肝脏创伤愈合反应的多代表观遗传适应

摘要

创伤愈合是一个复杂的多步骤、多细胞的过程，发生在所有后生动物身上，它们在环境损伤造成的创伤或损伤后恢复组织结构和功能。在胚胎发生期间，哺乳动物修复伤口的效果显著，且不会形成疤痕（纤维化）^1,2相比之下，衰老的哺乳动物很容易受到慢性创伤形式的损伤修复，或者受到以纤维组织逐渐沉积为特征的不受控制的创伤愈合。在人类中，这种偏离最佳组织修复的现象是威胁生命和年龄相关疾病（包括癌症和组织纤维化）发展的基础^三–5假设遗传和环境因素的组合决定了个体对受损或不受控的创伤愈合及其相关病理后果的易感性的观察差异。然而，影响创伤治疗效率及其结果的遗传特征和表观遗传机制的性质仍不明确。

肝硬化是一种复杂病理学的例子，在患者群体中具有高度的变异性^6–8大多数慢性肝病（CLD）患者的病理有可能发展为肝硬化，但只有少数（10-20%）患者会发展成这种危及生命的终末期疾病。小鼠模型表明，遗传对慢性阻塞性肺病疾病进展的影响是复杂的，可能涉及多个低影响变体的相互作用。另一种假设是，暴露于环境因素（包括微生物和外源性物质）可能触发适应性表观遗传机制，影响肝脏创伤愈合的调节。适应性表观遗传机制可能包括DNA甲基化的改变、组蛋白的翻译后修饰和非编码RNA对基因表达的控制^9–13由于这些表观遗传特征可能变得稳定，因此有可能通过有丝分裂和减数分裂途径对适应性性状进行非遗传传递，后者可实现表观遗传编程性状的代际遗传。在这项研究中，我们验证了这样一个假设，即肝脏创伤治疗中的群体变异可能受到通过遗传表观遗传特征在世代间传递的环境诱导适应性特征的影响。

结果

祖先肝脏损伤促进肝脏创伤治疗的适应

为了验证我们的假设，我们开发了一个模型，用长辈成年雄性大鼠研究多代人对肝纤维化的影响(图1a)。通过选择远交动物，我们可以减轻遗传特征对伤口愈合的影响。我们研究通过雄性系传播的原理是为了避免母体因素对卵母细胞体成分或由子宫内环境，后者已知对后代有主要的表观遗传学影响¹⁴该模型涉及雄性大鼠被四氯化碳（CCl）肝毒素反复损伤₄)诱导慢性伤口愈合状态，导致纤维化^15,16在这些动物与未受伤的雌性动物配对繁殖之前，损伤的停止可以使纤维化自然消退(补充图1a和1b)。通过在F中重复此过程₁将对照组假（橄榄油）损伤动物纳入子代，我们生成了四组F₂有不同肝病家族史的男性(图1a)。A组无F组损伤史₁或F₀父系。B组来自受伤的F₁父亲和未受伤的F₀祖父。C组在F时有受伤史₀但不在F中₁生成。D组为男性，两个F组均有损伤₁和F₀.全部四名成人F₂然后，各组被CCl反复损伤₄并在最终CCl后24小时淘汰₄管理。所有四组的血清肝酶（ALT和AST）均升高，各组间无显著差异，表明肝细胞损伤程度相似(补充图1c)。来自H&E染色部分(图1b)病理分级组间坏死或炎症无明显差异(补充图1d)。Cyp2E1，参与CCl代谢的主要细胞色素p450蛋白₄反应性三氯甲基代谢物¹⁷，在A组和D组之间表达的水平与Cyp3A4相似，这也与CCl有关₄新陈代谢(补充图1e)。因此，祖先肝损伤和纤维化对CCl没有遗传影响₄代谢或其诱导的肝细胞损伤。

在单独的窗口中打开

图1

男性祖先的肝损伤降低了F组的肝纤维化₂雄性后代

a） 成年远交雄性大鼠被分为溶媒对照组和慢性肝损伤组。每组5只大鼠在纤维化高峰期收获，而每组5只大鼠在肝损伤完全恢复后繁殖。用F重复此程序₁产生雄性以产生F₂雄性被分为A组（F组无损伤₀或F₁)，B（受伤的F₁，未受伤F₀)，C（受伤的F₀，未受伤F₁)和D（两个F都受伤₀和F₁)。A-D组为慢性损伤组，在纤维化高峰时收集组织（也包括未损伤对照组）。b） A组至D组的天狼星红（胶原沉积）染色峰值纤维化肝脏的代表性图像。每排的面板显示三只单独的动物。比例尺，100μm。右侧面板-代表性H&E染色肝脏，显示所有组的肝损伤程度相当。c） A组至d组大鼠肝纤维化峰值中I型胶原的百分比面积和d）mRNA水平表达为相对转录差异水平（RLTD）。误差线为平均值±s.e.m（n=5）。统计分析；单因素方差分析（ANOVA），Tukey-Kramer后验。（*）p<0.05，（***）p<0.001。

