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J签证费用。2012; (66): 4022.
2012年8月29日在线发布。 数字对象标识：10.3791/4022
预防性维修识别码：项目经理3486758
PMID：22951995

永生小鼠脑微血管内皮细胞系的建立体外试验血脑屏障模型

马尔戈扎塔·布雷克,1 埃尔莱恩·萨尔瓦多,1和卡罗拉·福斯特1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

上皮细胞和内皮细胞（EC）正在建立细胞旁屏障，保护组织免受外部和内部环境的影响。血脑屏障（BBB）由EC、星形胶质细胞终末足、周细胞和基底膜组成，负责脑实质的保护和稳态。体外BBB模型是在细胞水平上研究BBB结构和功能的常用工具。大量不同的在体外迄今为止，已经为不同实验室的研究建立了BBB模型。通常，这些细胞取自牛、猪、大鼠或小鼠脑组织（Wilhelm在综述中详细讨论等。 1). 人体组织样本只能在数量有限的实验室或公司中获得2,3虽然原代细胞制备很耗时，EC培养物可能因批次而异，但建立永生EC系是科学关注的焦点。

在这里，我们提出了一种从新生鼠脑中建立永生脑微血管EC系的方法。我们描述了逐步列出所用试剂和溶液的程序。我们实验室建立的方法可以在四到五周内分离出同质的永生化内皮细胞系。脑微血管内皮细胞系cEND4（来自大脑皮层）和大脑末端5（来自小脑皮层），在Förster实验室按照此程序分离，并已有效用于解释BBB的不同生理和病理过程。使用cEND和cerebEND，我们已经证明这些细胞对糖皮质激素有反应-4,6-9和雌激素治疗10以及TNFalpha等亲国际调解人5,8此外，我们还研究了多发性硬化症的病理学11和缺氧12,13在EC层面。cEND和cerebEND线可被视为研究BBB结构和功能、内皮细胞对不同刺激的细胞反应或内皮细胞与淋巴细胞或癌细胞的相互作用的良好工具。

关键词：免疫学，第66期，神经科学，血脑屏障，在体外细胞培养模型，脑，微血管内皮细胞，永生化，cEND

下载视频文件。（24M，mp4）

协议

1.脑微血管的分离

  1. 每种制剂使用五到十只性别不同的新生小鼠（3-5天大）。
  2. 根据当地IACUC/兽医的建议，将小鼠安乐死，立即取出大脑，转移到含有以下溶液的培养皿中：15 mM Hepes（pH 7.4），153 mM NaCl，5.6 mM KCl，2.3 mM CaCl2x 2小时2O、 2.6 mM氯化镁2x 6高2O、 1%（w/v）BSA（以下简称缓冲液A）。
  3. 除非另有说明，否则所有隔离程序应在层流罩下的室温（RT）（22-24°C）下执行。在取出脑膜和毛细血管碎片后，用无菌手术刀在缓冲液A中切割大脑（不含小脑和脑干的大脑）。用10毫升移液管上下移取组织碎片，直到没有结块。将悬浮液转移到50 ml Falcon管中，并在室温下以250 x g的速度离心5分钟。

