UHRF1与H3K9甲基化的关联指导DNA甲基化的维持

细胞培养和操作

HeLa细胞（ATCC）在添加有10%胎牛血清（PAA）的最小必需培养基（Invitrogen）中培养，并在37°C培养箱中保持5%CO₂，每2-3天进行一次。E14和NP95−/−小鼠ES细胞（来自RIKEN的Haruhiko Koseki的礼物）在0.1%明胶（Sigma）上培养，在格拉斯哥的最小必需培养基（Invitrogen）中添加15%的ES-fetal牛血清（PAA）、50单位/mL白血病抑制因子（Millipore）、2 mM L-谷氨酰胺（Invitrone）、0.1 mM非必需氨基酸（Invitorgen）、，55µMβ-巯基乙醇（Invitrogen）、1 mM丙酮酸钠（Invit罗gen）和1×青霉素-链霉素溶液（Invitorgen），保存在含有5%CO的37°C培养箱中₂，每2天通过一次。用0.05µg mL同步HeLa细胞有丝分裂⁻¹诺卡唑16小时。对于双胸腺嘧啶核苷阻断，HeLa细胞通过2 mM胸腺嘧啶核素（Sigma）处理16小时，然后释放8小时，再使用2 mM胸苷再处理16小时进行同步化。根据制造商的协议，使用TurboFect（发酵剂）进行瞬时转染。补充图5描述了从RNAi联盟（TRC）获得的shRNAs。并按照标准的TRC慢病毒生产和感染协议使用。MG132（Cayman Chemicals）或0.05µg mL的指示浓度⁻¹在收获前的最后16小时内，添加DMSO中的诺卡唑（Sigma）。

组蛋白肽微阵列

按照所述进行阵列制作和效应蛋白分析^25，26。热图是使用Java TreeView生成的。

溶解肽下拉菜单

在含有50 mM Tris-HCl、pH 8.0、300 mM NaCl和0.1%NP-40的结合缓冲液中平衡50µL链霉亲和素磁珠（NEB）浆液，然后用1 nmole生物素化肽在4°C下旋转饱和1小时。用结合缓冲液清洗未结合肽，并在4°C下旋转培养100 pmoles蛋白质（在补充有0.5%牛血清白蛋白（BSA）（w/v）的结合缓冲液中）3小时。用结合缓冲液洗涤未结合蛋白，在1×SDS负载缓冲液中煮沸，从珠中洗脱结合蛋白和肽，然后进行western blot检测。用抗HIS（UHRF1）和抗GST（MPP8）检测蛋白质，用抗链霉亲和素-HRP检测肽。

荧光偏振

如所述合成荧光偏振肽（组蛋白H3，残基1–20）²⁵在N末端添加5-羧基荧光素（5-FAM）。在黑色平底384孔板（Costar）中进行40µL体积的结合分析。在含有20 mM Tris-HCl、pH 8.0、250 mM NaCl、1 mM DTT和0.05%NP-40的缓冲液中用50 nM肽滴定蛋白质。在25°C下经过20分钟的平衡期后，使用480 nm激发过滤器和520/530±10 nm发射过滤器在POLARstar Omega（BMG Labtech）上读取板。平行（||）和垂直（）通道中的增益设置被校准为在没有蛋白质的情况下荧光肽的100毫极化单位（mP）的偏振测量。极化（P）由平行和垂直通道的原始强度值确定，使用方程式P=||−б/||+2（），并使用方程式A=2P/3–P转换为各向异性（A）单位。平衡离解常数（K_d日)通过使用GraphPad Prism 5.0将各向异性曲线拟合到单位点结合模型来确定。

核磁共振波谱和数据分析

通过监测¹H（H）-¹⁵均匀的N个HSQC光谱¹⁵仅N标记的TTD结构域（0.45 mM）和过量的未标记H3肽（ARTKQTARK9me3/S10pT）。将未标记肽的等分试样以1:5的摩尔比滴定到标记的TTD结构域中，直到在¹H（H）-¹⁵N HSQC光谱。在25°C下，在20 mM NaPi、pH 7.0、250 mM NaCl、2 mM DTT、1 mM苯甲脒、0.5 mM PMSF中记录HSQC光谱，并补充10%（v/v）D₂布鲁克·阿凡斯800-MHz光谱仪上的O。与H3K9me3/S10p肽结合的TTD的复合化学位移扰动值（与含有H3K9 me3和未磷酸化S10肽的TTD相比²⁰)使用方程式Δ计算_comp公司= [Δδ²_海南+ (Δδ_N个/6.5)²]^1/2.