为了评估伤口愈合，用天狼星红（SR）对肝脏切片进行染色，天狼星红选择性地与纤维化（I型和III型）胶原反应。代表性SR染色切片(图1b)说明A组的预期纤维间隔桥接网络。SR染色切片的形态分析显示，与A组相比，B组、C组和D组的纤维化基质水平降低(图1c)。对于C组和D组，F组出现纤维化₀代，很少观察到桥接性纤维化。与A组相比，B组肝I型前胶原转录表达略有下降，C组和D组分别下降50%和90%，后者达到统计学意义(图1d)。我们的结论是，祖先的肝脏损伤可以触发抑制肝脏创伤治疗反应的遗传适应性机制。此外，因为对于C组来说，这种适应的疾病触发因素是F组₀而不是F₁这种适应机制似乎可以跨代以及跨代的方式传播。由于每个连续世代之间传递的唯一生物材料是精子内的生物材料，因此成熟精子或生殖细胞中的表观遗传修饰很可能负责肝纤维化适应的代际传递。由于在我们的模型中，动物在受伤停止14天后交配，我们不知道延长延迟时间以产生新的生精波是否会导致适应性性状的丧失。如果是这样，那么适应将是暂时的，并且在机械上仅限于成熟精子中的事件。

肝肌成纤维细胞活化的适应性抑制

接下来，我们确定了祖先肝脏损伤对伤口愈合影响的细胞基础。肝纤维化的主要细胞驱动因素是平滑肌α-肌动蛋白（αSMA）阳性的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞在未受损的肝脏中罕见，但在病变肝脏中主要通过肝星状细胞的转分化（激活）积聚，肝星状上皮细胞具有高度增殖和促纤维化表型^18,19αSMA阳性肌成纤维细胞在桥接纤维隔膜的束内和坏死的气球状肝细胞附近观察到（染色组织中的深色斑块）(图2a)。手动计数αSMA阳性细胞显示，与A组相比，B、C和D组的肌成纤维细胞数量减少(图2b)。C组和D组动物的肝脏中肌成纤维细胞的数量分别为A组肝脏的50%和30%，这反映在肝脏αSMA mRNA丰度的减少(图2c)。B–D组肌成纤维细胞数量较少的可能解释包括肝星状细胞活化所需的炎症反应损伤或缺陷之前肝星状上皮细胞数量的发育减少¹⁹Desmin是静止和活化肝星状细胞的标记物，适用于量化正常和疾病肝脏中这些细胞的总数²⁰假损伤组A和D的肝脏含有相似数量的结蛋白阳性细胞，即大约8个细胞/场(图2d和f)。CCl公司₄损伤使A组和D组结蛋白阳性细胞数分别增加到26和13个/场(图2e和f)。这些数据反驳了对肝星状细胞数量的发育影响，相反表明其激活的调节受祖先肝脏损伤的影响。由于A组和D组的肝脏TNFα表达水平相似，因此肝脏炎症反应似乎不太可能存在显著差异(图2g)。此外，巨噬细胞（CD68）、T淋巴细胞（CD3）和中性粒细胞的手工计数并未表明四组大鼠之间炎症细胞募集的差异(补充图2a)。虽然这些数据并没有完全排除炎症的调节，但它们更支持抑制转分化的肝星状细胞表型的内在重编程。

在单独的窗口中打开

图2

慢性损伤中纤维生成反应的父传适应是通过肝脏中αSMA阳性肌成纤维细胞的减少介导的

a） a组至D组具有代表性的α-SMA染色肝纤维化峰值图像。每行面板显示三只单独的动物比例尺，100μm。b） A组至D组大鼠峰值纤维化肝脏中αSMA阳性细胞的平均数量和αSMA的c）mRNA水平表达为相对转录差异水平（RLTD）。误差线为平均值±s.e.m（n=5）。统计分析；单因素方差分析（ANOVA），Tukey-Kramer后验。（*）p<0.05，（**）p<0.01和（***）p<0.001。d–e）A组至d组结蛋白染色橄榄油对照组（d）和峰值纤维化（e）肝脏的代表性图像。每行面板显示两个单独的动物比例尺，50μm。f） 对照组或损伤组A、D结蛋白阳性细胞平均数统计分析；双尾学生t检验，（**）p<0.01。g） A组至D组大鼠峰值纤维化肝脏中TNFαmRNA水平表达为相对转录差异水平（RLTD）。误差线为平均值±s.e.m（n=5）。