注意：脑膜可以被识别为位于脑组织表面的薄而透明的膜。可以用无菌镊子小心取出。

  1. 丢弃上清液。
  2. 用1.5 ml 0.75%（w/v）胶原酶/淀粉酶（罗氏）将颗粒溶解在4.5 ml缓冲液A中，并在37°C的水浴中培养45分钟（偶尔摇晃）。
  3. 同时，用胶原蛋白IV（0.1 mg/ml溶于50 mM乙酸中）涂覆四个孔，制备12孔板。让其粘附1小时。
  4. 添加15 ml冰镇缓冲液A，停止消化。彻底重新悬浮颗粒。
  5. 在室温下以250 x g的速度离心悬浮液10分钟。
  6. 丢弃上清液。
  7. 为了去除髓磷脂，添加10 ml 25%（w/v）BSA（Sigma，纯度>98%），并在4°C下以1000 x g离心20分钟。25%BSA应溶解在1x PBS（PAA实验室）中，并通过0.2μm过滤器过滤）。
  8. 小心丢弃上清液，将颗粒溶解在10 ml缓冲液A中，并转移到新的Falcon管中。
  9. 在室温下，将悬浮液以250 x g离心5分钟。所得颗粒含有内皮细胞。
  10. 用PBS将胶原蛋白IV涂层的12孔板清洗两次。
  11. 将颗粒重新悬浮在4 ml生长培养基（含有10%FCS、50U/ml青霉素/链霉素、1%L-谷氨酰胺的DMEM）中，并将细胞悬浮液平板置于两个孔中，每个孔2 ml。添加嘌呤霉素至最终浓度4μg/ml，并在37°C的细胞培养箱中培养45分钟。此步骤可快速去除粘附细胞。注：添加嘌呤霉素24小时。只有大脑内皮细胞才能代谢它，对于其他细胞类型，嘌呤菌素是有毒的14.
  12. 将步骤1.14中含有非粘附细胞的2 ml培养基转移到两个新鲜微孔中（这些微孔中含有EC部分）。用步骤1.14中粘附的细胞填充2 ml新鲜培养基（这些孔含有其他类型的细胞，例如成纤维细胞、星形胶质细胞和可以并行生长并用于形态学比较）。
  13. 第二天更换介质。

2.永生化脑微血管内皮细胞

  1. 培养GP+E-86 Neo（GPENeo）15成纤维细胞，在含有10%热灭活FCS、50U/ml青霉素/链霉素和2 mg/ml G418（PAA Laboratories）的DMEM培养基中分泌带有多瘤中间T癌基因的复制缺陷病毒。注：多瘤中间T癌基因转染使内皮细胞的生长优于非内皮细胞，导致培养4至6周后形成内皮细胞形态的单层细胞。GPENeo不是商业性的，可以作为共享公共材料获得（请参考原始出版物4,16).
  2. 为了使用含有病毒的培养基进行永生化，将GPENeo细胞在无G418培养基中培养24小时。
  3. 取出10 ml GPEneo上清液，并添加聚溴乙烷（六甲基溴化二甲醚）（Sigma）至最终浓度8μg/ml，通过0.45μm过滤器进行消毒，以去除细胞碎片。
  4. 从第1部分中制备的EC培养物中取出生长培养基，并向孔中加入2ml GPEneo上清液/聚布伦混合物。第二天，使用新鲜的GPEneo上清液/Polybrene混合物重复上述步骤。注：聚brene用于在细胞壁上制造毛孔，以促进病毒颗粒的感染）。
  5. 第二天取出GPEneo上清液/Polybrene混合物，用PBS冲洗细胞两次，并将细胞保存在生长培养基中，每三天更换一次。汇合后，将细胞以1:2的比例在IV型胶原涂层板上分裂。
  6. 通常，应在4-5周后获得稳定的脑内皮细胞系。

3.培养脑微血管内皮细胞

  1. 在水浴中解冻冷冻液中的细胞，并将其转移到15 ml含10 ml预热培养基的酒精中。
  2. 在室温下以250 x g离心悬浮液5分钟。
  3. 取出培养基，将颗粒转移到胶原IV涂层T中25厘米2带有预热生长培养基的细胞培养瓶（用于电镀的细胞密度应至少为1x104细胞/ml）。
  4. 第二天和细胞汇合后（通常在5天后）更换培养基，使细胞分裂。

4.cEND-cells的拆分（注意：拆分应每周进行一次，避免拆分高于1:4）。

  1. 取出培养基，用PBS清洗细胞。
  2. 添加3 ml温胰蛋白酶-EDTA溶液（PAA Laboratories）（T75厘米2烧瓶），在37°C下培养，等待细胞层分散（通常在5至15分钟内）。
  3. 添加5 ml生长培养基，上下吸管，转移到新的IV型胶原涂层烧瓶中。

