酵母线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的加工和拓扑结构^*

质粒和菌株构建

对于表达C-末端HA标记的Psd1的酵母菌株的产生，PSD1型使用基因组DNA的基因特异性引物在含有ExTaq公司DNA聚合酶（Takara）。将纯化的PCR产物通过BamHI和NotI（发酵剂）插入pYES2载体（Invitrogen），得到pYES2-PSD1HA。为了生成Psd1S463A和Psd1ΔIM（Val-81到Ser-100的残基被删除），pYES2-PSD1HA被用作定点突变（QuikChange XL定点突变试剂盒；Stratagene）或重叠延伸PCR的模板。A类psd1级Δ应变通过醋酸锂转化用所述结构进行转化(64)，生成Psd1HA、Psd1S463A和Psd1ΔIM。

线粒体的分离和Psd1的线粒体下定位

根据标准程序通过差速离心分离线粒体(4,65). 在SEM缓冲液（250 m米蔗糖，1米米EDTA和10 m米MOPS-KOH（pH 7.2）），将等分样品在液氮中进行冲击冷冻，并储存在−80°C下。如前所述，对标记蛋白的富集和亚细胞组分的交叉污染进行了评估(4).

Psd1的亚线粒体定位是通过Psd1对完整的、低渗肿胀或溶解的线粒体中外源性蛋白酶K的可及性来确定的。对于线粒体的低渗肿胀，通过以9:1比例的EM缓冲液（10 m）处理线粒体来生成有丝分裂体米MOPS-KOH（pH 7.2）和1 m米EDTA）和SEM缓冲液在冰上放置10分钟。随后，用20–50μg/ml蛋白酶K在冰上处理样品15分钟。为了进行溶解，在添加蛋白酶K之前，用Triton X-100以0.5%（v/v）的最终浓度处理线粒体。通常，蛋白酶K的活性通过添加2 m米PMSF并在冰上孵育10分钟。随后，通过离心分离线粒体（16000×克，10分钟，4°C），并用SEM缓冲液清洗。样品进行SDS-PAGE和Western blot分析。如前所述，采用碳酸盐萃取法测定蛋白质的膜结合(65–68). 简而言之，分离的线粒体在新制备的0.1中重新悬浮米在pH 10.8或11.5的碳酸钠缓冲液中，在冰上培养30分钟。通过超速离心（100000×克，40分钟，4°C）。将颗粒溶解在SDS-PAGE负载染料中，而保留在上清液中的蛋白质通过三氯乙酸沉淀。样品进行SDS-PAGE和Western blot分析。

前体蛋白导入分离线粒体和微粒体

对于体外转录，使用包含SP6启动子的PCR生成模板。纯化RNA（MEGAclear试剂盒；Invitrogen）并用于体外翻译（TNT工具包，Promega）³⁵S标记的蛋氨酸。的导入³⁵在25°C下，在2 m米NADH，2米米ATP和ATP再生系统（5 m米进口缓冲液（3%BSA（w/v），250 m）中的磷酸肌酸和0.1 mg/ml肌酸激酶米蔗糖，80米米KCl，5米米氯化镁₂，2米米千赫₂人事军官₄，5米米蛋氨酸，10米米MOPS-KOH（pH 7.2）(65). 进口反应在冰上停止，并通过8μ米抗霉素A，1μ米缬氨霉素和20μ米寡霉素。对于蛋白酶处理，样品与50μg/ml蛋白酶K在冰上培养15分钟。通过离心分离线粒体（16000×克，10分钟，4°C），并用SEM缓冲液清洗。对于脉冲相位实验，³⁵在标准导入条件下（脉冲），S标记的Psd1导入线粒体5分钟。随后，线粒体被重新分离、清洗，并在进口条件下再次孵育，但没有添加新的³⁵S标记的Psd1前体（追逐）。对样品进行SDS-PAGE分析³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。对于蓝色天然电泳，线粒体用洋地黄缓冲液溶解（20 m米三氯化氢（pH 7.4），50 m米氯化钠，0.1米米EDTA，10%甘油），含1%（w/v）洋地黄素。在一个澄清的自旋后，线粒体蛋白复合物通过蓝色天然电泳分离，如所述(69,70).