为了探讨肝星状细胞转分化调控的分子基础，我们根据其在创伤愈合中的作用选择了候选基因。静止的肝星状细胞具有脂肪生成样表型，部分受核受体PPAR-γ和PPAR-α控制，在转分化过程中受到抑制²¹PPAR-γ的表达受到DNA-甲基化和MeCP2依赖的染色质重塑的抑制，这对肌成纤维细胞表型的产生至关重要²²与A组相比，B组、C组和D组PPAR-γ的肝脏表达升高(图3a)免疫印迹证实D组与A组肝脏中PPAR-γ蛋白水平升高(图3b)。PPAR-γ的这种差异表达是相关的，因为肌成纤维细胞的异位再表达可以将其表型逆转为更静止的状态^21,23此外，我们观察到C组和D组PPAR-α的表达增加(图3a)。相比之下，肝星状细胞激活过程中诱导的一种高度促纤维化因子——肝TGF-β1^24,25与A组相比，D组的TGF-β1表达降低了2倍，B组和C组也有TGF-？表达降低的趋势(图3a)。相比之下，TGF-β假受体Bambi或TGF-α1信号分子SMADs 1-6的表达没有差异，而D组抑制性SMAD7的表达是A组的5倍(图3c)。cDNA阵列分析确定了A组和D组之间表现出差异表达的额外基因(补充图2b)。在D组中显著过度表达或表达不足的基因中，有几个基因被认为是纤维化和/或肝星状细胞活化的调节因子，包括基质金属蛋白酶3（MMP3=+3.3倍）、IGF结合蛋白1（IGFBP1=+2.8倍）、分泌磷蛋白1（SPP1=+2.5倍）、，单切同源盒1/HNF6（ONECUT1=−4.8倍）和细胞因子信号抑制因子2（SOCS2=−2.4倍）^26,27我们得出结论，肝损伤对肝星状细胞中多个基因的转录控制具有代际影响。

在单独的窗口中打开

图3

受保护动物改变了肝脏中促纤维化和抗纤维化基因的表达

a） a组至D组大鼠峰值纤维化肝脏中PPAR-γ、PPAR-α和TGF-β1 mRNA水平表达为相对转录差异水平（RLTD）。误差线为平均值±s.e.m（n=5）。统计分析-A至D组的单向参数方差分析，Tukey Kramer后检验，其中（*）表示p<0.05。b） Western blot检测A组和D组峰值纤维化肝脏中PPAR-γ和βactin c）Bambi和SMADs 1至7的mRNA水平表达为A组至D组大鼠峰值纤维化肝脏的相对转录差异水平（RLTD）。误差线为平均值±s.e.m（n=5）。统计分析；学生的t检验（***）表明p<0.001。

肾纤维化不受祖先肝损伤的影响

从我们的观察中产生的一个问题是，肝脏纤维化是否会对后代的伤口愈合产生全球性影响。为了解决这个问题，我们生成了F₁有CCl病史的成年雄性大鼠₄-诱导父母肝纤维化（PLF）或控制父母假损伤（PSI）(图4a)。然后使用单侧输尿管梗阻（UUO）模型在PLF和PSI组诱导肾损伤。组织学SR(图4b和4d)和αSMA(图4c和4e)染色显示，两组动物的胶原蛋白沉积和肌成纤维细胞积累分别没有差异。由于PLF组在历史上与多代模型中的B组相似，这些动物将继承与I型胶原表达减少相关的抑制性肝脏创伤愈合反应(图1c和1d)和αSMA(图2b和c).

在单独的窗口中打开

图4

祖先损伤影响的纤维生成反应仅限于肝脏

a） 成年远交雄性大鼠被分为溶媒对照组和慢性肝损伤组。在肝损伤完全恢复后，每组饲养五只大鼠。繁殖周期（F1）产生的雄性受单侧输尿管梗阻（UUO）和术后7天采集的纤维化和对照肾（n=10）的影响。b） 和c）对照组和祖先肝损伤组大鼠对侧未损伤或梗阻肾脏的天狼星红（b）和αSMA（c）染色。d） 和e）对照组和祖先肝损伤组对侧未损伤或梗阻肾脏中天狼星红（d）和αSMA（e）阳性的百分比面积。误差线为平均值±s.e.m（n=7）。统计分析；学生t检验，其中d）中的（*）表示p=0.041，（**）p=0.028，e）中的（***）表示p<0.001。

从这个实验中，我们得出结论，祖先的肝脏损伤对纤维化没有全局影响。然而，更广泛的研究在多个器官中使用各种组织损伤模型，最好使用F₂将需要确定适应性反应是否受到组织限制。另一个需要注意的是，由于CCl之间组织损伤和修复机制的性质有很大不同₄以及UUO模型，在未来的研究中，确定不同的损伤、炎症和创伤愈合事件是否影响适应过程将非常重要。

