部分前体采用折回结构，与称为DICER或DICER-like（DCL1 in拟南芥)催化成熟miRNA的精确切除(Denli和Hannon 2003年). miRNAs随后与核糖核蛋白复合物相关，核糖核蛋白质复合物对控制一系列发育事件的靶基因起负调控作用，如细胞命运决定的时间、干细胞维持、凋亡、器官形态发生和特性以及极性(安布罗斯2003;Carrington和Ambros 2003).

siRNA在化学上与miRNA相似，尽管在植物中，它们的大小通常在21到24个核苷酸之间(Hamilton等人，2002年;Llave等人，2002年a；Tang等人，2003年). 它们与转录后形式的RNA干扰（RNAi）和涉及染色质修饰的转录沉默有关(Finnegan和Matzke 2003). siRNA由含有广泛或专属双链RNA（dsRNA）结构的前体加工而成，如RNA病毒复制过程中形成的含有反向重复序列或中间产物的转录物(汉农2002). siRNA前体也可以由一个或多个细胞RNA-依赖性RNA聚合酶（RdRp）的活性形成，正如在几个RNA沉默缺陷突变体的筛选中所显示的那样(Cogoni和Macino 1999;Dalmay等人，2000年;Mourrain等人，2000年;Smardon等人，2000年;Volpe等人，2002年).拟南芥植物含有至少三个活性RdRp基因，称为RDR1号机组，关系型数据库2、和RDR6号机组（也称为SDE1/SGS2) (Dalmay等人，2000年;Mourrain等人，2000年;Yu等人，2003年).RDR6号机组对于感觉转基因介导的RNAi是必需的，但对于用包含广泛dsRNA结构的发夹编码转录物的结构体的沉默则不是必需的(Dalmay等人，2000年;Mourrain等人，2000年;Beclin等人，2002年). 在许多动物中，miRNAs和siRNAs都是由同一种DICER酶的活性形成的(Grishok等人，2001年;Hutvágner等人，2001年;Ketting等人，2001年;骑士和低音2001;Provost等人，2002年;Zhang等人，2002年;Myers等人，2003年)尽管在植物中，它们是由不同的DCL活性形成的(Finnegan等人，2003年).拟南芥包含四个DCL公司基因(数据中心1到DCL4类)，只有一个(数据中心1)已被赋予小RNA生物发生的决定性功能(Park等人，2002年;Reinhart等人，2002年;Schauer等人，2002年). 然而，生化数据表明，多种DCL活性或途径催化小型（约21个核苷酸）和大型（约24个核苷酸）siRNA的形成(Tang等人，2003年). 植物中的内源性siRNA来自多种类型的逆转录因子和转座子、其他高度重复的序列、假基因、基因间区域（IGR）和少数表达基因(Hamilton等人，2002年;Llave等人，2002年a；Mette等人，2002年). 外源siRNAs可以由感觉和发夹转录形成的转基因和病毒产生(Hamilton和Baulcombe 1999;Mette等人，2000年).

siRNAs和miRNAs都在转录后发挥作用，抑制或灭活靶RNA。siRNAs将RNA-诱导沉默复合物（RISC）的序列特异性核溶解活性导向互补靶序列(汉农2002). 在其他蛋白质中，RISC包含可能结合siRNAs或靶序列的ARGONAUTE（AGO）家族成员(Carmell等人，2002年). 在植物和昆虫中，转录后RNAi作为一种适应性抗病毒防御反应(Waterhouse等人，2001年;Li等人，2002年). 只要有足够互补的靶序列，miRNAs完全有能力指导RISC的核溶解功能(Hutvágner和Zamore 2002;Doench等人，2003年;Tang等人，2003年). 许多植物miRNAs通过这种裂解型机制发挥负调控作用(Llave等人，2002年b；Rhoades等人，2002年;Emery等人，2003年;Kasschau等人，2003年;Palatnik等人，2003年;Tang等人，2003年;Xie等人，2003). 在动物中，靶序列和miRNA序列之间的互补性水平通常较低，这会抑制核溶解活性。动物miRNAs抑制靶mRNAs的翻译(奥尔森和安布罗斯1999;Reinhart等人，2000年). 一些植物miRNAs也可能作为翻译抑制剂发挥作用(Aukerman和Sakai 2003;陈2003).

siRNAs还引导基于染色质的事件，导致转录沉默。有两条证据支持这一观点。首先，在绒球裂殖酵母和拟南芥，来自与着丝粒、转座子和逆转录因子相对应的重复序列的内源性siRNA相对丰富(Llave等人，2002年a；Mette等人，2002年;莱因哈特和巴特尔2002). RNAi相关因子（DICER、RdRp和AGO蛋白）需要维持S.pombe公司着丝粒重复序列和转录不活跃、异色状态的邻近序列(霍尔等人，2002年;Volpe等人，2002年). 失去RNAi组分活性的突变体失去异色标记，例如组蛋白H3在K9位置的甲基化（H3K9），以及着丝粒功能(霍尔等人，2002年;Volpe等人，2002年，2003). 在植物中，AGO4是维持转录沉默的表位基因超人. Theago4型突变体失去胞嘧啶甲基化，特别是在非CpG位置，和H3K9甲基化超人和其他组成异色位点（拟南芥短穿插元素1[在SN1]轨迹）(Zilberman等人，2003年). 其次，核DNA的异染色质形成可以通过细胞质RNA转录后沉默以序列特异的方式触发(Jones等人，1999年;Aufsatz等人，2002年;Schramke和Allshire 2003). RNA导向的DNA甲基化（RdDM）信号从细胞质传递到细胞核很可能是siRNA。流行的观点认为，siRNA引导的基于染色质的沉默，除其他目的外，还可以作为基因组防御系统，抑制可移动的遗传元素或侵袭性DNA(Dawe 2003年;Schramke和Allshire 2003).

