Inhibition of Integrin Alphavbeta6 on Cholangiocytes Blocks Tgfbeta Activation and Retards Biliary Fibrosis Progression

E. Patsenker; Y. Popov; F. Stickel; A. Jonczyk; S. L. Goodman; D. Schuppan

doi:10.1053/j.gastro.2008.04.009

胃肠病学。作者手稿；PMC 2012年11月23日发布。

以最终编辑形式发布为：

胃肠病学。2008年8月；135(2): 660–670.

2008年4月16日在线发布。数字对象标识：10.1053/j.gastro.2008.04.009

PMCID公司：项目经理3505071

美国国立卫生研究院：NIHMS64752

PMID：18538673

整合素Alphavbeta6对胆管细胞的抑制阻断Tgfbeta激活并延缓胆道纤维化进展

E.帕特森克,^1,² Y.波波夫,^三 F.贴纸,¹ A.乔奇克,⁴ S.L.古德曼,⁵和D.舒潘^三

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关联数据

补充资料: 1
NIHMS64752补充-01.pdf（165K）
GUID:BE0154F2-8432-4802-986E-A7840F2D2D79

摘要

背景和目标

整合素αvβ6在某些活化的上皮细胞上高度表达，在那里它介导与纤维连接蛋白的粘附，并充当潜在TGFβ1活化的辅受体。由于其在肝纤维化中的作用尚不清楚，我们在体外研究了αvβ6的功能，并探讨了特异性αvβ5拮抗剂EMD527040的抗纤维化潜力。

方法

对胆管结扎（BDL）后大鼠和MDR2（abcb4）-/-小鼠的实验性肝纤维化进行了研究。在BDL后第2周至第6周给大鼠和第4周至第8周给Mdr2-/-小鼠不同剂量的EMD527040。通过定量RT-PCR对肝胶原进行定量，并测定αvβ6和纤维化相关转录物的表达。组织学观察αvβ6表达细胞、胆管增殖和凋亡。体外研究EMD527040对胆管细胞粘附、增殖、凋亡和TGFβ1活化的影响。

结果

在纤维化中，αvβ6在增殖的胆管上皮上高表达，在晚期纤维化中转录水平增加了100倍。EMD527040使胆管增殖和胆道周围胶原沉积减少40-50%，诱导纤维生成基因下调和纤溶基因上调，改善肝脏结构和功能。体外αvβ6抑制可使活化的胆管细胞增殖、对纤维连接蛋白的粘附和内源性TGFβ1的激活降低50%，但不影响胆管细胞凋亡。

结论

整合素αvβ6在增生的胆管上皮中强烈上调，并通过粘附纤维连接蛋白和自身/旁分泌TGFβ1激活来驱动纤维化。αvβ6的药理学抑制能有效抑制原发性和继发性胆道纤维化的进展。

其他关键字：Abcb4、动物模型、拮抗剂、胆管、抗纤维化治疗、胆管结扎、胆道上皮细胞、细胞粘附、肝硬化、CTGF、纤维生成、纤维溶解、纤维连接蛋白、纤维化、基因缺失、基因表达、抑制剂、整合素、肝脏、MDR2、MMP、非肽类、前胶原、增殖、平滑肌肌动蛋白、TGF-β、TIMP-1

介绍

肝纤维化是慢性肝损伤期间一种相对均匀的伤口愈合反应，由不同刺激物触发，如毒素和感染，或由代谢和胆道异常触发。纤维化，即细胞外基质（ECM）成分的过度合成和沉积，可导致肝硬化，其特征是肝脏结构和血管扭曲以及肝功能的逐渐丧失^1-三在纤维生成激活过程中，肝星状细胞（HSC）和门脉/血管周肌成纤维细胞（MF）上调其各种ECM成分的生成，如I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白，非胶原蛋白如纤维连接蛋白和tenascin，自体/旁分泌纤维生成因子如TGFβ1，以及其他与纤维生成有关的分子，如TIMP-1，它是ECM降解基质金属蛋白酶（MMPs）的主要抑制剂^4-7此外，活化的Kupffer和增殖的胆管上皮细胞是纤维生成生长因子和某些ECM分子的重要来源，这些分子驱动HSC和MF活化，导致胆道和其他形式的纤维化^8-11.