的导入³⁵按照分离线粒体的标准导入方案，将S标记前体蛋白导入狗胰腺微粒体（Promega）。通过离心（125000×克，30分钟，4°C），并用SEM缓冲液清洗。在变性条件下裂解膜并进行SDS-PAGE分析。

标记蛋白的亲和纯化

将线粒体溶解在含有1%（w/v）洋地黄蛋白的蛋白质浓度为1 mg/ml的洋地黄缓冲液中，在冰上放置20分钟。旋转澄清后，将上清液与抗HA基质（罗氏应用科学公司）在4°C下恒定旋转培养1小时。在用含有0.3%（w/v）洋地黄素的洋地黄缓冲液进行几步洗涤后，洗脱蛋白质并进行SDS-PAGE、Western blot分析，并用所示抗血清进行免疫检测。对于捕获前体的亲和纯化，³⁵S标记的Psd1在没有膜电位的情况下输入到含有Tom22的线粒体中_伊斯，汤姆40_哈，或Tom70_伊斯随后，按照所述进行了下拉实验(59–62).

磷脂分析

通过Folch程序从全细胞游离匀浆和线粒体中提取脂质等。（1957）使用氯仿/甲醇（2:1，v/v）(71). 残留污染物(例如蛋白质和盐）通过使用0.034%MgCl的有机相额外洗涤步骤去除₂溶液（w/v），2n个KCl、甲醇（4:1，v/v）和甲醇/水/氯仿（48:47:3，v/v/v。使用氯仿、甲醇、25%NH在硅胶60板（Merck）上通过二维薄层色谱分离单个磷脂_三（68:35:5，v/v/v）作为第一种展开剂，氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水（53:20:10:5，v/v/v/v）为第二种展开剂。通过碘蒸气染色，在薄层色谱板上显示磷脂，刮掉磷脂，并按所述进行定量(72).

Tom70和Tom22是Psd1前体的主要线粒体受体

Psd1定位于内膜引起了该蛋白进入线粒体机制的问题。一般来说，大多数线粒体蛋白在细胞溶质核糖体上被翻译为具有N末端信号序列的前体，这足以靶向并导入线粒体。线粒体外膜（TOM复合体）的转定位酶对于前体蛋白跨外膜的转运至关重要(73–77). 首先，我们通过导入来测试Psd1是否通过TOM复合体导入³⁵S-标记的Psd1前体进入从缺乏Tom22的酵母菌株分离的线粒体(图2A类). Tom22的缺失导致TOM复合体的失稳，并阻止大多数TOM依赖底物进入线粒体(78). 导入分离的线粒体后，检测到三种形式的Psd1(图2A类,车道1–3)，这在网织红细胞裂解物中不存在，表明加工不会自发发生（数据未显示）。这三个片段代表中间产物1和2(我₁和我₂)由未知加工步骤形成，可能是成熟的Psd1β亚基(米) (图2A类,车道1–3) (55). 中间体1没有被线粒体完全吸收，因为它可以被外部添加的蛋白酶K所接近，并且主要在缺乏膜电位的情况下形成(图2A类,1–4车道). 相反，中间产物2和成熟的Psd1β仅在存在膜电位的情况下形成，并表现出蛋白酶抗性(图2A类,车道1–3). 因此，我们得出结论，中间体2和成熟的Psd1β完全导入线粒体。在没有Tom22的情况下，前体导入分离线粒体的量显著减少，这表明TOM复合体对Psd1生物生成的一般要求(图2A类). TOM复合体有两个外周受体，Tom20和Tom70。据报道，Tom20可以识别具有可切割信号信息的前体蛋白，而Tom70主要与含有内部不可切割靶向信息的疏水前体相互作用(三,73–79). 为了测试哪种外周受体参与了Psd1前体的导入，我们对缺乏Tom20或Tom70的酵母菌株的线粒体进行了导入实验。令人惊讶的是，Psd1导入缺乏Tom20的线粒体只受到轻微影响(图2B类)但在没有Tom70的情况下显著减少(图2C类). 因此，尽管Psd1含有可切割的信号序列，但Tom70和Tom22是Psd1前体进入线粒体的主要受体。

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图2。

Tom70和Tom22是Psd1前体进入线粒体的主要受体。 A–C,³⁵在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，S标记的Psd1前体从野生型导入线粒体，通22Δ (A类),汤姆20Δ (B类)，或汤姆70Δ (C类). 随后，将线粒体与蛋白酶K一起或不与蛋白酶K一起孵育(保护。K（K）).³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。成熟型Psd1β的时间依赖性形成(米)用ImageJ定量线粒体中的。Psd1β的最长导入时间点(米)野生型线粒体被设定为100%。S.E.四次测量的平均值(误差线)如图所示。用所示抗血清进行免疫检测作为负荷对照。第页，前体；我₁,我₂，中间体1和2；米，成熟Psd1β。

