外泌体中的循环microRNA表明酒精性、药物性和炎症性肝病中的肝细胞损伤和炎症

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是一类RNA分子（18-21个核苷酸），不编码任何蛋白质，但调节身体中约30%的总基因[1]. 1993年发现miRNAs后，人们描述了其在发育、免疫、干细胞分化和癌症中的各种作用[1,2]. 最近的研究表明，miRNA不仅定位于细胞内（细胞miRNA），而且也存在于循环中，这使得它们对生物标记物的发现具有吸引力[三].

从化学物质到病毒等各种因素都会引发肝损伤，这是通过包括血清转氨酶（ALT和AST）在内的生化标记物进行临床评估的。然而，这些临床应用的肝损伤标记物存在一些局限性，包括需要新鲜血样、缺乏组织特异性以及无法区分肝细胞损伤和炎症；导致慢性肝病的肝脏病理学的两个重要决定因素。与目前的临床“标准”相比，循环miRNAs具有一些优势。MiRNAs在极端条件下（低pH酸性环境，RNA酶抗性）具有巨大的稳定性，被认为是替代性非侵入性生物标记物[三,4]. 此外，近年来还报道了各种疾病特异性循环miRNA特征[4,5].

肝细胞中富含MiR-122，最近的研究表明，循环中MiR-122的增加与丙型肝炎病毒感染、肝细胞癌、对乙酰氨基酚（APAP）和急性酒精性肝损伤有关[6–8]. MiR-122在肝细胞中具有多种功能，其中胆固醇代谢的调节与肝脂肪变性高度相关[9]. MiR-155是炎症的主要调节因子，在炎症相关疾病中上调[10–12]. MiRNA-155靶向促炎细胞因子产生级联、TLR信号传导和决定促炎和抗炎细胞因子的细胞内信号传导途径的多种成分[13]. MiR-146a和MiR-125b也参与炎症调节[13].

肝细胞损伤和炎症的程度可能因不同的肝病病因而异，也可能在慢性肝病过程中发生变化。例如，长期/慢性酒精会导致脂肪肝，而额外的炎症会促进慢性肝病的进展[14]. APAP相关药物性肝损伤（DILI）的特点是大量协调性肝细胞死亡，炎症反应轻微[15]. 与APAP诱导的DILI相比，内源性和外源性危险分子（如TLR9配体[富含胞苷-磷酸-鸟苷（CpG基序）的非甲基化DNA]和TLR4配体[脂多糖（LPS）]诱导的肝损伤会导致小鼠出现强烈的炎症和肝损伤[16].

在这项研究中，我们假设循环microRNA可能是肝损伤和/或炎症的标志物。我们测试了循环miR-122作为肝细胞损伤的潜在标志物，miR-155作为酒精、对乙酰氨基酚和CpG+LPS治疗引起的不同形式肝损伤的炎症标志物。我们的新数据表明，循环miR-122和miR-155的增加分别与肝脏损伤和炎症相关。此外，我们首次表明，miRNA与外泌体的结合可能是导致肝损伤的损伤类型的特征。

方法

其他方法在支持信息。

结果

酒精性肝病患者循环miR-122和miR-155增加

酒精性肝病的特征是脂肪堆积和肝脏中促炎细胞因子级联的激活[14]. 与等热量饮食对照组相比，酒精饮食小鼠肝细胞脂肪堆积明显，轻度坏死和炎症浸润，血清ALT升高(图1A和B左侧面板）。为了验证循环miRNAs可能作为肝损伤生物标志物的假设，我们评估了肝细胞中唯一丰富的miR-122。我们发现酒精喂养小鼠的血清miR-122水平显著升高(图1B右侧面板）。此外，血清ALT和血清miR-122水平呈正线性相关(图1C).

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图1

酒精性肝病患者循环miR-122和miR-155增加

8周龄C57BL/6雌性小鼠接受Liber De Carli饮食，含5%酒精（酒精喂养）或等热量饮食（成对喂养），持续5周。A.福尔马林固定的肝脏切片的苏木精和伊红（H&E）染色。实心箭头表示免疫细胞浸润，折断箭头表示肝细胞脂肪堆积，双箭头表示肝组织轻度坏死。按照方法（n=6–8）所述，测定血清中的ALT和miR-122水平（TaqMan qRT-real-time PCR）。C、血清ALT与血清miR-122的相关性采用Pearson法测定（n=30）。D.用ELISA法测定肝匀浆全细胞裂解液中TNFα的蛋白水平，并将其归一化为蛋白浓度（n=6–8）。TaqMan qRT-real-time PCR检测血清中E.MiR-155的表达（n=5）。使用合成秀丽线虫miR-39对Ct值进行归一化。计算与配对喂养小鼠相比的折叠变化。数据代表平均值±SEM。采用双尾t检验（B&D）或非参数Mann-Whitney检验（E）进行统计分析。