整合素是一种由α和β亚基组成的细胞受体，形成至少24种不同的二聚体，主要介导细胞-细胞和细胞ECM的相互作用^12,13整合素αvβ6在某些上皮细胞中表达，但在非上皮细胞中几乎不表达^14-16它在发育过程中受到调节，在分化的成人上皮中下调，在受损和发炎的上皮中重新表达。由于β6亚单位仅与普遍表达的αv链结合，其合成对αvβ6表达具有速度限制¹⁷αvβ6介导细胞对纤维连接蛋白的粘附¹⁵它可以成为主要的粘附受体¹⁴以及主要在伤口愈合和迁移过程中表达的tenascin¹⁸整合素的作用之一是在伤口愈合过程中促进上皮细胞增殖^19,20或致癌²¹在培养的气道上皮细胞中，TGFβ上调了β6的表达²².

整合素αvβ6在器官发生过程中大量存在于肺、皮肤和肾脏中¹⁶在成人肾脏中，在炎症反应和修复过程中，如慢性肾盂肾炎，由肾小管上皮细胞重新表达。皮肤中β6亚基的过度表达导致慢性伤口的形成²⁰在β6转染的口腔鳞癌细胞中，αvβ6在mRNA和蛋白水平下调间质胶原酶MMP-13的表达²³有趣的是，TGFβ1及其潜伏相关蛋白的非活性复合物是整合素αvβ6和αvβ6-表达细胞的配体，促进了TGFβ1-的空间限制性激活²⁴因此，缺乏这种整合素的小鼠表现出明显的皮肤和肺部炎症²⁵防止肾小管间质纤维化²⁶这些数据表明通过整合素αvβ6在体内局部调节TGFβ1功能的新机制。

我们的目的是评估αvβ6整合素在肝纤维化形成中的作用，在体外检测αvβ6整合素抑制的作用，并在原发性和继发性胆道纤维化的啮齿类动物模型中使用高度特异的非肽类αvβ6-整合素拮抗剂评估其药物抑制的治疗潜力。

材料和方法

材料

如果没有其他说明，所有化学品都是从西格玛获得的，并且具有可用的最高纯度。

非肽类αvβ6整合素拮抗剂EMD527040（3-{（S）-3-苄氧基-2-[5-（吡啶-2-氨基）-戊酰氨基]-丙酰氨基}-3-（3,5-二氯苯基）-丙酸，Mr 587.5）由默克公司（德国达姆施塔特）开发合成^27-29。该化合物尚未上市。与αvβ3和αvβ5整合素（IC）>9.5μM相比，它在6nM时抑制重组αvβ6与纤维连接蛋白的结合₅₀)与αvβ3和αvβ5整合素>50μM相比，αvβ6表达细胞在1.6μM时附着于纤维连接蛋白（参见补充表1A、B). 将EMD527040以30mg/ml溶解在无菌DMSO/NaCl（2:1）储备溶液中。

动物实验

大鼠实验由埃朗根-纽伦堡大学动物护理和使用委员会批准，小鼠实验由贝思以色列女执事医疗中心机构审查委员会批准。动物被安置在12小时的光-暗循环中，水和标准大鼠/小鼠颗粒随意进食。

胆管结扎术

如前所述，通过胆管结扎（BDL）和切断，在体重230-250g的成年雄性Wistar大鼠（Charles River，Sulzfeld，德国）中诱导继发性胆道纤维化^30,31BDL后一周，动物被分为4组：1。sham（腹部中线切开闭合）+vehicle（n=4），2。BDL+车辆（n=8），3。20mg/kg/天时BDL+EMD527040（n=7），60mg/kg/天时（n=8）。EMD527040通过腹膜内（i.p.）注射给药。6周后，在乙醚麻醉下通过右心室穿刺和放血处死动物。将1-2g肝片固定在4%福尔马林中或在液氮中快速冷冻以进行进一步分析。