表观遗传修饰调节肝肌成纤维细胞活化

尽管还没有确凿的证据证明适应性反应的分子基础，但观察到PPAR-γ和TGF-β1的肝脏表达在受损后代中受到调节是很重要的，因为这两个基因都是肝星状细胞表型的重要调节器。因此，我们推断，对这两个基因的表观遗传图谱的研究应该提供进一步的机制性见解。使用DNA甲基化敏感性限制性内切酶标测的初步实验表明，与A组相比，D组PPAR-γ的低甲基化和TGF-β1基因的高甲基化(补充图3a和b)。为了完善甲基化谱并确定特定CpG位点甲基化的差异，我们对大鼠PPAR-γ、PPAR-α和TGF-β1基因进行了定量序列特异性CpG甲基化（焦测序）分析(补充图4a–c)。通过PPAR-γ启动子的焦磷酸测序确定了20bp序列中五个连续CpG位点的甲基化改变(图5a)。在该序列的三个中心位点（CpG2、CpG3和CpG4），B组、C组和D组的甲基化降低。在每种情况下，D组的这些序列的甲基化水平最低，在最中心的CpG序列（CpG5）的情况下，我们在A组检测到7%的甲基化，而在D组中检测到2%的甲基化。PPAR-α启动子的类似分析确定了一个单一的CpG位点，该位点在B、C和D组中被低甲基化(图5b)。TGF-β1基因的焦磷酸测序发现四个CpG位点甲基化适度增加，其中内含子1区域的两个相邻CpG部位甲基化达到统计显著性(图5c)。由于DNA甲基化部分受DNA甲基转移酶的调节，我们测量了它们在肝脏中的Dnmt1、Dnmt3a或Dnmt3 b表达，但没有观察到差异(补充图5a)。我们也未能检测到脾组织中PPAR-γ启动子处CpG甲基化的差异(补充图5b)。这一发现表明，DNA甲基化的重塑在一定程度上是组织特异性的，尽管没有对其他器官和组织进行更广泛的检查，我们还不能确定这是否是一个肝脏特异性过程。

在单独的窗口中打开

图5

受保护动物肝脏中促纤维化和抗纤维化基因表达的改变是由DNA甲基化的差异所支持的

a） 通过焦磷酸测序法测定a至D组大鼠峰值纤维化肝脏中PPAR-γ启动子内特定CG二核苷酸的DNA甲基化。差异甲基化CG的位置如图表上方的示意图所示。差异以DNA甲基化百分比表示（n=5）。统计分析；单向参数方差分析，Tukey-Kramer后验。（*）p<0.05，（**）p<0.01和（***）p<0.001。b） 和c）如a）所示的焦磷酸测序确定了PPAR-α启动子（b）TGF-β1启动子和内含子1（c）中的DNA方法。差异甲基化CG的位置如图表上方的示意图所示。差异以DNA甲基化百分比表示（n=5）。统计分析；单向参数方差分析，Tukey-Kramer后验。PPAR-α和双尾Student t检验的（*）p<0.05和（***）p<0.001，TGF-β1的（**）表明p<0.01。d） A至d组大鼠峰值纤维化肝脏中PPAR-γ基因启动子和TGF-β1启动子乙酰化H3富集的ChIP分析。结果表示为折叠对照IgG（n=5）。统计分析；学生t检验，PPAR-γ和TGF-β1分别为p=0.0159（*）和p=0.0278（*）。

DNA甲基化可以调节基因转录的一种方式是模拟组蛋白乙酰化的基本状态，这会影响转录因子染色质的可及性²⁸定量染色质免疫沉淀（qChIP）分析显示，与A组相比，D组PPAR-γ启动子处的乙酰H3富集程度更高，而D组TGF-β1启动子处乙酰H3相对于A组降低(图5d)。因此，观察到的成纤维调节因子表达的适应性变化由DNA甲基化和相关组蛋白乙酰化的重塑所支持，因此抗纤维生成PPAR-γ有望变得更具转录许可性，而促纤维生成TGF-β1的转录许可性预计更低。

精子染色质修饰与创伤愈合适应相关

接下来，我们研究了受损肝脏可能对肝星状细胞基因表达和创伤愈合产生代际影响的潜在机制。在我们的模型中，精子是从受伤动物转移到后代的唯一生物材料，因此需要解决的一个关键问题是肝纤维化如何与精子的表观遗传适应相联系。初步研究未能检测到F睾丸中的DNA甲基化重塑事件₁与我们在F基因中描述的PPAR-γ和TGF-β1基因相似的父亲₂肝脏。虽然这一初步观察确实需要进一步研究，但我们推断，因为DNA甲基化在精子发生期间一次被全面清除，然后在胚胎发育期间再次被清除^29,30精子中的染色质修饰可能与此有关。我们特别感兴趣的是对DNA甲基化注释有影响的染色质特征。在这方面，组蛋白变体H2A的存在。据报道，Z与DNA甲基化相互排斥，其并入核小体可能在胚胎发育期间抑制CpG甲基化^29,30胚胎干细胞的全基因组研究表明H2A。Z在细胞分化和发育中起作用的基因的启动子处富集³¹有趣的是，H2A占据了大多数基因。Z是转录阻遏物多梳蛋白的靶标，包括调节H3K27三甲基化的PRC2蛋白（H3K27me3）³¹。因为我们之前报道过PPAR-γ是一个多囊调节基因²²我们好奇地想确定H2A是否存在。Z被并入精子中PPAR-γ启动子处的染色质，以应对肝纤维化。值得注意的是，尽管在精子发育过程中，大多数组蛋白被精蛋白取代，但成熟精子基因组中仍有很大一部分与组蛋白（包括变体H2A）相关。Z轴^32,33.从CCl损伤的雄性大鼠中分离精子₄或车辆控制4周，然后允许恢复2周，在此期间伤口愈合完全。然后使用交联qChIP量化H2A的掺入。Z和H3K27me3在PPAR-γ启动子处转化为染色质(图6a)。两种组蛋白特征均与PPAR-γ启动子相关，并且与对照组相比，从纤维化恢复期大鼠的精子中发现其水平增加。H3K27me3仅适度富集，而H2A。Z的水平高出6倍，表明变异组蛋白因肝脏损伤而并入PPAR-γ染色质。为了证实这一观察结果，我们对由胆管结扎（BDL）损伤的大鼠精子制备的染色质进行了相同的分析。BDL是一种外科肝损伤模型，可导致严重的组织损伤和纤维化，但其损伤机制与CCl不同₄模型³⁴。我们再次观察到H3K27me3适度富集，H2A的掺入量增加了4倍。Z轴(图6b)。从这些数据中，我们怀疑肝脏损伤会导致血清中可溶性因子的积累，从而改变生殖干细胞或/和成熟精子中的染色质结构。为了验证这一想法，我们重复了对未受损伤大鼠精子中组蛋白特征的qChIP分析，这些大鼠曾多次接受CCl损伤大鼠的血清移植₄在48小时恢复前4周，以确保清除化学物质及其活性代谢物(图6c)。值得注意的是，血清转移诱导PPAR-γ相关的H3K27me3适度增加，H2A富集15倍。Z.ChIP对TGF-β1基因的检测未显示染色质相关H2A的改变。Z，但在CCl精子中检测到H3K27me3降低₄血清转移实验中的损伤大鼠和动物精子(补充图6).