利用TTD与非磷酸化肽（PDB:2L3R）复合物的核磁共振溶液体系，建立了与组蛋白H3肽（ARTKQTARK9me3/S10pT）结合的TTD模型²⁰)作为开始合奏。然后，我们使用CNS（1.3版）在显式水中重新定义结构，但Ser10侧链磷酸化，并包括所有实验性蛋白内和蛋白肽限制。共有三个代表性模型显示了H3S10p的不同方向，如所示图2a.

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图2

UHRF1 TTD对H3S10磷酸化不敏感的结构基础

(一)¹⁵N个-¹UHRF1 TTD的H异核单量子相干（HSQC）光谱单独（灰色）或在H3S10p不存在（红色）或存在（绿色）的情况下添加H3K9me3肽。(b条)在没有或存在H3S10p的情况下结合H3K9me3后，UHRF1 TTD结构域的复合化学位移变化（Δδ）与残数的关系。无法分配的脯氨酸和残基未在柱状图上显示。添加肽后峰消失的残基（Asn147）的值为零。柱状图上列出了受强烈影响的残留物（Glu193、Lys233）。(c（c）)在S10p存在下结合到H3K9me3肽的UHRF1 TTD的表面表现。与仅含有H3K9me3肽（PDB:2L3R）的残基相比，具有显著化学位移扰动值（深绿色）或缺失（浅绿色）的残余物呈彩色。(d日)结合到H3K9me3肽（粉红色主干）（PDB:2L3R）的UHRF1 TTD（带状表示）的三个核磁共振模型重新定义为也包含H3S10p（红色空间填充）。(e（电子）)结合到含H3K9me3肽（蓝色）的UHRF1 TTD（PDB:3DB3）的晶体结构。芳香笼状残留物用洋红表示，与H3S10相互作用的残留物则用绿色棒表示。(如果)在缺少（蓝色）或存在（红色）H3S10p的情况下，用指示的蛋白质结构域对H3K9me3肽进行荧光偏振结合分析。三个独立实验的误差表示为±s.d。对于这两个绘图，y轴的比例相同。

染色质分馏

从异步生长的HeLa细胞中分离出染色质和相关蛋白³⁸进行以下修改：在含有10 mM PIPES、pH 7.0、300 mM蔗糖、100 mM氯化钠、3 mM氯化镁的冷缓冲液中进行细胞裂解和清洗步骤₂，1×EDTA游离蛋白酶抑制剂（Roche），1×磷酸酶抑制剂混合物（Sigma）和0.1%Triton X-100。染色质组分在western blot分析之前用苯酶（Sigma）处理。H3和β-微管蛋白抗体对照组监测分馏的纯度。

UHRF1对H3S10p不敏感的结构基础

我们推断，了解UHRF1 TTD对H3S10p不敏感的结构基础可能使我们能够从有丝分裂染色质中解偶联UHRF1，并探索其潜在的有丝分裂功能。我们之前表明，UHRF1通过其TTD识别H3K9me3组蛋白肽，H3K9组蛋白3位于标准芳香笼中²⁰为了从机理上解释UHRF1对H3S10p缺乏敏感性，我们首先在一个含有短H3肽（残基6-11，TARK）的复合物中获得了TTD的晶体结构_{甲基丙烯酸甲酯}S公司_第页T） 。虽然我们能够观察到适合芳香族笼的H3K9me3残基的清晰电子密度，但相邻H3S10p残基的电子密度很弱，这表明该侧链有多种构象（数据未显示）。