使用遗传方法，我们在这里展示了三种小RNA生成途径的存在，它们在拟南芥。在多个成员中具有点突变或插入的植物DCL公司和印度存托凭证对基因家族进行了检测。数据表明，植物遗传多样性涉及形成功能不同的小RNA的几个因素。

结果

miRNA形成的遗传要求

至少有两个因素，DCL1和HEN1（HUA ENHANCER1），参与拟南芥miRNA形成。如miR-171、miR-159所示(图1A） 和其他一些miRNA(Park等人，2002年;Reinhart等人，2002年)，突变体dcl1型功能缺失等位基因失去了大部分的miRNA群体(图1B） ●●●●。具有突变体的植物母鸡1等位基因要么失去miRNAs，要么miRNA的表观大小增加一个或多个核苷酸(Park等人，2002年;Boutet等人，2003年) (图1B） ●●●●。miRNA抑制靶mRNA的功能在两种情况下都减弱dcl1型和母鸡1突变体(Boutet等人，2003年;Kasschau等人，2003年;Xie等人，2003). 为了确定miRNA的形成是否需要其他DCL或RDR蛋白拟南芥，miR-171和miR-159在四个新的突变体中进行了分析。这个dcl2-1型和dcl3-1型突变体包含T-DNA插入DCL2（DCL2）（见3G03300）和DCL3级（At3g43920）基因(图S1). 在野生型植物中，DCL2（DCL2）和DCL3级转录本在花序组织中积累到可检测的水平，但在叶片中没有。突变体dcl2-1型和dcl3-1型两种组织类型均未检测到转录物(图S1). 这个rdr1-1号反应堆和rdr2-1号机组突变体包含T-DNA插入RDR1号机组（见第14790页）和关系型数据库2（见4g11130）(图S1).RDR1号机组和关系型数据库2未经处理的野生型植物的花序组织中积累的转录物，而不是叶片(图S1). 这个RDR1号机组如前所述，水杨酸（SA）处理的叶片中的转录水平升高(Yu等人，2003年)，但是关系型数据库2转录水平不受SA影响(图S1). 两者都有rdr1-1号反应堆和rdr2-1号机组在相应的突变体植株中，转录物低于检测限。此外，含有插入RDR6号机组基因（也称为SDE1/SGS2; At3g49500）与rdr1型和rdr2号机组突变体。这个第6-1号命令突变体表现出弱病毒敏感性表型，与先前报道的一致sde1和sgs2号机组突变体(Mourrain等人，2000年;Dalmay等人，2001年). 然而，在RDR6号机组在野生型和野生型之间检测到转录水平第6-1号命令突变植物（数据未显示）。

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miRNA的遗传需求和内源性siRNA的生成

（A） miRNA基因和与三个siRNA或siRNA群体相对应的选定位点。克隆的小RNA序列显示为绿色（相对于基因组的义方向）或红色（反义方向）条。蛋白质编码和miRNA基因用蓝色箭头表示。从上到下：miR-171和miR-159a基因座；siRNA02基因座，每个siRNA02序列用星号表示，反转重复用灰色箭头表示；簇2 siRNA位点；染色体III的一段，显示10个5S rDNA重复序列（蓝色表示5S rRNA，灰色表示间隔区），包含siRNA1003序列。

（B） miR-171、miR-159和内源性siRNA的小RNA印迹分析。底部显示了tRNA和5S RNA对应区域中的溴化乙锭染色凝胶（转移前）。每个突变体与相应的野生型对照（Col-0或La）一起出现在一个面板中-呃).

miR-171和miR-159的积累在直流L2和dcl3型突变体（参见图1B） ●●●●。这与miR-171和miR-159在dcl1-7型和hen1-1，分别（参见图1B） ●●●●。同样，miR-171和miR-159的积累在rdr1级和rdr2号机组突变体。

内源性siRNA群体的组成

对来自Col-0生态型植物花序组织的克隆小RNA文库进行了部分测序和分析。对其中125个序列的初步鉴定表明，大多数克隆对应于siRNA样序列(Llave等人，2002年a） ●●●●。共有1368个不同的小RNA，大小介于20到26个核苷酸之间，在此暂时归类为siRNAs，其中24个核苷酸代表最常见的大小(图2A；所有序列都可以在以下位置查看或下载http://cgrb.orst.edu/smallRNA/db/). 在5299个基因组位点鉴定了siRNA序列(表S1). 大约27%的内源性siRNAs来源于正反义极性中的转座子或逆转录元件序列(图2B） ●●●●。着丝粒和着丝粒周围的siRNAs很常见，部分原因是这些位点存在转座子和逆转录因子。45个正反义极性小RNA来自高度重复的5S、18S和25S rDNA。虽然一些rDNA衍生序列可能是由高度丰富的rRNAs的非特异性分解导致的，但一些具有与功能性siRNAs一致的特定遗传要求和特性（见下文）。31个siRNA来自注释为假基因的序列，147个来自假设或预测基因(图2B） ●●●●。只有28个被确定为来源于已知表达的基因(图2B） ●●●●。其余816个序列映射到被集体标记为IGR序列的位点。IGR衍生的siRNAs来自与已知基因相邻的独特序列、反向重复、卫星和其他重复序列，尽管其中许多可能实际上对应于搜索程序未识别的转座子或逆转录因子序列。