在单独的窗口中打开

图6

表观遗传修饰的肝外传递及与人类肝病进展相关的成纤维调节基因DNA甲基化修饰的证据

a–b）三甲基化H3赖氨酸27（H3K27me3）和组蛋白变体H2A的ChIP分析。大鼠PPAR-γ基因启动子Z在慢性CCl雄性成年大鼠成熟精子中的富集₄或橄榄油（对照）4周，然后恢复2周（n＝5）。a）至e）中的所有ChIP结果均表示为折叠控制同种匹配抗体。b） 对从15天前接受胆管结扎（BDL）或假手术（对照）的雄性成年大鼠分离的成熟精子进行如a）中所述的ChIP分析。c） 对从每周接受两次静脉血清转移（共四周）的大鼠或接受CCl的大鼠中分离的成熟精子进行ChIP分析，如a）所示₄持续4周，在最后一次注射（n=6）d后48小时收集血清，对用对照或48小时条件活化HSC培养基处理72小时（n=3）的原代大鼠间充质干细胞进行ChIP分析。e） 对原代人骨髓间充质干细胞中的人PPAR-γ基因启动子进行ChIP分析，这些细胞用静态（第1天）或活化HSC（第15天）条件培养基处理72小时（n=3）。f） 用焦磷酸测序法测定NAFLD患者肝活检组织中人类PPAR-γ启动子内特定CG二核苷酸的DNA甲基化。差异甲基化CG的位置如图表上方的示意图所示。差异表示为DNA甲基化百分比统计分析；Mann-Whitney试验，其中CpG1的p=0.0013，CpG2的p=0.0047。

接下来，我们询问肝星状细胞源性肌成纤维细胞是否可能是PPAR-γ染色质重塑可溶性介质的来源。当在塑料和全培养基中培养时，分离的原代肝星状细胞将经历肌成纤维细胞转分化^18,35因此，我们收集了由培养的活化大鼠肝星状细胞（HSC）调节的培养基，并将其添加到大鼠骨髓源间充质干细胞（rMSCs）培养物中。ChIP分析显示H3K27me3富集3倍，H2A补充增加4倍。Z连接到PPAR-γ启动子(图6d)。为了确定这些数据与人类肝病的相关性，我们接下来从静止或激活的原代人肝星状细胞培养物中收集条件培养基，并将三个独立制备和表型的人MSCs（hMSCs）暴露于培养基中(图6e和补充图7a–c)。我们再次观察到H3K27me3和H2A的相关性增加。与静止HSC培养物相比，hMSC中PPAR-γ染色质暴露于活化人HSC的条件培养液中，表明负责观察到的组蛋白修饰的因子由活化HSC释放。理想情况下，这些研究应该是用成熟精子（或生殖细胞）进行的，但这些数据表明，活化的肝星状细胞分泌了一种可溶性因子，这种因子能够改变非肝脏来源的细胞类型中的染色质。

最后，我们急于确定表观遗传重塑是否与肝纤维化有任何临床相关性。特别是，我们询问是否可以在轻度（Kleiner评分0-2）或重度（Kleier评分3-4）纤维化的人类肝脏之间观察到PPAR-γ启动子甲基化的差异。DNA是以盲法从46至65岁、经活检证实患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）且特征明确的男性队列中提取的存档肝活检样本中制备的（详细信息见补充图7d)。靶向人类PPAR-γ启动子中两个me-CpG位点的焦磷酸测序表明，高甲基化（两种二核苷酸的甲基化水平均高出约10%）与严重与轻度纤维化相关(图6f)。后面的数据支持了这样一种观点，即人类肝脏的创伤修复可能受到表观遗传特征的影响。