5.cEND细胞的冷冻

  1. 按照步骤4所述获取细胞悬浮液
  2. 在室温下以250 x g的速度离心悬浮液5分钟。
  3. 重新悬浮细胞颗粒（从1T中获得75厘米2烧瓶）置于6 ml冷冻培养基（95%生长培养基，5%二甲基亚砜）中。
  4. 将细胞悬液分为四个1.5 ml的冷冻液。注：可以在T上播种一种冷冻液25厘米2瓶。
  5. 将冷冻液储存在液氮蒸汽温度下。

cEND培养基：450 ml DMEM、10%FCS、10 ml L-谷氨酰胺、2%MEM-Kit、2%NEAA、10 ml丙酮酸钠、50 U/ml青霉素/链霉素

6.代表性成果

cEND和cerebEND细胞通过内皮和BBB标记物的免疫染色以及内皮电阻（TEER）和通透性的测量来表征。cEND和cerebEND的形态与大脑内皮细胞的原代培养物相似，单层紧密堆积的细长细胞在汇合处表现出生长抑制。免疫荧光显示，细胞表达了可检测到的claudin-5、clodin和VE-cadherin蛋白，这些蛋白定位于细胞-细胞连接处(图3)4,5在血清减少培养基中培养cEND细胞导致TEER增加（从150Ωcm2在含有10%血清至500Ωcm的条件下2在2%血清中），氢化可的松（800Ωcm2)或胰岛素（1000Ωcm2)4在血清还原培养基中培养21天的cEND单层的TEER为900Ωcm2(图4). 使用包含电流通过电极和电压测量电极的组件（世界精密仪器公司）测量TEER。相比之下，据报道，初级脑微血管内皮细胞的TEER值为200-600Ωcm2和市售小鼠细胞系bEnd.3的TEER值为100-140Ωcm2（最近的审查见Abbot 2005和Toth等。, 201117, 18). 此外，大分子的通过，例如分子量为4、10、70和500 kDa的非带电FITC-右旋糖酐或荧光素（300 Da）与保存在含有10%FCS的生长培养基中的对照细胞相比，在4%FCS分化培养基中4小时内，cEND单层的通量减少：荧光素的细胞旁通量减少到对照细胞的30%，FITC-右旋糖酐10和70 kDa的细胞旁流量减少到26%，FITC-dextrtan 500 kDa细胞的细胞流量减少到4.5%。与TEER值类似，在糖皮质激素（GC）存在下培养的细胞的通透性处于最低水平4在进一步的研究中，我们确定了脑血管内皮细胞中的糖皮质激素靶基因、闭塞素、克劳丁-5和血管内皮素4, 7, 9GC处理导致这些蛋白的表达增加，并导致VE-cadherin重新排列到细胞骨架。紧密连接蛋白cloudin和claudin-5通过启动子区的GC反应元件直接调控4,7,19此外，克劳丁-5被确定为血管内皮中的新雌激素靶点10.

内皮功能障碍是许多不同疾病的基础。我们在缺氧/缺糖（OGD）条件下培养cEND。OGD导致BBB功能受损，经GC和蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合治疗后，BBB功能可以恢复12OGD条件导致大脑中葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白表达的强烈增加，而MK801是NMDA受体的一种非竞争性抑制剂，可以减弱这种增加13.

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图1。脑微血管内皮细胞（cEND）分离一周后的形态学观察。在放大6倍（A）和15倍（B）的条件下拍摄光学显微镜照片。可见岛状内皮细胞集落。

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图2。脑微血管内皮细胞（cEND）分离永生一个月后的形态学观察。在放大15倍的条件下拍摄光学显微镜照片。可以观察到融合的均质内皮细胞单层。

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图3。永生脑微血管内皮细胞表达claudin-5、clodin和VE-cadherin。CEND细胞生长在IV型胶原涂层的盖玻片上，并用抗claudin-5（A）、clodin（B）和VE-cadherin（C）抗体染色。这些图像是使用蔡司Axioscop2显微镜在40倍放大的条件下拍摄的。

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图4。cEND单层的跨内皮电阻（TEER）测量。CEND生长在IV型胶原涂层的transwell过滤器上（孔径0.4μm）。细胞汇合后，保存在含有2%FCS的培养基中。在7天、14天和21天后，使用包含电流通过电极和电压测量电极的组件测量TEER。