Mdr2（Abcb4）-/-小鼠

小管磷脂翻转酶缺乏的患者会发展为具有PBC和PSC特征的自发性胆道纤维化^32,33.MDR2-/-和MDR2+/+小鼠从Jackson实验室（ME Bar Harbor）获得，并从胚胎中繁殖。从4周龄开始，MDR2-/-小鼠接受静脉注射载体，或EMD527040，剂量为20mg/kg/天（n=4）。8周后，在麻醉（150mg/kg氯胺酮，20mg/kg二甲苯，腹腔注射）下通过心脏穿刺和放血处死小鼠。将肝脏标本固定在4%的福尔马林缓冲液中或在液氮中冷冻snap以进行进一步分析。

体内读数

标准肝功能测试

使用德国曼海姆（Mannheim，Germany）的Boehringer试剂盒和自动分析仪（BM/Hitachi 717），在埃尔朗根-纽姆堡大学临床化学系测量丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）和胆红素。

羟脯氨酸测定

肝羟脯氨酸的生化测定如前所述³³从左、右叶的两块snap冷冻肝脏切片（每块50-100mg）中提取。

肝脏组织学、免疫染色和形态计量学

用苏木精和伊红（H&E）、天狼星红、细胞角蛋白19（CK19）或Ki-67对5μm去蜡肝切片进行染色。用蛋白酶K（20μg/ml，42°C下20分钟）和10mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0，95°C下15分钟）进行抗原回收。对于抗β6免疫染色，冷冻肝组织或细胞培养物在−20°C的丙酮中固定5分钟，然后用0.6%H封闭₂O（运行）₂将2%的山羊血清、CK19的初级单克隆抗体（丹麦DAKO）、Ki-67（美国NeoMarkers）或αvβ6的小鼠多克隆抗体（瑞士Chemicon）按1:100稀释过夜，然后在RT和二氨基联苯胺检测中使用生物素化山羊抗鼠抗体（DAKO，1:350）45分钟（美国Vector Labs）。形态测量是在带有取样台和半自动进样器的光学显微镜下进行的（德国波恩Boskamp KG）。每段计数500点，计算CK19阳性细胞百分比³⁴在双染色切片中，每段CK19阳性胆管的Ki-67阳性胆管细胞数在4个显微镜下（40×）计数。评分是在不了解治疗的情况下进行的。

原位细胞死亡检测

根据制造商的建议（瑞士曼海姆罗氏原位细胞死亡检测试剂盒），通过脱蜡肝切片中的TUNEL反应研究EMD527040对BDL大鼠的诱导凋亡作用。人肝癌样本作为阳性对照。

定量实时PCR

将50-100mg（小鼠）或150-200mg（大鼠）肝组织匀浆于1ml RNA纯化液中（德国埃朗根PeqLab），并按所述分离总RNA³³模板cDNA是通过使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen，Karlsruhe，德国）和50pmol随机六聚体和100pmol寡核苷酸引物（Promega，Mannheim，德国）逆转录0.5μg总RNA获得的。在Light Cycler（罗氏公司）上通过实时PCR对相对转录物水平进行定量。TaqMan探针和引物组是根据已发表的序列设计的(补充表1)使用Primer Express软件（Perkin Elmer，Wellesley，USA）^33,35并在MWG Biotech（德国埃伯斯堡）合成).使用LightCycler软件对数据进行分析，并将数据归一化为看家基因β2微球蛋白（β2MG）。

体外实验

细胞和培养条件

以下细胞系在补充有10%胎牛血清（FBS）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen，Bern，Switzerland）的RPMI或DMEM中生长，并在37°C的5%CO中维持₂湿化空气：TFK-1人胆管癌³⁶、HepG2人类肝细胞癌（德国不伦瑞克DSMZ）、603B正常小鼠胆管细胞（日本仙台Y.Ueno博士馈赠）³⁷，MMNK-1人胆管细胞（日本冈山外科N.Kobayashi博士馈赠）³⁸。原代人胆管上皮细胞由英国伯明翰大学H.Crosby博士捐赠。根据先前发表的程序，从雄性Wistar大鼠（退役饲养员，450-500g，Charles River，Sulzfeld，Germany）中分离出原代大鼠肝星状细胞（HSC）³⁹使用完全激活的HSC（最重要培养14天）。