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内源性siRNA拟南芥

（A） 内源性siRNA的大小分布。

（B） 不同siRNA在不同序列类别中的分布。

（C） 来自高度重复（主要是转座子和逆转录元件；星号显示使用RepeatMasker识别的重复序列）、5S rDNA和独特基因组序列的siRNA密度。

计算了由高度重复序列（主要是转座子和逆转录因子）、5S rDNA重复序列和非重复序列产生的独特siRNA的频率(图2C） ●●●●。文库中的siRNAs出现频率为2.42/100kb重复DNA，约为非重复序列（1.02/100KB）siRNAss出现频率的2.4倍。基于最新版本的拟南芥基因组序列，对应于5S rDNA的独特siRNAs被鉴定为7.55/100kb的频率。这些数据表明，siRNAs更频繁地出现在高度重复的基因组序列中。

内源性siRNA形成的遗传需求

选择一组四个siRNA或siRNA群体进行遗传分析，它们代表了文库中确定的主要类别。二十六个siRNA对应于SINE逆转录元件，其中一个(在SN1)选择进行详细分析。在SN1-衍生siRNA的形成需要AGO4公司(Zilberman等人，2003年)和SDE4系列(Hamilton等人，2002年). 选择了一个来源于5S rDNA的siRNA（siRNA1003）。5S rRNA基因以串联阵列形式出现在染色体III、IV和V中，典型的重复单元（约500个核苷酸）由转录序列（120个核苷酸）和侧翼间隔序列组成(Cloix等人，2002年;Mathieu等人，2003年). siRNA1003序列在间隔区序列内的有义方向上被鉴定为染色体III中的202个重复序列和染色体V中的4个重复序列（参见图1A） ●●●●。来自染色体I中125核苷酸IGR片段的簇2 siRNA群体由文库中的7个独特的siRNA代表（见图1A） ●●●●。最后，siRNA02序列与V号染色体上相隔约2.1 kb的两个位点相对应。一个位点出现在IGR序列中，另一个位于功能未知的假设基因（At5g56070）中。这两个siRNA02基因座出现在对应于反向复制臂的序列中（参见图1A）(Llave等人，2002年a） ●●●●。这个在SN1、cluster2和siRNA02探针检测到累积为24个核苷酸RNA的群体，而siRNA1003探针检测到包含21到24个核苷酸物种的群体（参见图1B） ●●●●。

每个siRNA群体的丰度在dcl3-1型突变体，但不在dcl1-7型或dcl2-1型突变体（参见图1B） ●●●●。这与miR-171和miR-159（参见图1B） ，以及其他一些测试的miRNAs（数据未显示），具体取决于数据中心1有趣的是，与siRNA02相对应的微弱信号，在SN1siRNA和cluster2 siRNA被检测到位于dcl3-1型突变型（参见图1B） ●●●●。这可能是由于在缺乏DCL3的情况下，siRNA前体暴露于替代DCL活性所致。值得注意的是，5S rDNA-衍生的siRNA1003探针检测到的大小siRNAs在dcl3-1型植物。

每个siRNA群体在rdr2-1号机组突变体，但不在rdr1-1号反应堆突变型（参见图1B） ●●●●。在初步实验中，每个siRNA群体都不受第6-1号命令突变，尽管这些数据应该谨慎解释，因为可能第6-1号命令等位基因较弱（数据未显示）。内源性siRNA需求关系型数据库2与miRNA相比，miRNA对每一种无线电数据记录器测试的突变（参见图1B） ●●●●。这些数据在遗传学上鉴定DCL3和RDR2为内源性siRNA产生系统的组分，该系统在功能上与miRNA产生装置不同。

HEN1蛋白与感观基因转录后沉默有关，但与发夹形成基因无关(Boutet等人，2003年). 我们使用hen1-1突变体。两个siRNA群体，siRNA1003和在SN1-siRNAs在hen1-1植物（参见图1B） ●●●●。另一方面，siRNA02和cluster2 siRNAs在hen1-1与野生型La相比的植物-呃植物。因此，每种检测的内源性siRNA都需要DCL3和RDR2，但只有高度重复的5S rDNA和逆转录因子衍生的siRNA需要HEN1。事实上，在这些基因座中，HEN1的要求或独立性与AGO4完全相同（D.Zilberman和S.Jacobsen，未发表的数据）。

内源性siRNA-生成系统的功能

之前的两项研究表明，SDE4和AGO4是在SN1siRNA积累和胞嘧啶位置甲基化在SN1轨迹(Hamilton等人，2002年;Zilberman等人，2003年). 在一个前4突变，丢失在SN1siRNA与组蛋白H3K9甲基化降低相关(Zilberman等人，2003年). 胞嘧啶甲基化和组蛋白H3K9甲基化增加是植物和其他生物中转录沉默和异色DNA的标志，siRNA可能将染色质修饰复合物募集到特定的位点(格雷瓦尔和摩押2003). 为了确定DCL3和RDR2是否催化与染色质、胞嘧啶甲基化在在SN1和5S rDNA位点以及H3K9和H3K4位置的甲基化在SN1进行了野生型检测，dcl3-1型、和rdr2-1号机组植物。我们还分析了AtSN1型-以确定突变是否影响基因座的表达。

与以前的报告一致(Hamilton等人，2002年;Zilberman等人，2003年)，亚硫酸氢盐测序在SN1基因组DNA显示Col-0野生型植物中广泛的CpG（72.0%）、CpNpG（43.1%）和不对称的CpHpH（16.3%）甲基化(图3A；表S2). 在rdr2-1号机组突变体、CpNpG和CpHpH甲基化分别降低到24.6%和4.5%。仅检测到CpG甲基化轻微降低rdr2-1号机组植物(图3A） ●●●●。这种甲基化模式类似于在缺乏甲基化酶3的突变体中检测到的甲基化模式(厘米3-7;图3A） ，这对于高效甲基化在SN1在非CpG位点和缺乏AGO4的突变体中(Zilberman等人，2003年). 在dcl3-1型然而，突变株的胞嘧啶甲基化仅在不对称位点降低，而CpG和CpNpG甲基化与野生型植物相似(图3A） ●●●●。