讨论

所述程序可用于从不同小鼠品系以及不同敲除小鼠品系中分离微血管内皮细胞，以研究血管内皮功能的特异性变化。作为一种永生化方法，我们使用小鼠多瘤病毒的癌蛋白、多瘤中间T抗原进行转化。它能快速转化不成熟的内皮细胞体内和在体外 20,21,22文献中描述的其他EC永生化方法包括例如使用猿猴真空化病毒40的SV40大T抗原永生化23，腺病毒基因产物E1A24或端粒酶催化亚单位的过度表达三PymT的永生化作用是针对小鼠未成熟EC的，这使得可以在短时间内从新生小鼠获得同质EC培养物。永生化会改变细胞的特性，永生化细胞系的结果应与原代细胞或实验进行比较体内用老鼠。PymT永生化EC被描述为表达高水平的纤溶活性，这是由于尿激酶型纤溶酶原激活剂的生成增加和纤溶酶酶原激活物抑制剂的生成减少所致25直接比较PymT永生化bEND5细胞系与原代内皮细胞，发现两者在体外BBB模型非常适合T细胞粘附研究26.

根据所述程序建立的细胞系可以在低传代数下使用，通过高表达BBB和EC结合蛋白来保持屏障特性，因为细胞在老化过程中会失去这些特性。因此，在屏障性能丧失后，应考虑制备新的细胞系。内皮细胞的细胞板密度应较高，因为这对细胞增殖至关重要。在隔离程序以及永久化EC的维护期间，必须考虑到这一点。每个新的细胞系都应该测试其阻隔性，以及其他细胞类型可能存在的污染物。EC单层可以用抗半乳糖苷、抗神经胶质原纤维酸性蛋白和抗平滑肌抗原作为第一抗体进行染色，以排除少突胶质细胞、星形胶质细胞和周细胞的污染4,27为了排除脑膜血管系统的污染，可以检测血栓调节蛋白的表达，除大脑外，血栓调节蛋白在所有血管床上都有表达28.

有趣的是，从不同脑区分离出的永生微血管内皮细胞系在屏障特性和对促炎刺激的敏感性方面存在差异。例如，可以提到大脑cEND和小脑cerebEND细胞系4,5与cEND相比，CerebEND显示主要紧密连接成分claudin-1和clodin的表达水平较低。然而，大脑中claudin-3和-12的水平较高。与cEND细胞的屏障特性相比，在炎症介质TNFα的作用下，大脑END细胞屏障功能受到的影响更大5可以观察到小脑更容易受到炎症刺激体内多发性硬化患者及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎29这些有趣的发现表明了产生和表征个体的必要性在体外针对不同脑区的模型，以提高未来药物靶向大脑的能力。