BrdU掺入分析

5×10⁴每个微孔（96个平板）的细胞被血清饥饿24小时，并用0.5%或10%胎牛血清（FBS）w/wt 10处理^-7或10^-6M EMD527040持续24小时。在最后4h内添加BrdU，并通过比色酶联免疫分析测定掺入量（德国曼海姆罗氏）。

细胞活力

5×10⁵将每个孔（12孔板）的细胞缺血清24小时，然后使用0.5%或10%FBS w/wt 10^-7或10^-6M EMD527040持续48小时。对台盼蓝染色（非活细胞）细胞进行计数，并表示为总细胞的%。

细胞粘附试验

5×10⁴细胞接种在纤维粘连蛋白涂层的96 well板上（1μg/孔，0.15cm²)重量10^-7或10^-6M EMD527040，在5μM钙黄绿素AM荧光酯酶底物存在下（Invitrogen，Basel，Switzerland）。37°C下30min后，分别在485nm和520nm的激发波长和发射波长下，在温和清洗前后测量细胞荧光，以评估粘附细胞的百分比。

TGFβ1体外活化

培养24小时后收集TFK-1细胞的上清液wt/wt 10^-8-10^-6M EMD527040在无血清条件下。使用人TGFβ1 ELISA（德国威斯巴登R&D Systems公司）测定活性TGFβ2，并事先用HCl活化或不活化以测定总的和生物活性的TGFβ3⁴⁰.

统计分析

使用Microsoft EXCEL软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准偏差。差异的统计显著性采用非配对、非参数Student t检验进行评估。

结果

αvβ6整合素在胆道纤维化中高度上调，并在增生的胆道上皮中表达

在患有BDL的大鼠和Mdr2-/-小鼠中，αvβ6整合素二聚体形成的速率相关的β6转录物上调了100倍，而正常啮齿动物显示出几乎无法检测到的水平，这证实了我们在Mdr2-//-模型中的先前发现²⁹(图1A). 与高增殖性肿瘤衍生的TFK-1胆管细胞相比，正常肝细胞和接近正常的永生化胆管上皮细胞没有或非常低地表达β6(图1B). 免疫组织化学显示正常肝脏和正常小鼠胆管细胞中缺乏αvβ6整合素(图1C、E)但在体内增殖胆管上皮和体外TFK-1细胞上高表达(图1D、F). 因此，选择TFK-1胆管细胞进行体外研究，最能反映体内胆管纤维发生中观察到的胆管细胞活化。

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图1

αvβ6整合素在正常和纤维化大鼠和小鼠肝脏以及各种肝细胞中的表达

实时PCR定量的速率限制β6转录水平：(A类)BDL治疗6周后的大鼠肝脏和8周龄MDR2-/-小鼠的肝脏，分别恢复到年龄匹配的假手术对照组和野生型对照组；MDR2-/-小鼠的数据来自^参考29; (B类)正常大鼠肝细胞（Hep）、大鼠肝星状细胞（HSC）、人胆管上皮细胞（BDEC）、正常人（MMNK-1）或小鼠（603B）胆管细胞系和活化的肿瘤衍生TFK-1胆管细胞，归一化为β2MG mRNA（相对于正常人BDEC增加了x倍）。平均值±SD*与相应对照组相比p<0.05。

假手术大鼠肝切片αvβ6免疫染色(C类)，患有BDL的大鼠(D类)或正常小鼠（603B）（E）和活化人（TFK-1）（F）胆管细胞。αvβ6蛋白在正常肝脏和603B胆管细胞中不存在，但在增生的胆管上皮细胞（红色）和TFK-1胆管细胞（棕色）中高度表达。所示为代表性图像（放大40倍）。

αvβ6整合素抑制改善胆道纤维化鼠的纤维化进展

用非肽类αvβ6拮抗剂EMD527040治疗胆管结扎大鼠，使其体重恢复正常，并使未经治疗的大鼠的肝脏重量显著减轻2倍(表1A). 同样，作为门脉高压替代物的脾脏重量在BDL后6周增加了2.6倍，在低EMD527040组和高EMD5270040组中分别呈剂量依赖性降低了32%和40%。未经治疗的BDL大鼠的肝胶原相对含量（羟脯氨酸，HYP）是假手术动物的4.3倍。20和60 mg/kg/天的EMD527040治疗分别使相对HYP降低15%和32%（p<0.05）。BDL大鼠的总肝HYP增加了约8倍，两个治疗组的剂量依赖性降低了32%和40%（p<0.05，表1A).