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突变对在SN1和5S rDNA染色质结构与基因表达

（A） CpG（左）、CpNpG（中）和CpHpH（右）甲基化分析在SN1通过基因组DNA的亚硫酸氢盐测序。

（B） 用甲基化敏感限制酶HpaII（左）和MspI（右）消化5S rDNA的印迹分析。HpaII对CpG和CpNpG甲基化敏感，而MspI只对CpNp甲基化敏感。甲基化由上升梯表示，其对应于5S rDNA多聚体（单体＝约0.5kb）。对每种植物的重复样品进行了分析。

（C） 使用抗二甲基活塞H3K9和二甲基活塞H1K4抗体进行ChIP分析。与免疫沉淀染色质相关的基因组DNA通过半定量PCR分析，引物对特异性为在SN1、逆转录转座子逆转录酶（At4g03800）（H3K9甲基化的内部控制）和PFK（At4g 04040）（H3 K4甲基化的外部控制）。对PCR产物进行量化，并与各自的内部对照进行比较，相对H3K4和H3K9甲基化水平相对于Col-0中的甲基化水平进行表达（任意设置为1.00）。

（D） 检测在SN1-半定量RT-PCR检测特定转录物。针对PFK转录本的引物被用作内部控制。在不添加逆转录酶（RT）的情况下进行一组平行反应，作为基因组DNA污染的质量控制。将PCR产物相对于PFK标准化，并相对于Col-0中的表达水平计算表达水平（任意设置为1.00）。

由于5S rDNA重复的数量，使用限制性内切酶HpaII或MspI和DNA印迹分析进行胞嘧啶甲基化分析。对HpaII的敏感性表明CpG或CpNpG位点（或两者）缺乏甲基化，而对MspI的敏感性表明只有CpNp位点缺乏甲基化。野生型Col-0和La-呃植物中，5S rDNA位点在CpG+CpNpG位点被严重甲基化，如HpaII仅检测到高分子量形式所示，而MspI仅检测到部分甲基化(图3B） ●●●●。在rdr2-1号机组植物中，CpNpG位点的甲基化部分丢失（MspI敏感性增加；图3B、 车道15–16），尽管程度低于厘米3-7植物(图3B、 车道21–22）。HpaII敏感性检测到的甲基化在rdr2-1号机组突变体(图3B、 通道3–4），这很可能是由于CpG甲基化缺失所致。仅CpNpG甲基化缺失rdr2-1号机组植物不会解释HpaII敏感性增加的原因，因为HpaII的敏感性厘米3-7植物（几乎缺乏所有CpNpG甲基化）未受影响(图3B、 车道9–10）。中5S rDNA位点对HpaII和MspI的敏感性dcl3-1型植物数量仅略有增加(图3B、 车道5-6和17-18）。在会前4-1突变体CpG甲基化部分丢失，这是由于HpaII敏感性增加所致(图3B、 车道11-12）。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析用于检测H3K4和H3K9甲基化在在SN1在里面rdr2-1号机组和dcl3-1型突变系。含有编码反转录转座子逆转录酶和磷酸果糖激酶β亚基（PFK）的基因的位点分别被用作与K9-和K4-甲基化组蛋白H3相关序列的阳性对照(Gendrel等人，2002年). 在在SN1，组蛋白H3K9甲基化水平降低在两组中均检测到rdr2-1型和dcl3-1型突变体（参见图3C） ●●●●。这伴随着H3K4甲基化的轻微增加（参见图3C） ●●●●。H3甲基化改变的程度在rdr2-1号机组相对于dcl3-1型植物。在对照基因座检测到H3K4和H3K9甲基化几乎没有变化。此外，H3K4或H3K9甲基化在在SN1在里面厘米3-7工厂（数据未显示）。这里显示的H3甲基化的变化类似于前4突变植物(Zilberman等人，2003年).

的级别在SN1-在rdr2-1号机组和dcl3-1型并使用半定量RT-PCR与PFK转录水平进行比较。如所示图3D、 相对较低水平的在SN1在野生型Col-0植物中检测到转录物。然而在SN1转录本比rdr2-1号机组和dcl3-1型突变体植物分别与野生型植物进行比较。因此，siRNA形成能力的丧失与异色标记的丧失以及染色质水平通常沉默的内源性位点转录水平的升高有关。

鉴于RDR2、DCL3和AGO4参与染色质相关事件，并且HEN1是与染色质修饰相关的某些内源性siRNA积累所必需的，因此假设这些蛋白质中的每一个都在细胞核中积累。通过外源植物中绿色荧光蛋白（GFP）融合的瞬时表达和分析，检测每个蛋白中是否存在核转运信号，本氏烟草，使用农杆菌属渗透试验。将这些蛋白质的亚细胞聚集位点与β-葡萄糖醛酸酶（GUS）-GFP（细胞溶质控制）和核包涵体a蛋白（NIa）-GPP（核控制）进行比较。DCL3–GFP、HEN1–GFP和GFP–AGO4融合蛋白仅在细胞核中检测到(图4;图S2)，表明DCL3、HEN1和AGO4具有独立的核传输能力。然而，由于低表达水平和蛋白质不稳定性，RDR2–GFP和GFP–RDR2融合蛋白的亚细胞定位实验没有结果（数据未显示）。