讨论

表观遗传学特征可以以代际方式遗传的概念得到了最近实验研究的支持。生殖细胞DNA甲基化的改变子宫内接触vinclozolin介导多器官成人发病病理的跨代传播³⁶.Ng公司等最近有报道称，喂食成年雄性大鼠高脂肪饮食导致雌性后代胰岛素抵抗，并与642β细胞基因表达的改变有关³⁷.给雄性小鼠喂食低蛋白饮食改变了后代中与肝脏脂质和胆固醇代谢适应相关的全球CpG甲基化模式³⁸在这里，我们报告肝损伤治疗也可能受到代际适应的影响，因此祖先的肝纤维化史似乎抑制了后代的纤维化形成。在一代人中，对纤维化形成的适应性作用明显，但在连续F代出现肝纤维化的情况下，适应性作用更为明显₀和F₁具有累积过程的动物。有趣的是，我们无法证明肝外创伤治疗的适应性，因为肾损伤在有或无肝纤维化病史的父母亲后代中引发了类似的纤维化反应。虽然很容易推测，这种明显的组织特异性适应可能对确保胚胎发生期间基质重塑事件的适当控制和维持成人器官的最佳组织修复反应很重要；值得注意的是，我们的研究仅限于F肾脏的单一损伤模型₁因此，明确排除对肝外组织的适应性影响还为时过早。

在细胞水平上，接受肌成纤维细胞转分化的肝星状细胞数量减少是我们在适应后代的肝脏中观察到的最明显的差异。这种效应与纤维生成蛋白和一些已知影响肝星状细胞表型的基因的表达变化有关。相比之下，我们没有观察到损伤或炎症反应的任何潜在改变，尽管免疫细胞群的功能或分布的细微变化可能会产生此处未检测到的影响。此外，我们还没有确定在适应动物中抑制肝星状细胞转分化的基因表达变化。回答剩下的每个问题都需要详细说明体外受精从F中分离和纯化的肝脏非实质细胞的表型特征₁和F₂几代人。尽管我们的研究存在这些机制上的局限性，但我们证明F₂适应世代的雄性表现出肝星状细胞转分化主转录阻遏物PPAR-γ的相对过表达，以及主要自分泌/旁分泌纤维生成生长因子TGF-β1的相对低表达。这些表达变化与两个基因启动子区特定CpG二核苷酸序列的DNA甲基化重塑有关，PPAR-γ和TGF-β1分别为低甲基化和高甲基化。抗纤维化PPAR-α基因启动子的低甲基化支持了DNA甲基化在适应过程中的作用，并表明未来研究需要采用全基因组方法来绘制祖先纤维化对肝星状细胞甲基体重塑的影响。我们DNA甲基化分析的另一个限制是使用全肝组织的基因组DNA。众所周知，DNA甲基化可以以细胞特异性的方式进行注释^39–42因此，我们在PPAR-γ和TGF-β1基因座检测到的相对温和的甲基化变化可能反映了靶向肝星状细胞的甲基体重塑的限制机制，即使在疾病状态下，肝星状上皮细胞也只是肝脏的一个次要细胞成分。单个类型肝细胞纯化群体的全基因组DNA甲基化分析对于确定甲基体重塑是否确实是细胞特异性的，也将有助于对肝纤维化适应性反应的分子基础进行更机械的评估。

这项工作产生的主要未回答的问题包括：i）纤维化雄性大鼠血清中存在的传递精子适应性表观遗传修饰的因子的身份，以及ii）将精子中的这些修饰传递给成年后代肝细胞的机制。尽管精子发育过程中DNA甲基化标记的全基因组擦除^43,44，生殖细胞（或精子）中的DNA甲基化仍有可能发生重塑，纤维蛋白病诱导的修饰以印迹位点所描述的方式保留在成人体内^45,46虽然不排除后一种可能性，但我们提供了另一种机制，或可能有助于调节精子或生殖细胞中的染色质重塑。啮齿动物的精子发生伴随着广泛的染色质修饰，包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，以及在用鱼精蛋白去除和替换大多数组蛋白之前发生的组蛋白变体的募集，以使晚期精子细胞头部的核凝结⁴⁷尽管精子基因组几乎完全被精蛋白重新包装，但越来越多的证据表明，啮齿动物和人类精子基因组的某些区域仍然与含有表观遗传修饰的组蛋白相关，这些组蛋白与体细胞中相同基因组位点的组蛋白类似⁴⁸这种组蛋白特征的保留可能提供精子发生的表观遗传学历史。在这里，我们已经表明，肝纤维化或未受损动物暴露于肝纤维化大鼠的血清中，会导致精子中PPAR-γ基因的染色质改变，包括与抑制性多梳标记H3K27me3和变异组蛋白H2A的关联增加。Z.这些染色质修饰与后代适应性表型的机制联系尚待确定，但值得注意的是H2A。Z与所谓的“表观遗传记忆”有关，对DNA甲基化具有拮抗作用²⁹在未来的工作中，重要的是确定H2A的含量。Z被招募到PPAR-γ基因以应对肝纤维化，精子基因组中的其他基因与其相关，以及H2A的功能关系。在成年后代的肝脏中发现了DNA甲基化和组蛋白特征的适应性修饰精子中的Z。本研究中一个有趣的发现是，由培养的肌纤维母细胞大鼠和人类肝星状细胞调节的培养基可以刺激H2A。干细胞中PPAR-γ基因的Z招募。这表明肝星状细胞可能提供了一种假定血清因子的来源，该血清因子与成熟精子的表观遗传修饰相联系，细胞培养模型提供了一个有用的实验系统，以确定可溶性因子及其作用机制。