表1

用αvβ6整合素抑制剂EMD527040治疗的BDL大鼠和MDR2-/-小鼠的体重、肝脏和脾脏重量以及羟脯氨酸（HYP）测定*与BDL单独对照组相比，p<0.05。

A。 BDL大鼠。

	假（n=4）	BDL 5w（n=8）	EMD527040 20mg/kg 4w（n=7）	EMD527040 60mg/kg 4w（n=8）
肝脏重量，g	13.6±0.49	26.6±2.13	22.4±1.63*	19.6±2.6*
脾脏重量，g	0.89±0.08	2.34±0.51	1.58±0.27*	1.42±0.3*
体重，增加%	29	11	16	19
相对HYP，μg/g	182.7±8.9	784.0±202.6	668.6±258.7	538.8±37.1*
总HYP，mg/肝	2.49±0.21	19.5±5.8	13.3±6.8	12.06±2.2*

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B。 MDR2-/-小鼠。

	MDR2-/-车辆4w（n=4）	EMD527040 20mg/kg 4w（n=3）
肝脏重量，g	2±0.08	1.55±0.13*
脾脏重量，g	0.13±0.01	0.06±0.01*
体重，克	21±0,6	20.4±1.57
相对HYP，μg/100mg	13.37±1.49	11.19±1.16
总HYP，μg/肝	228.45±27.18	163.60±21.28*

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表1C。*在有/无EMD527040的胆管结扎动物中测定血清肝标志物假手术大鼠（n=4），BDL 5周+载体4周（n=8），BDL5周+EMD527040 20 mg/kg/天4周（n=7）和BDL5周+EMD627040 60 mg/kg/日4周（n=8）动物与BDL单独组相比，p<0.05。

	假（n=4）	BDL 5w（n=8）	EMD527040 20mg/kg 4w（n=7）	EMD527040 60mg/kg 4w（n=8）
高度（U/L）	69±4.94	113.5±7.07	72.07±25.8*	81.76±23.1*
ALP（单位：升）	150.9±21.9	500.6±60.1	291.4±63*	271.2±45*
AST（U/L）	77.1±12.7	407.4±76.6	253.8±95.4*	352±105.9
GGT（U/L）	4.0±0.01	93.05±13.5	43.3±8.9*	37.6±12.7*
胆红素（μmol/L）	0.12±0.01	14.3±1.08	7.27±1.19*	9.2±1.24*

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BDL大鼠的结果在MDR2-/-小鼠中得到证实。用20mg/kg/d的EMD527040治疗4周后，肝脏和脾脏重量分别显著减轻22%和50%（p<0.05，表1B).

αvβ6拮抗剂对胆管结扎大鼠肝脏组织学的影响

胆管结扎导致晚期门脉纤维化，增生胆管周围胶原积聚，扩张门脉区域内肌成纤维细胞数量增加(图2A、B). EMD527040以20和60 mg/kg/d剂量依赖性地治疗BDL大鼠，减少组织学胆管增生，伴有胶原沉积和桥接纤维化间隔(图2C，D). 在EMD527040治疗的MDR2-/-小鼠中观察到类似的组织学改善(图2E、F).

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图2

αvβ6抑制剂对胆道纤维化鼠肝组织学的影响

将啮齿类动物的肝脏切片进行福尔马林固定，并用天狼星红对胶原蛋白进行染色。A类：假手术大鼠；B类：BDL大鼠5周+赋形剂4周；C：BDL 5周+EMD527040 20mg/kg/天，持续4周；医生：BDL 5周+EMD527040 60mg/kg/天，持续4周（放大40倍）。电子：MDR2-/-小鼠+载具；F类：MDR2-/-小鼠+EMD527040 20mg/kg/天，持续4周（放大10倍）。所示为代表性图像。