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GFP融合蛋白的亚细胞定位

共聚焦显微图像的成对呈现，显示GFP荧光（顶部）和DAPI荧光（底部）N.本哈米亚纳表达指示的GFP融合蛋白。箭头表示原子核的位置。请注意，GUS–GFP控制蛋白在细胞外围和紧邻细胞核的细胞质中积累，而NIa–GFP控蛋白在细胞核中积累。比例尺=25μm。

病毒衍生siRNA形成的遗传要求

DCL1、DCL2和DCL3参与siRNA的形成，以应对三种不同RNA病毒的感染dcl公司突变体系列。其中两种病毒，一种带有GFP标记的芜菁花叶病毒（TuMV-GFP）和芜菁皱褶病毒（TCV）感染拟南芥全身性并引起中度至重度疾病症状。第三种病毒是黄瓜花叶病毒Y株（CMV-Y），它全身感染植物，但只引起轻微症状。野生型（Col-0和La-呃)将突变植株接种在莲座叶上，并在接种后7天和14天（dpi）分析上部非接种组织（茎叶和花序）的病毒特异性siRNAs。

在这两个时间点，在野生型植物的系统组织中检测到病毒siRNA(图5A–5C、 通道3、5、10和13），在14dpi时siRNA水平通常较高。TuMV和CMV感染者dcl1-7型，dcl2-1型、和dcl3-1型突变植物，siRNAs的积累水平与感染野生型植物在7和14dpi时的水平相似（图​（图5A5A和​和5B）。5B） ●●●●。这三个突变体中的TuMV和CMV滴度和症状表型与各自亲本中的没有区别（数据未显示）。同样，在TCV感染中dcl1-7型和dcl3-1型植物、病毒siRNA水平、病毒滴度和症状严重程度与野生型植物基本相同(图5C类；图6A和​和6B；6B类；数据未显示）。

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病毒siRNA生成中DCL的遗传需求

病毒siRNA的Blot分析。在指示的时间点分析感染TuMV–GFP（A）、CMV-Y（B）和TCV（C）的亲本和突变株系的系统组织样本。使用病毒特异性探针分析RNA印迹以检测siRNA。图中显示了tRNA和5S RNA对应区域中的溴化乙锭染色凝胶。siRNAs的相对积累（RA）显示在每个面板的底部，其水平在受感染的对照植物（Col-0或La）中测量-呃，取决于突变体）以7dpi任意设置为1.0。

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TCV感染易感性的改变dcl2-1型突变植物

（A） 未感染对照组（左）和TCV感染组（右）Col-0，dcl2-1型、和dcl3-1型植物在14dpi。

（B） 用ELISA测定的TCV在7 dpi（开杆）和14 dpi（填充杆）时在受感染野生型和突变植物的系统组织中的积累。

（C） 在14dpi下测量了未感染（开放栅）和感染（填充栅）植物的株高（左）、花/株数（中）和插条组织鲜重（右）(n个= 9).

相比之下，TCV衍生的siRNAs的积累水平比dcl2-1型植物与野生植物在7 dpi下的比较（参见图5C、 车道10–11）。这是一个短暂的缺陷，因为TCV siRNA水平反弹到接近野生型水平14dpi（参见图5C、 13–14车道）。siRNAs的缓慢积累并不是由于所分析的组织中缺乏TCV复制或运动，因为TCV滴度在dcl2-1型突变体与（7dpi）相似或显著高于(第页<0.05，14dpi）野生型植物中的滴度(图6B） ●●●●。此外，TCV引起的疾病在dcl2-1型植物，如植株高度、螺栓鲜重和受感染的花朵数量dcl2-1型每株植物都显著(第页株高和花数均<0.01；第页螺栓重量<0.05）低于受感染的野生型植物(图6A和​和6C）。6C） ●●●●。因此，DCL2在TCV感染的植物中起到抗病毒沉默反应的作用。

DCL2–GFP融合蛋白主要聚集在细胞核中N.本哈米亚纳瞬时分析系统中的细胞，尽管也检测到一些细胞溶质定位（参见图4). 因此，DCL1(Papp等人，2003年)DCL2和DCL3均具有核转运活性。

讨论

植物小RNA生成系统的遗传多样性

我们在这里展示拟南芥至少有三个系统产生不同类别的内源性或病毒诱导的小RNA，这些小RNA与特殊的调节或防御功能相关。首先，miRNA产生系统需要DCL1，如前所述(Park等人，2002年;Reinhart等人，2002年)，但没有测试任何RDR蛋白。原则上，在miRNA生物生成过程中不需要RDR活性，因为DCL1底物是基于DNA的转录直接形成的。DCL1在细胞核中的可能功能(Papp等人，2003年). 它还与HEN1直接或间接发挥作用，HEN1可赋予底物特异性、加工精度或催化功能。

第二个系统需要DCL3和RDR2，并生成主要为大分子（约24个核苷酸）类的内源性siRNA。虽然DCL3无疑作为核糖核酸酶处理dsRNA前体，但RDR2可能作为聚合酶使用DNA转录产生的模板从头形成dsRNA分子。然而，在一些位点上，RDR2可能不需要作为催化亚单位，而是有助于形成或稳定含有活性DCL3的复合物。这可能是某些位点的情况，例如siRNA02位点，这些位点包含反向复制，并且可能形成具有广泛dsRNA结构的转录本。有趣的是，特定于发夹结构的siRNA的积累在裂变酵母中表现为RdRp依赖性(Schramke和Allshire 2003). 在某些位点，该系统似乎与AGO4、HEN1和SDE4结合。