MPP和Oct1分离Psd1的信号序列

的导入³⁵S标记的Psd1前体进入线粒体导致三个片段的形成（参见图2A类) (53,55). 然而，蛋白水解裂解的分子机制和这些片段的性质尚不清楚。此前，人们推测，内膜分选序列可能被一种类似Yme1的蛋白酶去除(50,55). 然而，观察到的β-亚单位的膜整合指向不同的处理模式。为了确定Psd1成熟所需的加工蛋白酶，我们分析了缺乏描述或预测的线粒体蛋白酶的菌株线粒体中Psd1的蛋白质模式(61)使用针对Psd1β亚单位的抗体(图3A类). 令人惊讶的是，Yme1的缺失根本不会影响线粒体中成熟Psd1的大小(图3A类,车道4). 此外，在没有Yme1的情况下，新导入的Psd1的处理没有受到影响（数据未显示）。类似地，内膜蛋白酶Imp1和Imp2，这两种酶都是通往膜间空间的线粒体蛋白质成熟所必需的(74,76,80,81)，对Psd1成熟无影响（数据未显示）。

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图3。

MPP和Oct1处理Psd1前体。 A类用SDS-PAGE分析了几个缺失菌株的线粒体蛋白。用Psd1特异性抗体进行免疫检测，显示Psd1的β亚单位。B类,³⁵在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，S标记的Psd1前体从野生型或10月1日Δ. 随后，用或不用蛋白酶K培养线粒体(保护。K（K）).³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。P（P），前体；我₁,我₂，中间体1和2；米，成熟Psd1β。C类,³⁵S标记的Psd1和Psd1S463A前体在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下从野生型或石块突变株。随后，用或不用蛋白酶K培养线粒体。³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。D类,³⁵S标记的Psd1_遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，在Psd1的C末端含有六种蛋氨酸的线粒体从野生型或石块突变株。³⁵放射自显影检测S-标记的Psd1α。E类、实验方案和脉冲相位实验³⁵S-标记的Psd1进入野生型线粒体。³⁵在标准导入条件下，在25°C下将S-标记的Psd1导入野生型线粒体5分钟(车道1;脉冲). 在重新分离和清洗步骤后，线粒体在进口条件下进一步孵化，但没有添加新的³⁵S标记前体(车道2和三,大通（Chase）).³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。

虽然其他几种线粒体蛋白酶的缺失并不影响Psd1β的形成，但在缺乏Oct1（八肽基氨肽酶）的线粒体中观察到Psd1的微小改变(图3A类,车道8). 众所周知，基质定位的Oct1通常在MPP裂解后从前体中间体中去除八肽以稳定客户蛋白(63). 为了在10月1日前确认Psd1前体的加工，我们进口了³⁵S标记的Psd1进入缺乏这种蛋白酶的线粒体(图3B类). 我们观察到中间体2的大小发生了变化(我₂)和成熟的Psd1β亚单位(米)表明Oct1确实从Psd1前体中移除了一个肽(图3B类,车道3和7).

Psd1前体的氨基酸序列表明存在经典的N末端线粒体信号序列(36). 这种信号序列通常被线粒体基质的MPP去除，线粒体基质由两个基本亚单位Mas1和Mas2组成(74,80,81). 为了解决MPP在处理Psd1中的作用，我们将Psd1前体导入从温度敏感的Mas1突变体分离的线粒体(61,62).桅杆已停用体内通过将培养物转移到非限制性生长条件。在分离的线粒体中体内热休克的石块细胞，从中间产物2和成熟的Psd1β中去除信号肽被阻断(图3C类,车道3和7). 因此，Psd1前体的N末端前序列被基质定位蛋白酶MPP和Oct1裂解，产生Psd1β(米).

到目前为止，我们只推测成熟的Psd1β是通过自我加工形成的，这导致在输入Psd1时形成两条蛋白酶保护带石块(图3C类,车道7). 为了实验性地测试这个概念，我们将Psd1变体导入到野生型中，并石块线粒体，其在保守的LGST基序中含有一个点突变，以防止自催化切割(9,46,53). 该Psd1S463A构建物以与野生型相同的效率导入，但裂解为α和β亚基被阻断(图3C类,10号车道). 在石块线粒体，仅形成了上部带，表明成熟的Psd1β以MPP非依赖性的方式在自我分裂时出现(图3C类,11号车道). 为了证实这一结论，我们分析了Psd1α亚基的形成石块线粒体直接作用。Psd1的C末端被六种蛋氨酸标记，以检测³⁵S标记的Psd1α。此Psd1_遇见构建物像野生型Psd1一样导入（数据未显示），并且4kDa大小的Psd1α的形成在石块线粒体(图3D类,车道3和4). 为了确定发生自催化的导入步骤，我们用³⁵S标记的Psd1(图3E类).³⁵短时间内导入了S-Labeled Psd1(图3E类,车道1,脉冲). 随后，线粒体被重新分离并在进口条件下进一步培养，但没有添加新的³⁵S标记前体(图3E类,车道2和三,大通（Chase）). 有趣的是，追逐后成熟的Psd1β形成效率更高，但在短脉冲期内仅在较小程度上形成(图3E类). 该观察结果表明，Psd1的自分裂发生在导入的后期，并在正常导入条件下遵循MPP和Oct1的处理。