αvβ6抑制可减轻胆道纤维化中胆管过度增殖，但不诱导凋亡

形态计量学定量CK19阳性胆管上皮细胞的百分比。BDL治疗6周后，胆管细胞数量增加了60倍，αvβ6拮抗剂对其抑制的剂量依赖性高达40%(图3). CK19和增殖标记物Ki-67的双重染色显示，在接受两种剂量αvβ6拮抗剂的动物中，活跃增殖的胆管上皮细胞数量减少了>50%(图4A-C). BDL大鼠Ki-67阳性肝细胞的数量也增加了（<2%），但治疗并未改变（数据未显示）。在体外，EMD527040剂量依赖性地抑制TFK-1胆管细胞的增殖(图4D)而非正常小鼠胆管细胞、原发性肝星状细胞或HepG2肝癌细胞(图4E、F,补充图1). EMD527040治疗纤维化动物或各种肝细胞在体内外均未诱导凋亡(补充图2和3).

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图3

抑制αvβ6对大鼠胆道纤维化胆管上皮细胞数量的影响

BDL后5周取肝，胆道上皮用CK19染色。(A类)操作不当；(B类)BDL 5周+车辆4周；(C类)BDL 5周+EMD527040 20mg/kg/天，持续4周；(D类)BDL 5周+EMD527040 60mg/kg/天，持续4周。电子邮箱：采用点计数法（M&M）定量胆管上皮细胞数量。数据表示为每个肝脏切片CK19阳性细胞的百分比（放大10倍），（平均值±标准偏差），*与BDL相比p<0.05。

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图4

αvβ6抑制剂对体内外胆管细胞增殖的影响

对CK19和Ki-67进行双重染色，CK19和Ki-67阳性细胞分别呈棕色和深灰色。(A类)BDL 5周+车辆4周；(B类)BDL 5周+EMD527040 20mg/kg/天，持续4周；(C类)BDL 5周+EMD527040 60mg/kg/天，持续4周。(D类)增殖性胆管上皮的百分比评估为Ki-67阳性细胞的数量除以胆管上皮的数量（CK19阳性），并以字段（任意单位）表示。每个肝脏切片评估4个视野（放大40倍），（平均值±标准差）*与单用BDL相比，p<0.05。TFK-1的增殖(电子)、原发性HSC和HepG2(F类)通过BrdU掺入w/wt与10^-7或10^-6M EMD527040持续24小时。平均值±SD*与10%FBS对照组相比p<0.05，^#与0%FBS对照组相比，p<0.05。

αvβ6抑制改善胆道纤维化炎症和胆汁淤积的血清标志物

BDL导致ALT、ALP、AST、GGT和胆红素显著升高。两种剂量的EMD527040均显著降低了ALT、ALP、GGT和胆红素水平(表1C).

αvβ6整合素抑制对纤维化相关基因表达的影响

BDL导致前胶原α1（I）（23倍）、TIMP-1（17倍）、TGFβ2（50倍）、αSMA（17.5倍）、转化生长因子β1（6,6倍）和CTGF（11.5倍）转录物显著上调，而MMP-3 mRNA表达保持不变。αvβ6整合素抑制剂剂量依赖性下调促纤维化转录物治疗(图5和补充图4). 因此，在60mg/kg/d的剂量下，EMD527040分别显著降低TGFβl、TIMP-1、前胶原α1（I）、CTGF和αSMA mRNA 24、25、35、45和61%。在较低和较高的抑制剂剂量下，TGFβ2 mRNA分别达到50%和70%的降低最为显著。在高抑制剂剂量下，未经治疗的动物肝脏中上调>100倍的αvβ6 mRNA也减少了70%，而MMP-3 mRNA则诱导了2倍。

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图5

EMD527040治疗继发性胆道纤维化大鼠肝纤维化相关基因的表达

用溶媒（n=8）、EMD527040（20mg/kg/天）（n=7）或EMD5270040（60mg/kg/天）治疗4周（n=9），分别测量假手术大鼠（n=4）或BDL治疗5周大鼠的转录水平。结果通过定量实时PCR获得，归一化为β2MG mRNA，并表示为与假手术组相比的x倍增加（平均值±SDs）*与单用BDL相比，p<0.05。

EMD527040阻断胆管细胞对纤维连接蛋白的粘附和固有TGFβ1的激活

纤维结合蛋白是胆管细胞的主要附着蛋白⁴¹αvβ6介导某些活化上皮与纤维连接和tenascin-C的粘附^15,18在纤维连接蛋白涂层板上孵育30分钟时，70%的TFK-1胆管细胞粘附在基质上，而与αvβ6抑制剂EMD527040孵育时，在10^-8M和10^-7M、分别(图6A).