因为在血清采集过程中miRNA的分布可能会改变[17]，我们评估了喂食酒精后小鼠血清和血浆中miR-122的水平，发现其水平相当(支撑图1A和B). 我们还发现，无论两个组分中的内部控制物（miR-16或miR-223）是什么，醇诱导的miR-122增加的程度是相似的(支撑图1。A–D). 这些结果表明，长期饮酒会导致血液循环中miR-122的增加。

饮酒不仅会导致肝脏脂肪堆积，还会通过诱导促炎细胞因子（如TNFα、IL-6和IL-1β）导致炎症[14]. 最近，我们报道了酒精增加巨噬细胞miR-155，调节TNFα的生成[18]. 与此相一致，饮酒小鼠的肝脏中TNFα水平升高(图1D). 此外，我们发现酒精喂养小鼠的血清miR-155水平升高(图1E). 同样调节炎症的miR-125b和miR-146a的血清水平没有显著变化（数据未显示），表明酒精诱导的肝脏炎症与血清miR-155水平升高相关。

TLR4缺乏或氧化应激破坏可防止ALD循环miR-122增加

LPS是TLR4配体，在ALD的发病机制中起着关键作用。此前，我们的实验室证明了TLR4在ALD中的关键作用，并表明TLR4缺陷（TLR4KO）小鼠可以免受ALD的影响[19]. 由于我们发现酒精喂养小鼠血清miR-122增加，我们假设miR-122的增加与肝脏损伤相关，而不是与酒精摄入本身相关。我们发现野生型而非TLR4KO小鼠在饮酒后表现出明显的肝损伤、脂肪变性和血清ALT升高(图2A和B)重要的是，喂食酒精后TLR4KO小鼠的血清miR-122诱导没有增加(图2C). 这些结果表明，酒精摄入后血清miR-122仅在肝脏受损时升高。

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图2

TLR4缺乏或氧化应激破坏可防止ALD患者血清miR-122升高

野生型（WT）或TLR4-或p47^荧光粉-缺陷小鼠（KO）喂食含Liber De-Carli的等热量（双份喂食）或酒精（乙醇喂食）5周。A.WT和TLR4KO小鼠福尔马林固定肝切片的H&E染色。B.WT和TLR4KO小鼠的血清ALT分析（n=6–7）。C.通过TaqMan qRT-real-time PCR（n=5-7）定量WT和TLR4KO小鼠血清中miR-122的表达。D.WT和p47肝切片的组织病理学（H&E）^荧光粉KO小鼠。E.WT和p47的血清ALT分析^荧光粉KO小鼠（n=6-7）。F.通过TaqMan qRT-real-time PCR检测WT和p47中血清中miR-122的表达^荧光粉KO小鼠（n=6）。使用尖峰线虫miR-39使Ct值正常化。计算与配对喂养小鼠相比的折叠变化。数据代表平均值±SEM。统计分析采用双尾T检验（B、C和E）或非参数Mann-Whitney检验（F）。

酒精代谢或LPS后产生的活性氧（ROS）增加有助于ALD的发病。具体而言，NADPH氧化酶复合物在ALD和p47缺乏小鼠的ROS生成中发挥作用^荧光粉亚单位（p47^荧光粉NADPH氧化酶的KO）对酒精性肝损伤有保护作用[20,21]. 因此，我们接下来评估了活性氧在诱导血清miR-122水平中的作用。组织病理学和生化研究表明p47中没有明显的脂肪积累或ALT增加^荧光粉KO小鼠与野生型小鼠喂食酒精后的比较(图2D&E). 虽然酒精喂养的野生型小鼠血清miR-122显著上调，但p47中血清miR-122没有显著增加^荧光粉KO小鼠与配对喂养对照组的比较(图2F)这意味着ALT和血清miR-122水平相互反映，血清miR-22可能是ALD肝损伤的标志物。