我们所描述的肝脏伤口愈合的代际适应可能具有更广泛的生物学意义和潜在的临床相关性。关于临床相关性，我们提供了初步证据，证明PPAR-γ启动子DNA低甲基化与NAFLD患者轻度纤维化病变相关。然而，到目前为止，我们还没有证据表明这种表观遗传状态受到父母/祖父母祖先事件的影响，也没有证据表明它在功能上与疾病进展相关。需要在较大人群中进行更广泛的表观遗传学分析，以确定PPAR-γ甲基化状态是否与纤维化进展相关。收集跨代影响肝纤维化的证据将非常具有挑战性，需要对肝病患者家属进行前瞻性表观遗传学研究。我们所描述的适应机制是通过短暂的表观遗传事件来引导的，这些表观遗传学事件是随着每一波新的精子发生而重塑的，还是在生殖细胞中得到稳定的，尚待确定。在任何旨在研究人类跨代遗传机制的临床研究之前，解决后一个问题非常重要。从生物学意义上推测，肝脏具有显著的内在能力，能够快速、反复地再生丢失或受损的实质组织，以维持其功能⁴⁹因此，可以认为，当器官保持再生能力时，纤维化组织的沉积对肝脏修复是有害的，而在啮齿动物和人类的情况下，再生能力是在生殖年保持的。因此，肝纤维化发生的代际下调可能具有生物优势，可以确保后代更适合暴露在强大的肝毒素的环境压力下。

在线方法

动物使用-作者持有由当地伦理委员会和英国内政部颁发/批准的动物实验许可证。

CCl公司₄损伤模型和繁殖方案-我们进行了慢性CCl₄如前所述，受伤4周⁵⁰.在最后一次CCl后1天处死成年雄性大鼠₄治疗后，或允许恢复2周，然后与雌性繁殖。雄性后代是混合的，因此每个处理组的父亲在下一代的每个相关组中都有一个雄性后代，从而避免了遗传对表型的影响——F0橄榄油处理组的五个父亲在橄榄油和CCl中各有一个代表性的雄性后代₄F1等处理组。

免疫组织化学-如前所述，我们用天狼星红、苏木精和曙红或FITC结合抗体靶向αSMA对所有动物的肝脏切片进行切割和染色⁵¹使用抗结蛋白抗体D33（Abcam-ab8470）、小鼠抗大鼠CD68（Serotec-MCA341R）、大鼠抗人CD3（Serotec-MCA1477）和萘酚AS-D氯乙酸盐（特异性酯酶）试剂盒（Sigma-Aldrich）进行结蛋白、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞染色。使用Leica QWin V3成像软件测定I型胶原蛋白的面积百分比。使用中所述的量表对坏死和炎症进行评分补充图1图例。

定量RT-PCR和western blotting-我们进行了之前发表的qPCR²²使用中列出的引物补充表1.如前所述进行Western blot²²使用1μg/ml抗PPAR-γ抗体（Abcam，ab19481）、抗细胞色素p450 2E1抗体（Abcam，ab28146）和抗细胞色素p 450 3A4抗体（Abcam，ab3572）。

胆管结扎术（BDL）-如前所述，我们进行了胆管结扎/假手术⁴⁸简单地说，成年雄性大鼠分别使用混合在氧气中的2–3%异氟烷进行吸入麻醉。我们去除了整个腹部区域的毛皮，然后对其进行清洁，并从胸骨底部向腹部（约1cm）切开中央中线剖腹手术切口。我们将胆管从门静脉和肝动脉中分离出来，然后在胆管下面放入3片5.0 mersilk（Ethicon），并将每片mersilh绑成一个双结，位于胆管被切断处的上方和下方各两个结。我们切开了胆管，并用一条倒置的间断缝合线闭合了腹部。