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图6

αvβ6整合素抑制剂阻断人胆管细胞与纤维连接蛋白的粘附并减少内源性TGFβ1的激活

(A类)在EMD527040存在或不存在的情况下，将TFK-1胆管癌细胞粘附在纤维连接蛋白涂层孔上30分钟，并在520 nm处用钙黄绿素AM荧光测定粘附细胞。收集上清液，通过ELISA检测内源性激活的TGFβ1，以检测激活的人TGFβ(B类)或用1 N HCl化学活化后测量总TGFβ1(C类). 自发活化的TGFβ1与总TGFβ1的比率反映了内源性TGFβ1活化的百分比（每组n=6，平均值±SD）*与未治疗对照组相比p<0.05。

在加入或不加入αvβ6拮抗剂孵育24小时后，在TFK-1胆管细胞条件培养基中测量自身/旁分泌TGFβ1的激活。EMD527040剂量依赖性地将TGFβ1活性与总活性的比例从11%降低到5%，对应于内源性TGFβl活化减少50%(图6B和C).

讨论

整合素αvβ6在某些活化的上皮细胞上表达，在组织损伤后，在伤口愈合中高度上调^16,19,20,24以及某些类型的上皮癌⁴²缺乏这种整合素的小鼠对诱导肺纤维化有抵抗力²⁴这表明αvβ6在慢性伤口愈合、肺纤维化进展和近期肝纤维化中起着重要作用^29,43因此，我们描述了β6整合素在人类和小鼠肝纤维化中的显著诱导作用，以及Mdr2（Abcb4）-/-小鼠在应用单剂量EMD527040的²⁹然而，缺乏有或无靶向药物干预的深入机制研究。在这里，我们研究了这种整合素在两种长期鼠肝纤维化模型和胆管细胞中的表达和功能作用在体外.

大鼠胆汁性肝硬化（BDL）和小鼠PSC样胆道纤维化（Mdr2（abcb4）-/-)导致限速β6整合素转录物上调近100倍从头开始的增殖性胆管上皮细胞中αvβ6蛋白的表达被认为是胆道纤维化进展的主要驱动力^8-10这表明这种整合素在维持增生（胆管）上皮表型方面发挥着重要作用，有利于慢性伤口的形成^20,44是进行肝纤维化形成的先决条件^2,三.

在BDL所致继发性胆道纤维化的大鼠模型中，非肽类αvβ6整合素拮抗剂EMD527040以20和60mg/kg/d剂量依赖性的方式治疗可减少肝纤维化，如相对胶原含量和总胶原含量所示。伴随着显著的组织学改善，即桥接间隔消失，门脉周围纤维化、肌成纤维细胞和增生的胆管上皮细胞减少。总之，肝脏重量和脾脏大小（门脉高压的间接测量值）呈剂量依赖性降低。治疗还显著降低了ALT、AST、ALP、GGT和胆红素，即肝脏炎症和胆汁淤积的替代标记物。这些有利的结果可以在MDR2-/-小鼠中复制。与低剂量组相比，高剂量EMD527040与AST和胆红素的适度增加相关，仍低于未治疗组，这可能表明轻度肝毒性。

在大剂量EMD527040治疗的继发性胆道纤维化大鼠中，通过CK19染色和细胞计数量化的胆管细胞数量减少了40%。另一方面，根据Ki-67和CK19双阳性细胞的数量评估，在两种抑制剂剂量下，增殖胆管上皮细胞的数量减少了50%，而凋亡未受影响，表明抑制剂主要阻止胆管细胞增殖。我们的体外实验证实，EMD527040选择性地减弱活化胆管细胞对纤维连接蛋白的粘附和随后的增殖，但不诱导胆管细胞凋亡。值得注意的是，EMD527040并未影响其他肝细胞。