APAP给药导致循环miRNA-122、-155、-125b和-146a水平升高

APAP诱导的急性肝衰竭是全世界DILI和死亡的重要原因[22]. ALT和AST是评估APAP过量后肝脏损伤的常规方法，我们在这里评估了循环miRNAs的效用。APAP给药（500mg/kg；致死剂量）3h后，肝细胞中度变性，出现细胞质空泡，6h后伴有广泛的小叶中心坏死、实质出血和大的细胞质空穴(图3A). 此外，我们发现在APAP治疗3小时和6小时后，ALT显著增加，与循环miR-122增加相关(图3B–D). 由于APAP给药可诱导坏死并伴有炎症，因此我们接下来检测了炎症miRNA，miR-155。我们发现经APAP治疗的小鼠血浆中miR-155随时间增加(图3E)与生理盐水对照组相比，其他参与炎症的miRNAs、miR-146a和miR-125b也增加(图3F左右）。APAP治疗3h后，血浆miR-181d表达没有变化（数据未显示）。这些结果表明，APAP给药导致肝细胞特异性miR-122显著增加，血浆中炎症性miRNA（miR-155、-146a和-125b）适度增加，这些miRNA特征可能代表APAP诱导肝损伤的生物标志物。

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图3

APAP给药诱导血浆中miRNA的时间依赖性增加

按照方法描述，野生型雌性小鼠（8周龄）隔夜禁食，第二天，一些小鼠接受生理盐水或APAP（500mg/kg，致死剂量）3h或6h。A.福尔马林固定肝切片的H&E染色。破碎的箭头表示小叶中心细胞质空泡，实心箭头表示大的细胞质空穴，双箭头表示广泛的实质性出血。B.血浆ALT水平（n=8）。C.通过TaqMan qRT-real time（n=8）定量血浆中miR-122的表达。D.血浆ALT和miR-122之间的相关性用Pearson法测定（n=23）。通过TaqMan-qRT实时PCR测定血浆中miR-155（E）、-146a（F左）和miR-125b（F右）的相对表达（n=8）。添加秀丽线虫miR-39作为内部对照。显示了盐水处理小鼠的折叠变化。数据表示平均值±SEM。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。

炎症性肝损伤中血浆miRNA-122、-155和-146a的增加

新的证据表明，病原体和损伤相关分子模式分子（PAMP和DAMP）都会导致肝脏炎症。DAMP包括线粒体DNA和含有CpG基序且被TLR9识别并有助于激活下游信号级联的凋亡细胞[16]. 由于TLR9在无菌炎症、自身免疫和肝脏疾病中的新作用[16,23,24]，我们评估了TLR9+TLR4配体给药后循环miRNA作为肝损伤和炎症标志物的疗效。

与我们之前的报告一致，CpG给药导致肝脏中强烈的单核炎症浸润，并且当小鼠受到LPS攻击时，观察到炎症灶进一步增加(图4A) [24]. LPS或CpG处理的小鼠的血浆ALT和miR-122均升高，CpG引物LPS攻击的小鼠的血清ALT和miR-122进一步升高(图4B&C). 此外，血浆ALT和miR-122水平之间存在线性相关(图4D).

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图4

CpG+LPS诱导的肝脏炎症中血浆miRNA-122、-155和-146a的增加

野生型雌性小鼠（10-12周龄）每天注射2.5mg/kg CpG DNA一次，持续三天，在第4天，一些小鼠接受0.5mg/kg LPS或生理盐水3小时并处死。A.福尔马林固定肝切片的H&E染色。断箭头表示单核炎症细胞，实心箭头表示炎症灶B。血浆ALT水平（n=4-6）。C.通过TaqMan qRT-real time（n=4-6）定量血浆中miR-122的表达。D.血浆ALT和miR-122之间的相关性用Pearson法测定（n=17）。E.使用TNFα基因特异性引物通过实时PCR检测TNFα的表达，并将其归一化为18S。F.用TaqMan qRT-real-time PCR测定血浆中miR-155（左）和miR-146a（右）的相对表达，并用加标秀丽线虫miR-39作为内部对照（n=4-6）。显示了盐水处理小鼠的折叠变化。数据表示平均值±SEM。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。

由于CpG和CpG引物LPS激发小鼠的免疫细胞浸润增加，我们接下来评估炎症细胞因子TNFα及其阳性调节物miR-155的水平。LPS或CpG处理小鼠的血浆miR-155和肝脏TNFα均增加，CpG激发的LPS攻击小鼠的血浆miR-155水平甚至更高(图4E、右侧和左侧）。我们发现血浆和血清中miR-155的水平相当(支撑图2). 肝脏miR-155和TNFα水平呈线性相关(支撑图3). 我们还发现CpG模型中肝脏炎症时血浆miR-146a增加(图4F)但miR-125b表达无变化（数据未显示）。这些观察结果表明，血浆miR-122和miR-155分别反映了肝细胞损伤和炎症。