接下来我们研究了UHRF1 TTD与双修饰H3肽（残基1-11，ARTKQTARK）的相互作用_{甲基乙基酮3}S公司_第页T） 使用核磁共振波谱，并将结果与我们之前报道的以非磷酸化形式与相同肽结合的UHRF1 TTD溶液系综进行比较²⁰(图2a，b). 与非磷酸化肽相比，当在S10p存在下与H3K9me3肽结合时，UHRF1 TTD的三个残基（Asn147、Glu193和Lys233）与H3K9me3肽类结合时，仅有显著的化学位移差异，表明这两种肽-蛋白质复合物具有相似的亲和力并采用相似的构象。化学变化的关键是¹⁵N个-¹Asn147的H共振，其侧链在非磷酸化肽-蛋白质复合物中最接近S10(图2c). 如我们的x射线数据所示，这种消失可以通过H3S10p附近核磁共振时间尺度上的中间构象交换来解释，这意味着当在S10p存在下与H3K9me3结合时，Asn147采用了一种改变的构象，这可能对UHRF1 TDD相互作用很重要。

为了更好地理解H3S10p与TTD结合时的潜在构象，我们重新定义了H3K9me3（PDB:2L3R）配合物中UHRF1 TTD的NMR溶液系综²⁰，但使用H3S10p。H3K9me3与S10p络合物的结合表明，磷酸丝氨酸侧链可以通过向外旋转到溶剂中来调节，同时保持在未磷酸化肽溶液结构中观察到的所有实验性蛋白内和蛋白肽NOE（核overhauser效应）值(图2d). 合奏还解释了¹⁵N个-¹Glu193的H共振，可能受到H3S10p构象子集的影响。

UHRF1 TTD（PDB:3DB3）晶体结构的比较²⁰) (图2e)，MPP8色域（PDB:3QO2³¹)和HP1α色域（PDB:1KNE³²)在与H3K9me3肽的复合物中，鉴定出一个保守的带负电荷的谷氨酸残基，该残基与H3S10具有相似的方向和接近性（小于3℃），作为UHRF1 TTD的Asn147。结合我们的核磁共振结果显示Asn147在含有H3K9me3和S10p的肽存在下发生了化学位移，我们合理地认为，Asn 147突变为谷氨酸或天冬氨酸会在H3S10p附近产生排斥负电荷，并使UHRF1 TTD对“磷酸/甲基开关”敏感事实上，UHRF1 N147E和UHRF1 N1 47D突变将双修饰肽的结合亲和力降低了几个数量级，同时对H3K9me3肽的结合影响最小(图2f). 重要的是，HP1αE53N和MPP8 E91N突变完全消除了这些结构域与H3K9me3的结合（数据未显示），表明H3S10通过这种保守的谷氨酸进行色域协调。总的来说，蛋白质-肽复合物的晶体和核磁共振结构与诱变研究相结合表明，UHRF1 TTD能够以几乎相同的构象与磷酸化和非磷酸化的H3K9me3肽结合，他们认为H3S10p可能在与H3K9me3结合时探索Asn147附近的多个溶剂暴露构象。

UHRF1通过有丝分裂结合H3K9甲基化以维持5mC

接下来，我们试图确定使UHRF1 TTD对“磷酸/甲基开关”敏感的UHRF1 N147E突变是否在体外会影响UHRF1结合有丝分裂染色质的能力。同时，我们检测了一个不能结合H3K9me3的UHRF1芳香笼突变体UHRF1 Y188A的染色质关联在体外²⁰UHRF1 N147E“开关”和UHRF1 Y188A“笼”突变体(图3a)在HeLa细胞中瞬时表达48小时，由此产生的异步和诺卡唑阻滞细胞被生化分离成富含染色质的可溶部分。UHRF1 Y188A无法结合大块染色质(图3b)即使其完整的SRA（结合CpG二核苷酸^17——19)和PHD域（结合到未修饰的H3 N末端³³)因此，表明UHRF1与H3K9甲基化的结合对其与染色质的关联至关重要。重要的是，尽管UHRF1 N147E与异步染色质结合，但与野生型UHRF1相比，其与诺可达唑阻滞的有丝分裂染色质的结合受到干扰(图3b). 综上所述，这些结果表明，与其他H3K9效应蛋白相比，UHRF1 N147E赋予UHRF1对“磷酸/甲基开关”的敏感性(图1)并表明H3K9甲基化在UHRF1与染色质的关联中起着关键作用。然而，H3K9甲基化和/或UHRF1的有丝分裂结合是否有助于其在DNA甲基化维持中的功能仍有疑问。