与对肝纤维化、结构和肝功能的有利作用一致，αvβ6整合素拮抗剂显著降低了肝促纤维化转录物的水平，如前胶原α1（I）、αSMA、TGFβ1、TGFβ2、CTGF、TIMP-1和αvβ6整合素本身。TGFβ1和TGFβ2都被认为是关键的纤维生成细胞因子，TGFβl由多种（活化的）细胞合成，包括HSC、肌成纤维细胞、炎症细胞，低水平由胆管上皮细胞和（过渡）肝细胞合成^2,7而TGFβ2转录物仅限于活化的胆管上皮细胞⁸TGFβ2 mRNA下调70%，而TGFβ1转录物仅下调20%。这突显了αvβ6整合素作为活化胆管上皮靶点的高度特异性，以及我们在研究中使用的非肽类αvβ5抑制剂的高度专一性。

此外，αvβ6的抑制导致纤溶转录物MMP-3 mRNA适度上调2倍。MMP-3降解许多非胶原基质成分，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白，但也降解变性胶原蛋白和天然III、IV和v型胶原蛋白⁴⁵间质前胶原酶（proMMP-1）和前天门冬氨酸酶B（proMMP-9）被蛋白水解激活为其活性酶原^6,46.

TGFβ1被合成并表达为一种生物活性或潜在的复合物，必须连接到细胞表面并被蛋白酶（如纤溶酶）激活⁴⁷细胞表面活化通过潜在的TGFβ1或其结合蛋白与IGFII受体、血小板反应蛋白-1或组织谷氨酰胺转胺酶的相互作用发生^48-50整合素αvβ6最近被鉴定为TGFβ1的一个重要辅活化因子，但不是TGFβ2的一个辅活化因子。TGFβ2中不包含Arg-Gly-Asp序列，而Arg-Gly-Asp序列是与αvβ5相互作用以促进裂解为具有生物活性的TGFβ所必需的^24,51,52在该系中，β6转基因小鼠出现了慢性纤维化皮肤溃疡，其中含有大量活化的成纤维细胞，并表达较高水平的活性TGFβ1²⁰.给，10^-6EMD527040的M在体外使胆管细胞TGFβ1的活化减少了50%以上，这表明这有助于其在体内的抗纤维化活性。此外，与EMD527040存在下（普遍存在的）TGFβl转录物的适度下调相比，（胆管细胞衍生的）TGF-β2转录物的显著体内下调表明对胆管细胞有直接影响。这可以通过EMD527040治疗的胆道纤维化啮齿类动物中活化的胆管细胞减少得到支持，这可能是通过抑制胆管细胞对基质基质纤维连接蛋白的粘附^15,18,41因此，胆管细胞对纤维连接蛋白粘附的减弱和内源性TGFβl活化似乎都有助于体内抑制αvβ6的抗纤维化作用。

总之，我们可以证明整合素αvβ6在活化的胆管细胞中唯一上调，并在胆道纤维化的进展中发挥重要作用。非肽类特异性拮抗剂对αvβ6整合素的抑制显著抑制了原发性和继发性胆道纤维化的进展，并伴随着促纤维化基因的下调。虽然TFK-1细胞系的使用在一定程度上限制了我们的结论，但αvβ6拮抗剂通过抑制TGFβ1的激活和胆管细胞对纤维连接蛋白的粘附来发挥作用，从而减弱其增殖和成纤维潜能，包括显著的TGFβ的产生和激活。这使整合素αvβ6的特异性口服抑制剂（如EMD527040）成为治疗（胆道）纤维化的一类新型抗纤维化药物。

补充材料

01

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致谢

拨款支持：这项工作的一部分得到了德国研究协会（DFG）Schu 646/14-1的资助，DFG研究生院GRK-750对E.P.的奖学金，以及欧洲肝脏研究协会（EASL）对Y.P.的Sheila Sherlock奖学金的支持。

缩写

巴西存托凭证	胆管结扎术
发动机控制模块	细胞外基质
海普	羟脯氨酸
基质金属蛋白酶	基质金属蛋白酶
TIMP公司	金属蛋白酶组织抑制剂

脚注

利益冲突/财务披露：无需申报

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