第三个系统在抗病毒防御中起作用，涉及DCL2。在TCV感染者中特别检测到该系统缺失dcl2-1型植物，表现出病毒siRNA积累延迟，敏感性和敏感性增加。然而，有几个理由怀疑存在多种抗病毒、siRNA生成系统。TCV触发的siRNA在dcl2-1型但是siRNA的积累被延迟了。虽然这可能是由于突变体中DCL2功能的不完全丧失，但它也可能反映了次级或冗余DCL活性的存在。在测试的三种病毒中，有两种未受dcl2-1型突变。这强烈暗示存在一个或多个具有独特或冗余抗病毒特异性的其他siRNA生成活性。此外，DCL2依赖系统除了与抗病毒防御相关的功能外，还可能具有其他功能。DCL2–GFP融合蛋白主要在细胞核中检测到，而TCV在细胞核外复制和积累。在对三种病毒进行抗病毒沉默期间，确定RDR1和RDR2的遗传需求的实验没有定论，同样可能是功能冗余或存在混杂病毒RdRp活性的结果(阿勒奎斯特2002).Mourrain等人（2000年)另一方面，表明第6号命令(sde1/sgs2)突变体缺乏CMV诱导的沉默。此外，Yu等人（2003）)表明了这一点RDR1号机组有助于防御烟草病毒。

Tang等人（2003年)在小麦胚芽提取物中鉴定了两种siRNA-generating DCL活性。这些是用dsRNA作为底物进行检测的。虽然单粒子包含DCL公司基因家族，成员与拟南芥（谢振中和卡林顿，未公布数据）。需要进一步研究将小麦胚芽中的DCL活性与拟南芥。

植物中DCL家族的遗传多样性程度与动物中的情况相反。秀丽隐杆线虫例如，人类只包含一个DICER(Grishok等人，2001年;Ketting等人，2001年;骑士和低音2001;Provost等人，2002年;Zhang等人，2002年)尽管两者都具有miRNA和siRNA功能。因此，虽然植物在进化过程中使DCL家族成员多样化和功能专门化，但动物围绕一种或相对较少的DICER活性进化出功能不同的小RNA系统。然而，动物进化出相对较大的AGO相关家族(Carmell等人，2002年)，这些可以提供用于功能专门化的模块。

内源性siRNA-生成系统在植物中的作用

DCL3和RDR2都与AGO4合作，也可能与SDE4和HEN1合作在SN1启动或保持异色状态的位置(Hamilton等人，2002年;Zilberman等人，2003年). DCL3、RDR2和AGO4因子的缺失与DNA甲基化和组蛋白H3K9甲基化的缺失相关。有趣的是，在使用转基因的转化过程中，这些因素对于沉默触发的从头开始也是必要的鱼类和野生动物管理局(Chan等人，2004年). 的静音鱼类和野生动物管理局是由于启动子中含有直接重复序列的区域的胞嘧啶甲基化(Soppe等人，2000年). The effect of therdr2-1号机组染色体结构突变与基因沉默在SN1和鱼类和野生动物管理局通常比dcl3-1型突变。这可以解释为存在由另一种DCL活性形成的残余siRNAdcl3型突变体（参见图1B） ●●●●。从这些和其他结果中得出的结果表明，DCL3和RDR2作为内源性siRNA产生系统的组成部分发挥作用，并且由此产生的siRNA可以通过含有AGO4的效应复合物引导染色质修饰事件。鉴于AGO蛋白是RISC的组成部分，可催化序列特异性RNA降解(Carmell等人，2002年)不同的AGO蛋白具有DNA或RNA-结合活性(Lingel等人，2003年;Song等人，2003年;Yan等人，2003年)，似乎有理由推测AGO4与染色质相关的RISC样复合体结合，并与核siRNA或靶序列相互作用。但与细胞质中的RNAi事件不同，染色质相关复合物可能与DNA甲基转移酶和组蛋白甲基转移酶系统相互作用。RdDM可发生在CpG和非CpG位点，但DNA复制后非CpG-甲基化的维持通常需要siRNA-导向复合物的持续活性(Luff等人，1999年;Jones等人，2001年;Aufsatz等人，2002年). 相反，CpG位点的甲基化可以通过DNA复制的半甲基化产物上的模板驱动甲基化来维持，这解释了为什么在一个或多个沉默因子或触发位点丢失后，CpG-甲基化经常在后代中持续存在。

内源性位点和转基因siRNA的积累不一定需要AGO4（D.Zilberman和S.Jacobsen，未发表的数据），这表明AGO4在siRNA形成的下游起作用，以指导DNA甲基化。AGO4和HEN1的缺失对所有测试的siRNAs有几乎相同的影响，可能是因为HEN1和AGO4影响途径中的类似点。如果AGO4和HEN1在siRNA形成的下游起作用，为什么siRNA来自某些位点(在SN1和5S rDNA）在前4和母鸡1变种人？一种可能性是异色标记（DNA和H3K9甲基化）和相关因素会将RDR2、DCL3或两者招募到染色质上的特定位点，从而建立一个增强环。异染色质丢失前4例如，突变将导致无法将siRNA生成酶招募到源于目标位点的转录物中，从而导致siRNAs缺失。然而，这一假设并不适用于其他一些siRNA生成位点，例如产生cluster2 siRNAs和siRNA02的位点。这些位点的siRNA积累在ago4型和母鸡1突变体。在野生型植物中，这些基因座在CpG和非CpG位点上都是低甲基化的，并且与组蛋白H3相关，该组蛋白大部分缺乏K9甲基化（数据未显示）。由这些位点形成的siRNA显然需要RDR2和DCL3，但它们似乎并不影响染色质结构。这些siRNA可能被隔离在细胞的其他地方，无法与染色质或染色质相关因子相互作用。