循环miRNAs以肝脏损伤特异性的方式定位于富含外泌体或富含蛋白质的腔室

最近的研究表明，细胞外miRNAs与Ago复合物相关，或包装在细胞系或健康人血浆中的外显子体内[17,25]但对肝损伤后细胞外miRNAs的命运知之甚少。在这里，我们检测了不同肝损伤模型中血清或血浆中富含外泌体或富含蛋白（不含外泌物）的部分miR-122和miR-155的表达。我们发现，在酒精诱导的肝脏损伤中，导致脂肪堆积和炎性细胞因子增加，miR-122和miR-155大多与富含外泌体的部分有关(图5A左右）。在富含蛋白质的组分中观察到miR-122的轻微增加和miR-155的减少(图5A左右）。由于miR-122和miR-155在循环中的诱导作用，我们接下来测试了这些miRNAs的肝脏总水平，发现在酒精喂养的小鼠中，miR-122的肝脏表达降低，而miR-155的水平中度升高(图5B).

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图5

循环miRNAs以肝脏损伤特异性的方式定位于富含外泌体或富含蛋白质的腔室

按照方法所述，用ExoQuick Exosome沉淀溶液（SBI，System Biosciences）从血清或血浆中分离出富含外显体或蛋白质的组分，并用齐阿唑（Qiagen）进行裂解。用miRNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA并用于miRNA检测。在从血清（A左&右；ALD模型）和血浆（C左&右；APAP模型和E左&右；CpG模型）分离的富含外泌体或富含蛋白质的级分中定量miR-122和miR-155的表达。酒精（B）、APAP（D）和CpG+LPS（F）治疗后，定量肝脏中miR-122和miR-155的B&D&F表达（n=4-8）。添加秀丽线虫miR-39（血清或血浆）和SnoRNA202（肝脏）作为内部对照。显示了双喂（5A，B）或生理盐水（5C-F）处理小鼠的折叠变化。数据代表平均值±SEM。*与盐水处理小鼠相比，p<0.05。统计分析采用非参数Mann-Whitney检验。

在APAP诱导的与肝细胞大规模坏死相关的肝损伤中，与富含外泌体的组分相比，富含血浆蛋白的组分中miR-122更丰富(图5C左）。此外，在富含蛋白质的组分中发现miR-155随时间增加而增加，同时胞外体组分减少(图5C右侧）。然而，肝脏miR-122和miR-155的表达没有发现明显变化(图5D).

最后，在CpG+LPS诱导的主要引起炎症的炎症模型中，miR-122和miR-155主要在外泌体富集部分增加，而血浆蛋白富集部分减少(图5E左右）。在LPS或CpG处理的小鼠中，miR-122的肝脏表达没有变化，但是CpG启动后再进行LPS激发导致其表达减少(图5F). LPS和CpG治疗对miR-155有强烈的诱导作用，在CpG引物小鼠的LPS攻击后进一步增强(图5F).

为了排除冷冻解冻干扰胞外体或富含蛋白质组分中miRNA水平的可能性，对APAP处理后新鲜和冷冻血浆样品中miR-122和miR-155的表达进行了比较。这些miRNAs在富含蛋白质或外泌体的组分中的表达在新鲜和冷冻样品中是可比较的(支撑图4). 外显子组分的纯度通过CD81（外显子标记）的表达得到证实，并且仅在外显子富集组分中观察到其水平的增加(支撑图5). 综上所述，我们的结果表明，在ALD、APAP和CpG诱导的肝损伤中，miR-122和miR-155（外泌体与蛋白质）的分布和范围不同。

讨论

微RNA已成为基因功能的精细调节器，其在各种体液中的存在使其成为潜在的疾病生物标记物[三,5]. 在本报告中，我们表明血清/血浆miR-122和miR-155可分别作为肝脏损伤和炎症的生物标志物。我们的结果表明，无论肝细胞损伤的病因如何，循环miR-122的增加与肝损伤相关。我们还确定miR-155是肝脏炎症的候选生物标记物。我们的新数据表明，miR-122和miR-155存在于血清/血浆中的胞外体或富含蛋白质的组分中，并首次表明，miR 122和miR 155与酒精性和炎症性肝损伤中胞外体丰富的组分有关，而在APAP诱导的肝坏死中，它们主要存在于富含蛋白质的部分中。