TOM络合物修饰的Psd1前体被加工成α和β亚单位

引人注目的是，Psd1α也是在缺乏膜电位的情况下形成的，这表明Psd1的自分裂可以独立于其进入线粒体而发生(图3D类,车道1). 因为中间产物1也是在没有膜电位的情况下形成的(图3B类,车道1)，我们想知道中间产物1是否代表自我处理的Psd1前体。为了解决这个问题，我们对野生型线粒体中的Psd1S463A前体进行了导入实验(图4A类,车道5-8). 有趣的是，在导入Psd1S463A前体的过程中没有生成中间体1，这表明中间体1是通过将Psd1自我加工成α和β亚基而形成的。为了评估阻滞的Psd1的自切割效率，我们量化了在存在和不存在膜电位的情况下Psd1α的形成(图4B类). 我们发现，尽管导入线粒体有利于自我处理，但大量截获的Psd1前体也会经历自动催化(图4B类,车道3).

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图4。

TOM络合还原的Psd1前体经过自催化处理。 A类,³⁵在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，将S标记的Psd1和Psd1S463A前体导入野生型线粒体(保护。K（K）).³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。第页，前体；我₁,我₂，中间体1和2；米，成熟Psd1β。B类,³⁵S标记的Psd1_遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，在Psd1的C末端含有六种蛋氨酸，从野生型线粒体导入。³⁵放射自显影检测S-标记的Psd1α。用ImageJ定量线粒体中Psd1α的时间依赖性形成。在存在膜电位的情况下，Psd1α进入野生型线粒体的最长输入时间点设置为100%。S.E.三次测量的平均值(误差线)如图所示。C类,³⁵S标记的Psd1前体在没有膜电位的情况下导入野生型线粒体。线粒体与Tom5或Tom22抗体或免疫前血清孵育，作为对照。随后，用蓝色天然凝胶电泳分离裂解线粒体的蛋白质复合物。³⁵S标记蛋白通过放射自显影术检测。D类,³⁵S标记的Psd1前体在没有膜电位的情况下导入野生型Tom22_伊斯，汤姆70_伊斯和Tom40_哈随后，利用His和HA标签对线粒体进行裂解和亲和纯化。负载（4%）和洗脱蛋白（100%）通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影术分析。我₁，中间1。E类,³⁵S标记的Psd1_遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，前体从野生型导入线粒体，汤姆70Δ,汤姆20Δ和汤姆22Δ.³⁵放射自显影检测S-标记的Psd1α。

此前已经证明，当膜电位耗尽时，一些疏水性前体在TOM复合物中积聚(12,82). 为了测试被截获的Psd1前体是否也与TOM复合物结合，我们培养了³⁵S-标记的Psd1前体与无膜电位的孤立线粒体(图4C类). 进口后，使用温和的洗涤剂洋地黄素裂解线粒体，并通过蓝色天然电泳分析样品以检测TOM结合的中间体。在没有膜电位的情况下，Psd1前体与TOM复合物稳定结合，如向线粒体中添加抗Tom5或Tom22抗体后中间产物的大小变化所示(图4C类,车道3和6). 为了分析前体和中间体1是否与TOM复合物结合，我们将³⁵在含有His-tagged Tom22、Tom70或HA-taged Tom40的线粒体中的转定位酶处标记S的Psd1，并进行亲和纯化(图4D类). 这些实验表明，中间体1和未加工的前体与标记的TOM亚基共同纯化(图4D类,车道4,8、和12). 为了确定Tom受体是否在Psd1的自我分裂中起作用，我们分析了缺乏一个Tom受体的突变体中Psd1α的形成(图4E类). 只有Tom70的缺失轻微影响了Psd1α的形成(图4E类,顶部). 该观察结果表明，Tom70参与了Psd1前体的初始识别，而Tom22参与了随后的导入步骤。总之，在没有膜电位的情况下，当前体暴露在外膜上并与TOM复合物结合时，Psd1前体发生自动催化裂解成α和β亚基。