精子分离和染色质制备-从两侧睾丸和精囊中分离附睾和连接的输精管。通过轻轻摇晃分离的附睾，将成熟精子从附着的输精管末端射出，进入含有温暖PBS的细胞培养皿中。通过显微镜确认精子的纯度。使用标准交联方法（在室温下，在1%最终浓度的新鲜甲醛中交联3分钟）和在Diagenode水浴声波仪中的声波作用（高功率下，10个周期，30s开启，20s关闭），从新鲜精子中制备染色质。ChIP中使用的抗体针对H3K27me3（Diagenode，pAb-069-050）和H2A。Z（Abcam，ab4174）或ChIP对照抗体（Abcam）。我们对精子进行了ChIP，如下所示：10μg精子超声染色质用ChIP稀释缓冲液（1.1%Triton X-100，1.2mM EDTA，16.7mM Tris-HCl，pH 8.1，167mM NaCl）稀释1/10，并用封闭的Staph A膜孵育进行预处理。将预过滤的染色质与抗H2A一起孵育。Z、 抗H3K27me3或同种匹配的对照抗体在4℃下过夜。我们在4℃的ChIP反应中加入100微升封闭的Staph A膜，持续两小时，然后按照前面所述清洗、洗脱样品并纯化基因组DNA²²如前所述进行定量PCR²²可根据要求提供底漆序列。肝组织ChIP按⁵².

启动子区域和CpG岛估计-基因的启动子区域使用Genomatix Gene2启动子进行估计（Genomatix-Software Gmbh，Ann Arbor，MI，USA）。Cpg岛由EMBOSS Cpg绘图工具确定(http://www.ebi.ac.uk/Tools/prumpa/cpgplot/).

诱导单侧输尿管梗阻（UUO）——我们在10周龄成年雄性大鼠中诱导了实验性UUO。大鼠分别用2–3%的异氟烷与氧气混合吸入麻醉。沿着白线做腹侧剖腹手术切口，切口从耻骨联合上方延伸至胸骨xyphi。定位左侧输尿管，并用6/0 Mersilk（Ethicon）结扎三次。在输尿管上端和下端分别放置双结扎，以防止尿液回流。两条下韧带之间有一个切口。手术后10天，我们将阻塞的肾脏与动物隔离并进行控制。

基因组DNA的分离-我们使用酚氯仿提取法从大鼠肝脏中提取基因组DNA。简单地说，我们在提取基因组DNA的材料中添加250微升裂解缓冲液（125mM NaCl，12.5mM EDTA，25mM Tris-HCL pH 7.5，0.5%SDS），然后添加0.5%[v/v]β-巯基乙醇和200微克蛋白酶K。然后在55℃下培养样品过夜，以最高速度离心5分钟，将上清液转移到一个新的无DNAse试管中，添加两体积酚氯仿，涡旋并以最高速度离心机分离5分钟，转移水层到一个新试管中，并添加两体积100%乙醇和2μl 3M醋酸钠。我们在−80下培养样品1小时，以最高速度离心试管15分钟，去除乙醇，在工作台上风干颗粒，并将DNA重新悬浮在40μl Tris-EDTA缓冲液中。

人类男性受试者的肝活检、基因组DNA分离、亚硫酸氢盐治疗和焦磷酸测序-根据当前的道德批准（批准号06/Q0905/150），从当地健康信托的档案中获取了回顾性非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）成年男性患者样本。按照大鼠组织的描述，对石蜡包埋的受试者肝活检组织进行脱蜡处理，并获取基因组DNA。用EZ DNA甲基化试剂盒处理2μg基因组DNA亚硫酸氢盐（Zymo Research，Irvine CA）。亚硫酸氢盐修饰的DNA通过引物扩增补充表2或通过Rn-Ppparg-03和Rn-Ppara-02 PM PyroMark CpG分析（PM00549535，PM00581903 Qiagen）。10μl PCR产物用于焦磷酸测序反应。通过Pyromark Q96 MD（Qiagen）测量每个CpG位点的甲基化百分比，并通过PyroQ-CpGTM 1.0.6软件（瑞典乌普萨拉Biotage）进行分析^42,53.

大鼠和人原代肝和间充质干细胞的分离-原代人和大鼠肝星状细胞（HSC）的生成与之前相同^50,51大鼠间充质干细胞（MSC）是通过将成年雄性大鼠股骨分离的骨髓在MesenCult培养基（StemCell技术）中培养2周，然后用活化大鼠HSC培养48小时所得的条件培养基培养72小时而获得的。从人类骨髓单核细胞中分离出人类骨髓干细胞（Lonza Biosciences）⁵⁴细胞在补充有5ng/ml成纤维细胞生长因子-2（R&D Systems Europe Ltd）的间充质干细胞生长培养基子弹试剂盒（Lonza）中在单层培养中生长和扩增。使用人类MSC表型试剂盒（Miltenyi Biotec）在FACSCanto II系统（Becton Dickinson）上通过流式细胞术检测所有MSC供体的表型，CD73、CD90、CD105阳性染色，CD14、CD20、CD34和CD45阴性染色(补充图7a–c)。实验使用第5-7代的细胞进行，所有实验均使用来自3名供体（21–24岁）的细胞重复。供体骨髓间充质干细胞分别用24小时和48小时静止和激活的人造血干细胞培养所得的条件培养基培养72小时。

补充材料

鸣谢

脚注

工具书类