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图3

有丝分裂中UHRF1的染色质靶向是维持DNA甲基化所必需的

(一)UHRF1领域地图。图中显示了突变的残留物。(b条)异步和有丝分裂阻滞HeLa细胞裂解物的Western blot分析，生化分离为染色质和可溶性部分。模拟表明没有DNA控制。(c（c）)小鼠UHRF1（NP95）野生型（E14）或敲除胚胎干细胞的免疫荧光。误差表示为±标准误差(d日)与野生型和突变型UHRF1基因互补后，对照组和UHRF1敲低HeLa细胞的免疫荧光染色。模拟表明没有DNA控制。误差表示为±标准误差(e（电子）)HeLa细胞中的遗传互补d日然后进行亚硫酸氢钠转化，并对核糖体DNA位点基因间间隔区中的CpG岛进行测序（IGS rDNA；见图6）。单个CpG位点表示为黑色（甲基化）或白色（非甲基化）圆圈。误差表示为±标准误差。

过去的研究^15，16，33和我们实验室的结果(图3c、d)已经表明，小鼠UHRF1（NP95）基因敲除和UHRF1基因敲除导致全球DNA甲基化水平降低。特别是，对小鼠的研究表明，UHRF1与DNMT1发生物理相互作用，并可能促进其向染色质的募集^15，16因此，我们假设UHRF1和H3K9甲基化之间的相互作用可能是维持细胞DNA甲基化所必需的。为了验证这个假设，我们首先用shRNA稳定地敲除HeLa细胞UHRF1(补充图2c、d)并通过免疫荧光分析全球DNA甲基化，显示5-甲基胞嘧啶（5mC）染色减少58%(图3d). 野生型UHRF1瞬时表达48小时后，5mC水平恢复到对照细胞中测量值的69%。然而，UHRF1 Y188A芳香笼突变体无法恢复5mC水平，首次证明UHRF1的H3K9甲基化结合功能是DNA甲基化维持所必需的。此外，UHRF1 N147E“磷酸/甲基开关”突变体只能部分恢复全球5mC水平，这表明UHRF1到H3K9甲基化的有丝分裂结合也有助于DNA甲基化的维持。

我们通过查询核糖体DNA基因间间隔区（IGS rDNA）5'端21个CpG二核苷酸的甲基化状态，进一步研究了DNA和组蛋白甲基化之间的联系(补充图3). 该CpG岛的甲基化被证明受UHRF1调节¹⁵在非靶向对照shRNA-HeLa细胞系中，该位点甲基化了87.3%，UHRF1 shRNA将DNA甲基化水平降低到37.7%(图3e). 与我们通过5mC染色进行的全球分析类似，野生型UHRF1 WT的瞬时表达将该位点的DNA甲基化恢复到对照的62.3%。然而，UHRF1 Y188A和UHRF1 N147E均未恢复该位点的DNA甲基化(图3e). 总之，这些结果表明，在有丝分裂过程中，UHRF1与H3K9甲基化的关联对于维持HeLa细胞中的DNA甲基化至关重要。

我们感谢斯特拉尔实验室的成员进行了有益的讨论，并感谢H.Fried（北卡罗来纳大学教堂山分校）对手稿的批判性阅读。我们还感谢北卡罗来纳州生物技术中心（NCBC）和北卡罗来那大学医学院支持在北卡罗莱纳大学教堂山建立高通量肽合成和阵列核心设施。这项工作的部分支持来自国家卫生研究院（GM085394）对B.D.S.和（T32CA09156）对S.B.R.的研究拨款，NCBC（2010-IDG-I003）对B.D.S.和德克萨斯州癌症预防研究所（RP110471）对M.T.B.的研究拨款。