目前的临床实践使用血清ALT/AST作为肝“损伤”的标志物，然而，这些不能区分肝细胞损伤和炎症。血清细胞因子是肝脏炎症的替代标志物，但在常规临床实践中并不实用。此外，ALT和血清细胞因子在极端条件下不稳定，缺乏组织特异性，因此需要更敏感、稳定和特异的肝损伤生物标记物。据报道，在HCC、HCV和APAP诱导的肝损伤中miR-122的诱导作用[6–8]我们的结果进一步扩展了血浆/血清miR-122作为肝损伤标志物的可行性。因为我们的研究结果表明，血清/血浆miR-122的增加与不同病因的肝病普遍相关，所以这种潜在生物标志物的局限性在于，它不能单独区分肝细胞损伤的各种病因。同样，我们的结果表明，血浆/血清miR-155的增加不能用于区分由各种病因引起的炎症，即酒精摄入或DAMP和或药物过量，但其在循环中的诱导程度因不同病因而异。未来更广泛的miRNA分析研究可能揭示肝脏疾病中的病原特异性miRNA特征。

炎症级联反应的上调归因于ALD内脏源性内毒素激活枯否细胞[14]. 我们最近报道了酒精诱导的miR-155使KC对脂多糖诱导的ALD中TNFα的产生敏感[18]. 在这里，我们发现饮酒小鼠的血清和肝脏miR-155水平升高。风湿性关节炎和各种癌症患者的循环miR-155水平也有所增加[26,27]我们的结果支持炎症过程中细胞外miR-155的增加及其作为炎症标志物的使用[27]. 此外，我们证明，由于小鼠TLR4和p47缺乏，ALD中血清miR-122的增加确实是肝病的标志物，而不是酒精的直接作用^荧光粉NADPH氧化酶复合物的亚单位（p47^荧光粉KO）血清miR-122没有增加。与我们的发现相关，最近的一项研究报告称，小鼠急性乙醇灌胃6h后血浆中miR-122增加[8]. 据我们所知，我们的研究首次证明了长期饮酒后miR-122在循环中的诱导作用。

APAP诱导的急性肝损伤是西方国家肝衰竭的主要原因[22]. 在这里，我们发现反映ALT水平的血浆miR-122可以作为APAP诱导肝损伤的标记物。我们的观察结果与之前的报告一致，但我们的研究中APAP给药的剂量和持续时间不同[7]. 同样，最近的一项研究表明，APAP过量的人血浆中miR-122增加[28]. 然而，在我们的研究中，我们发现在APAP治疗后，不仅血浆miR-122，而且miR-155、miR-146a和miR-125b的水平也以时间依赖性的方式增加。我们观察到miR-155、miR-146a和miR-125b的增加有些出乎意料，因为APAP损伤与显著炎症无关。与酒精诱导或炎症性肝损伤（CpG+LPS）模型中肝脏miR-155水平升高不同，我们发现APAP肝损伤中miR-155-表达没有上调，这导致我们推测血浆miR-155，miR-146a和miR-125b可能是APAP诱导肝细胞和免疫细胞大量死亡的结果，而不是诱导炎症性miRNA储备。进一步研究致死剂量和亚致死剂量之间APAP肝损伤的miRNA谱可能会产生更特异的标记物。