自然发生的siRNA的谱拟南芥是关于这些分子在基因组维护、基因组表达和防御中的作用的信息。与独特的基因组序列相比，来自高度重复序列（主要是逆转录因子和转座子）的siRNAs表现过度，这一事实表明，序列重复事件是通过RNA引导异染色质的形成来感知和处理的。这经常在基因组防御的背景下讨论，通过抑制流动DNA促进基因组稳定性(Plasterk 2002年;Dawe 2003年). 事实上，异染色质的缺失通常与转座子和逆转录元件的活性增加有关(Hirochika等人，2000年;Miura等人，2001年;Singer等人，2001年;Gendrel等人，2002年). 然而，应该认识到，这些和其他重复序列也可以用作顺式-位于功能基因附近或内部的活性表观遗传调控模块(Kinoshita等人，2004年). 例如春化，例子数量迅速增加(巴斯托和迪安2003)由表观遗传事件调节的细胞记忆，提示siRNA-directed过程可能作为生长发育过程中的一种调节机制广泛嵌入(古德里奇和特威迪2002).

材料和方法

植物材料

所有植物都是在标准温室条件下生长的。这个dcl1型-7,hen1-1，厘米3-7、和会前4-1突变株系如前所述(曹和雅各布森2002;Golden等人，2002年;Park等人，2002年;Zilberman等人，2003年). 其他突变系是从Salk Institute基因组分析实验室（美国加利福尼亚州拉霍亚市SIGnAL）和Torrey Mesa研究所（现为瑞士巴塞尔先正达的子公司）获得的。dcl2-1型在预测的第9内含子内有T-DNA插入（在基因组DNA ATG的核苷酸2842之后）DCL2（DCL2）（见3G03300）。dcl3-1型在预测的第7外显子内有T-DNA插入直流l3（At3g43920）位于基因组DNA中ATG以外的2136个核苷酸点。这在丝氨酸288密码子之后引入了四个密码子，然后是一个提前终止密码子。rdr1-1号反应堆在ATG之外的核苷酸2366之后，在预测的外显子1内有T-DNA插入RDR1号机组（见第14790页）。rdr2-1号机组在预测的外显子1内有T-DNA插入（在ATG的核苷酸316之前）关系型数据库2（见4g11130）。rdr6-1型在预测的外显子2（在基因组DNA的ATG的核苷酸3977前面）内具有T-DNA插入RDR6号机组（也称为SDE1/SGS2; 见3G49500）。每个插入线被回交两次到Col-0并达到纯合。在线补充资料中提供了有关插入线的其他信息。

对于每个插入突变体的分析，Col-0是野生型对照植物。对于dcl1-7型，hen1-1，会前4-1、和厘米3-7突变体，La-呃是野生型对照。

RNA印迹分析

如前所述，提取低分子量和高分子量RNA并进行印迹分析(Llave等人，2002年a） ●●●●。低分子量RNA（20μg）来自拟南芥免疫组织用于miRNA和内源性siRNA分析。miR-171和在SN1-siRNA分析如前所述(Llave等人，2002年b；Zilberman等人，2003年). 使用末端标记的DNA寡核苷酸AS-159（5′-TAGAGCTCCTTCAATCCAAA-3′）检测miR-159。分别使用末端标记的DNA寡核苷酸AS-02（5′-GTTGACCTCGCGCCGAT-3′）和AS-1003（5′-ATGCAAGTTGGCCCTCACGGTCT-3′）检测siRNA02和siRNA1003。簇2 siRNAs的探针是一个随机引物标记的片段，跨越I号染色体的235-核苷酸IGR（核苷酸4506544-4506778）（参见图1A） 并使用引物AS-285（5′-TTGTGATTTTATTTATGCAT-3′）和S-786（5′-CTTTTCAAACATAAACCAAAA-3′）从基因组DNA中扩增。

DNA和组蛋白甲基化分析

如其他地方所述，通过基因组DNA的亚硫酸氢盐测序或甲基化限制性内切酶消化后的DNA印迹分析来分析胞嘧啶甲基化(Jacobsen等人，2000年;Zilberman等人，2003年). 区域在SN1用亚硫酸氢钠处理分析的（染色体III，核苷酸15805617–15805773）并用引物扩增在SN1-BS1（5′-GTTTGTATAAGTTTTAATTTATTTAYGGATYAGTATATTT-3′）和在SN1-BS2（5′-CAATATACRATACAAAAAACARTATAAAATATACTTAA-3′）。每个基因型至少有18个独立克隆被测序。

ChIP测定使用二甲基组蛋白H3K4（Upstate Biotechnology，Lake Placid，New York，United States）或二甲基组蛋白H3K9（由奥地利维也纳分子病理学研究所T.Jenuwein提供）特异性抗体进行，如其他地方所述(Gendrel等人，2002年). H3K4和H3K9的甲基化在SN1野生型Col-0和rdr2-1号机组和dcl3-1型相对于内部控制基因座At4g04040和At4g03800，测量突变体。然后根据第0列中测量的值对数据进行标准化。

GFP融合蛋白的分析

这个35S:DCL3–GFP构造包含DCL3级编码区融合到GFP编码序列，两侧是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和终止子序列。表达盒在pSLJ755I5中克隆。所有其他GFP融合构建物都是通过将编码序列克隆到pGWB5（用于C端GFP）或pGWB6（用于N端GFP，一组网关兼容的二元载体，设计用于35S启动子驱动的GFP融合蛋白表达（由日本Izumo岛根大学T.Nakagawa善意提供）。使用入口载体的克隆是使用Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）的试剂和协议完成的。结构被引入根癌农杆菌应变GV2260，单位为N.本哈米亚纳如前所述离开(Johansen和Carrington 2001). 使用抗GFP的单克隆抗体通过共焦显微镜和免疫印迹分析检测融合蛋白（瑞士巴塞尔罗氏）。

病毒感染检测

野生型和突变型拟南芥如前所述，植株（大约4周龄，抽薹前）感染了TuMV–GFP、CMV-Y和TCV(Whitham等人，2000年;Lellis等人，2002年). 在7和14dpi时，收获由花序和茎生叶组成的系统组织用于ELISA和RNA印迹测定。用于TuMV和TCV ELISA的抗体如前所述(Lellis等人，2002年).