披露

未声明利益冲突。

致谢

这项研究得到了德国Forschungsgemeinschaft DFG的支持，批准号为FO 315/4-1和DFG SFB 688。

工具书类

  • Wilhelm I，Fazakas C，Krizbai IA。血脑屏障的体外模型。神经生物学学报。实验（战争）2011;71:113.[公共医学][谷歌学者]
  • Forster C.氢化可的松和TNFalpha对人血脑屏障体外模型中紧密连接蛋白的差异作用。《生理学杂志》。2008;586:1937. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Weksler BB.人类成年脑内皮细胞系的血脑屏障特异性特性。FASEB公司。J。2005;19:1872.[公共医学][谷歌学者]
  • Forster C.Occludin作为糖皮质激素诱导小鼠体外系统血脑屏障性能改善的直接靶点。《生理学杂志》。2005;565（第2部分）:475. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Silwedel C，Forster C.小鼠大脑和小脑脑微血管内皮细胞对炎症刺激引起的屏障特性丧失的不同敏感性。《神经免疫杂志》。2006;179:37.[公共医学][谷歌学者]
  • Forster C.糖皮质激素对小鼠微血管内皮屏障通透性的影响是大脑特有的。《生理学杂志》。2006;573（第2部分）:413. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Burek M，Forster CY。小鼠claudin-5启动子的克隆和表征。分子细胞内分泌。2009;298:19.[公共医学][谷歌学者]
  • Forster C，Kahles T，Kietz S，Drenckhahn D.地塞米松诱导小鼠脑血管内皮细胞系cEND中金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的表达。《生理学杂志》。2007;580（第3部分）:937. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Blecharz KG，Drenckhahn D，Forster CY。糖皮质激素增加小鼠脑内皮cEND细胞中VE-cadherin的表达并导致细胞骨架重排。J.塞雷布。血流代谢。2008;28:1139.[公共医学][谷歌学者]
  • Burek M，Arias Loza PA，Roewer N，Forster CY。Claudin-5作为血管内皮中的一种新的雌激素靶点。动脉硬化。血栓血管。生物。2010;30:298.[公共医学][谷歌学者]
  • Blecharz KG。糖皮质激素对与多发性硬化患者血清孵育的鼠脑内皮细胞系cEND内皮屏障功能的影响。多重。硬化。2010;16:293.[公共医学][谷歌学者]
  • Kleinschnitz C.低氧血脑屏障的糖皮质激素不敏感可以通过蛋白酶体的抑制来逆转。(打、击等的)一下。2011;42:1081.[公共医学][谷歌学者]
  • Neuhaus W.在缺氧/葡萄糖剥夺期间添加NMDA受体拮抗剂MK801适度减弱脑内皮细胞随后复氧后葡萄糖摄取的上调。神经科学。莱特。2012;506:44.[公共医学][谷歌学者]
  • 基于Perriere N.嘌呤霉素的大鼠脑毛细血管内皮细胞培养物纯化。对血脑屏障特性表达的影响。神经化学杂志。2005;93:279.[公共医学][谷歌学者]
  • Golenhofen N，Ness W，Wawrousek EF，Drenckhahn D。血管内皮细胞中应激蛋白α-B-结晶蛋白的表达和诱导。组织化学细胞生物学。2002;117:203.[公共医学][谷歌学者]
  • Risau W，Engelhardt B，Wekerle H。血脑屏障的免疫功能：体外大鼠脑微血管内皮对蛋白质（自身）抗原的不完全呈现。《细胞生物学杂志》。1990;110:1757. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 新泽西州雅培。中枢神经系统屏障的动力学：进化、分化和调节。细胞分子神经生物学。2005;25:5.[公共医学][谷歌学者]
  • Toth A.获得CNS药物发现中体外血脑屏障模型的专利。最近的专利。CNS药物研发。2011;6:107.[公共医学][谷歌学者]
  • Harke N.糖皮质激素通过一个不完善的回文糖皮质激素反应元件调节人类闭塞素基因。分子细胞内分泌。2008;295:39.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiefer F、Courtneidge SA、Wagner EF。多瘤病毒中间T抗原的致癌特性。高级癌症研究。1994;64:125.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiefer F.在缺乏Src-相关激酶的小鼠中通过多瘤病毒中间T抗原进行内皮细胞转化。货币。生物。1994;4:100.[公共医学][谷歌学者]
  • Ong SH.ShcA和Grb2介导多瘤中间T抗原诱导的内皮细胞转化和Gab1酪氨酸磷酸化。EMBO J。2001;20:6327. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • O'Connell KA，Edidin M.猴病毒40永生化的小鼠淋巴内皮细胞系结合淋巴细胞并保留正常内皮细胞的功能特征。免疫学杂志。1990;144:521.[公共医学][谷歌学者]
  • Roux F.永生化大鼠脑微血管内皮细胞中γ-谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶活性的调节。《细胞生理学杂志》。1994;159:101.[公共医学][谷歌学者]
  • Montesano R.蛋白水解活性增加是表达中间T癌基因的内皮细胞异常形态发生行为的原因。单元格。1990;62:435.[公共医学][谷歌学者]
  • Steiner O，Coisne C，Engelhardt B，Lyck R.永生化bEnd5和原代小鼠脑微血管内皮细胞作为T细胞外渗研究的体外血脑屏障模型的比较。J.塞雷布。血流代谢。2010;31:315. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Skaper SD.Conn M编辑。神经科学方法。1990年，第1303页。
  • 石井H.血栓调节蛋白是一种内皮抗凝蛋白，在人脑中不存在。鲜血。1986;67:362.[公共医学][谷歌学者]
  • Alexander JS，Minagar A。多发性硬化症的血脑屏障破坏。多重。硬化。2003;9:540.[公共医学][谷歌学者]
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