新的证据表明，来自死亡细胞（包括DNA）的内源性危险信号（DAMP）可诱导无菌炎症和自身免疫[23]. 线粒体DNA（TLR9配体）等内源性危险信号可能与各种形式的肝病（如ALD、NASH和门脉高压）中存在的肠源性内毒素（TLR4配体）一起作用于肝脏[19,29,30]. 与此相一致，据报道，在酒精喂养小鼠中TLR9和血清内毒素的表达增加[31,18]. 我们发现CpG治疗后血浆中miR-122的诱导作用进一步扩大了循环miR-122作为DAMP所致肝损伤标记物的用途。与CpG和/或LPS诱导的炎症反应一致，血浆miR-155水平显著升高。据报道，在各种癌症中诱导循环miR-155[26,27]我们的发现表明其在肝脏炎症中的诱导作用。有趣的是，CpG+LPS治疗后，血浆中miR-146a而非miR-125b也增加。CpG+LPS治疗后发现血浆中miR-146a增加令人惊讶。为了支持我们的数据，据报道，2型糖尿病特发性肺动脉高压患者和IgA肾病患者的miR-146a水平升高[32,33]. 在我们的研究中，血浆中miR-146a诱导的重要性可归因于其在限制炎症方面的作用，但需要进一步研究以排除这种可能性。有趣的是，CpG治疗后，肝脏miR-146a水平仅略有增加(支撑图6)表明其特定释放进入循环。虽然酒精、APAP和CpG都会导致ALT所示的肝损伤，但循环miRNA的特征和miR-122的范围增加(支撑图7)病因不同。为了比较ALT和miR-122的特征，以区分肝损伤小鼠（酒精或APAP）和对照小鼠，我们计算了接受操作特征曲线（AUROC）下的面积。虽然我们的分析表明ALD模型中ALT和miR-122的AUROC值相似，但在APAP模型中发现miR-122 AUROC稍高(支持表1). 未来，对大量临床样本的研究将能够预测miR-122相对于ALT的优越敏感性、诊断和预测价值。

最近的研究强调了细胞外miRNA在细胞间通讯中的重要性，并可能提供一种遗传信息传递模式[34,35]. 细胞外miRNA可以通过不同的过程从细胞中释放出来，如外泌体、微粒和蛋白质或未知的机制[36]. 健康人血浆样本中已证明miR-122与蛋白质组分的关联[17]. 然而，最近的一项研究表明，血清和唾液中的大多数miRNAs都集中在外泌体中[37]. 我们的研究结果表明，miRNA的细胞外分布在肝脏的不同病理条件下是不同的。在ALD和炎症（CpG/LPS）诱导的肝损伤中，miR-122和miR-155的增加均与外泌体富集分数相关。相反，在APAP/DILI中，miR-122和miR-155主要在富含蛋白质的部分增加，表明miRNA在循环中的损伤特异性分布。在不同类型的肝损伤后，miRNA在外泌体和蛋白质组分中富集可能有多种机制。例如，在APAP诱导的肝损伤中，损伤严重且迅速，miRNA的释放主要是因为死亡/受损细胞的渗漏，我们推测这可以解释为什么大多数miRNA（miR-122和-155）出现在蛋白质组分中（因为miRNA通常与RISC复合）。另一方面，在乙醇和CPG+LPS模型等较轻微的损伤中，细胞损伤较慢且不太严重，可能通过外泌体改变miRNA的处理和释放，这可能是外泌物富集部分的原因。

miR-122和miR-155增加的组织和细胞来源在肝脏疾病中尚待完全鉴定。肝细胞中富含MiR-122，约占总miRNAs的70%，肝脏MiR-122表达变化的机制尚不清楚。MiRNA-155存在但不限于免疫细胞，我们的观察表明它也存在于肝细胞中[38]. 根据观察，肝脏miR-122水平仅在ALD中降低，而在CpG+LPS给药后，无论其循环增加（ALD、APAP和CpG+LPS），很容易推测多次撞击可能有助于肝miR-122的下调，其中肝细胞受损导致循环miR-122水平升高。然而，还需要进一步的研究来识别肝脏损伤后miR-122水平降低的途径。与我们的观察相反，Wang等人[7]据报道，APAP治疗后肝脏miR-122水平降低，这可能是由于不同的APAP剂量和时间所致。

与miR-122相比，miR-155在酒精和炎症（CpG+LPS）诱导的肝脏疾病中似乎是一种可诱导的miRNA，因为其水平不仅在血清/血浆中增加，而且在肝脏中也增加。这并不意外，因为TLR激活被证明可以上调免疫细胞中的miR-155，我们的研究现在表明，它也可以上调肝脏中的miR-155。在免疫细胞和KC中，miR-155诱导涉及NF-κB活化[18]NF-κB活化在酒精诱导的肝病和CpG+LPS诱导的肝脏炎症中均有报道[18,39]. APAP干预后肝脏中miR-155、miR-146a和miR-125b的缺乏以及血浆中miR-125a的增加可能是免疫细胞室中细胞损伤/死亡的结果，因为APAP可诱导免疫细胞和肝细胞死亡[15]. 总之，我们的结果表明肝脏和血浆/血清中都存在刺激特异性miRNA特征。研究肝损伤中细胞外miRNA组装成外泌体与蛋白质间室所需的信号是很有意思的。

补充材料

致谢

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