计算方法

重复序列的计算识别，包括转座子和逆转录因子拟南芥基因组是使用重复屏蔽器完成的(http://ftp.genome.washington.edu/RM/RepeatMasker.html)和Repbase(http://www.girinst.org/index.html).

有关的更多信息拟南芥siRNAs和miRNAs，包括本研究中分析的那些，可以在拟南芥小核糖核酸项目数据库(http://cgrb.orgst.edu/mallRNA/db/).

支持信息

图S1

DCL公司和印度存托凭证突变系：

（A） 外显子（条）/内含子（行）组织拟南芥DCL和印度存托凭证突变系中T-DNA插入位点的基因和位置。

（B） RNA印迹分析（20μg总RNA）DCL2（DCL2）和DCL3级Col-0和相应突变体中的mRNA。与2652–3292核苷酸相对应的DNA片段DCL2（DCL2）开放阅读框和核苷酸2805-3571DCL3级采用开放阅读框作为杂交探针。作为对照，剥离印迹并与β-微管蛋白特异性探针杂交(Kasschau等人，2003年).

（C） RNA印迹分析（10μg总RNA）RDR1号机组和关系型数据库2Col-0和相应突变体中的mRNA。与核苷酸2900-3300相对应的DNA片段RDR1号机组开放阅读框和核苷酸10–271RDR2型开放阅读框作为基因特异性探针。分析中还包括来自SA处理的叶片组织的RNA样本。

（每股5.9 MB）。

图S2

GFP融合蛋白的免疫印迹分析：

35S启动子驱动的GFP融合结构在N.本哈米亚纳使用农杆菌属-注入程序。用抗GFP单克隆抗体和共焦显微镜（参见图4). 箭头表示预测的全尺寸融合蛋白的位置。

（1080毫巴/秒）。

表S1

克隆的siRNA基因座拟南芥基因组：

（25 KB文档）。

表S2

胞嘧啶甲基化拟南芥AtSN1:

（24 KB文档）。

接入号码

GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)本文讨论的实体的登录号为At1g14790(NM_101348号)，地址：3G03300(NM_111200)，地址：3G43920(NM_114260)，地址：3G49500(NM_114810)，地址：4g11130(NM_117183号)，染色体I(NC_003070.3号)，染色体III(NC_003074.4号)和siRNA02(AF501743型).

SAIL（原名大蒜）(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress网站)本文讨论的T-DNA插入系的登录号为rdr1-1号反应堆（SAIL_672F11），rdr2-1号机组（SAIL_1277H08），以及rdr6-1型（SAIL-388:003）。

SIGnAL数据库(http://signal.salk.edu/)本文讨论的T-DNA插入系的登录号为dcl2-1型（SALK_064627）和dcl3-1型（SALK_005512）。

致谢

我们感谢Scott Givan和Chris Sullivan在计算资源方面提供的宝贵帮助和建议；Thomas Jenuwein（奥地利维也纳分子病理学研究所）提供二甲基孕酮H3K9特异性抗体；陈雪梅（美国新泽西州卡姆登罗格斯大学）hen1-1种子；中川聪（日本Izumo Shimane大学）提供pGWB矢量系列；布里吉特·蒂莫尼协助进行病毒感染实验；Zachary Lippman和Robert A.Martienssen分享了他们的ChIP协议和控制位点信息。我们还感谢先正达和索尔克研究所基因组分析实验室获取他们的T-DNA插入线。这项工作得到了国家科学基金会（MCB-0209836）和国家卫生研究院（AI43288、F32A1051097和GM60398）的资助。

缩写

安大略美术馆阿戈纳特
在SN1 拟南芥短穿插元素1
CaMV公司花椰菜花叶病毒
炸薯条染色质免疫沉淀
CMT3型色甲基化酶3
CMV公司黄瓜花叶病毒;DCL公司
数字功率接口接种后天数
dsRNA双链RNA
GFP公司绿色荧光蛋白
GUS公司β-葡萄糖醛酸酶
H3K4型赖氨酸4处的组蛋白H3
H3K9型组蛋白H3位于赖氨酸9
HEN1公司华增强1
IGR公司基因间区
微小RNA微小核糖核酸
美国国家情报局核包涵体a蛋白
PFK公司磷酸果糖激酶β亚基
RdDM公司RNA指导的DNA甲基化
印度存托凭证RNA依赖性RNA聚合酶基因
卢比依赖RNA的RNA聚合酶
RISC公司RNA诱导沉默复合物
RNA干扰RNA干扰
RT公司逆转录酶
沙特阿拉伯水杨酸
小核糖核酸短干扰RNA
TCV公司芜菁皱缩病毒
芜菁花叶病毒萝卜花叶病毒

利益冲突。提交人声明，不存在利益冲突。

作者贡献。ZX、LKJ、KDK和JCC构思并设计了实验。ZX、LKJ、KDK和ADL完成了大部分实验工作。AMG、KDK以及JCC构思并设计了小RNA数据库。AMG构建了数据库。DZ和SEJ生成了会前4-1和厘米3-7突变体和开发的染色质分析协议。ZX、LKJ、KDK、JCC和SEJ分析了数据。ZX和JCC撰写了这篇论文。

学术编辑：马克斯·普朗克发育生物学研究所Detlef Weigel

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