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科学与运输医学。作者手稿；PMC 2012年10月24日发布。
以最终编辑形式发布为：
《科学与运输医学》，2011年8月17日；3（96）：96ra76。
数字对象标识：10.1126/scitranslmed.3002648
预防性维修识别码：项目经理3479650
美国国立卫生研究院：NIHMS408530标准
PMID：21849664

抗惊厥药物托吡酯治疗炎症性肠病的计算定位

乔尔·达德利,1,2,三，* 玛丽娜·西罗塔,1,2,三，* 莫汉·谢诺伊,4 Reetesh Pai公司,5 赛尔克·罗德,1,三 安妮·P·蒋,亚历克斯·A·摩根,1,2,三 米妮·萨瓦尔,1,三 潘卡杰·杰·帕斯里察,4和阿图·J·巴特1,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道慢性炎症性疾病，长期治疗和疾病维持缺乏安全有效的治疗方案。在这项研究中，我们应用了一种计算方法来发现治疗IBD的新药物生物信息学使用测量IBD样品和164种小分子药物化合物中的基因表达的公开可用的分子数据。通过我们的方法预测可治疗IBD的顶级化合物包括泼尼松龙和托吡酯，前者是一种治疗IBD所用的皮质类固醇，后者是一种抗惊厥药物，之前未描述过其对IBD或任何相关炎症或胃肠道疾病的疗效。我们通过实验验证了托吡酯的预测体内使用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的IBD啮齿动物模型。实验结果表明，在TNBS诱导的IBD啮齿动物模型中，口服托吡酯能够显著降低原发性结肠组织的大体病理特征和微观损伤。这些发现表明托吡酯可能是人类IBD的一种新的治疗选择，并支持使用公共分子数据和计算方法来发现IBD的新治疗选择。

简介

炎症性肠病（IBD），其中克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是最显著的临床定义表现，是一组慢性进行性肠道炎症疾病，仅在北美就影响了100多万人(1). 目前尚无已知的IBD治愈方法，可用的治疗方案旨在控制症状、促进缓解和防止复发。目前IBD的治疗方案包括长期服用皮质类固醇和全身抗炎药以减少或抑制原发性炎症，以及使用抗生素治疗继发性感染(2). 通常用于治疗IBD的皮质类固醇或全身抗炎药（如6-巯基嘌呤）的长期使用会产生严重的副作用，而更具针对性的治疗方法，如抗肿瘤坏死因子α药物，成本高昂，且仅在部分受影响患者中产生治疗反应(三). 手术切除小肠或大肠的受影响区域也被用作治疗策略，但这种方法成本高昂且具有高度侵袭性，而且这种疾病通常会在以前未受影响的肠道部位复发(2).

在这项研究中，我们旨在利用基于药物和疾病公共基因表达特征整合的药物重新定位系统计算方法（Sirota M和Dudley JT等。同时出现在本期杂志上）。我们根据包含164种药物化合物的基因表达特征简编，系统评估了源自公共微阵列数据的IBD基因表达特征，以推断数据集中药物-疾病对之间的新型治疗关系。在我们的方法得出的排名靠前的结果中，皮质类固醇泼尼松龙是一种已知的IBD治疗方法。更令人惊讶的是，我们发现，经批准的抗癫痫药物托吡酯（之前未被描述为与IBD或任何其他肠道疾病有治疗关联）在我们的方法中排名高于泼尼松龙（即对IBD的预测疗效更高）。我们使用TNBS诱导的结肠炎啮齿动物模型在三个独立实验中评估托吡酯治疗IBD的疗效。与我们的计算预测相一致，实验结果表明托吡酯与未治疗组相比能够显著改善IBD表型，甚至比作为阳性对照的泼尼松龙表现出更大的疗效。

结果

已知和新型IBD药物预测

为了发现新的IBD治疗关系，我们比较了164种药物化合物的基因表达谱(4)从NCBI基因表达总览（GEO）获得的公开实验中获得的IBD基因表达特征(5). 我们基于这样一种假设得出了药物-疾病对的治疗预测，即如果一种药物的基因表达特征与疾病特征相反，那么该药物可能被用作该疾病的治疗。当药物特征与疾病特征相反时，我们的方法产生负分，当它们一致时，我们产生正分（参见方法）。对克罗恩病最有力的治疗预测是皮质类固醇泼尼松龙（得分=−0.216），这是一种众所周知的治疗克罗恩病的药物(6) (图1). 有趣的是，我们观察到托吡酯，一种目前用于治疗癫痫的抗惊厥药物，被确定对克罗恩氏症有更强的治疗得分（-0.220）(图1; 红色箭头）而不是已建立的治疗性泼尼松龙。根据我们的分析，托吡酯也是溃疡性结肠炎最有力的预测治疗方法之一，得分为-0.219（数据未显示）。虽然另一种化合物5186324在我们的方法中得分高于托吡酯，但我们选择托吡酯作为实验验证的重点，因为它是一种FDA批准的化合物，已知对人体普遍安全，并且易于临床使用。

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克罗恩病的药物疾病得分显著。药物名称沿下轴放置，药物名称上方的竖线表示根据药物基因表达特征与克罗恩病基因表达特征的比较计算出的药物预测治疗得分。阳性分数表示药物表现出与疾病协同的表达模式，而阴性分数表示药物显示出与疾病相反的表达模式。药物从左到右排序，从那些被预测对该病最有效的药物开始。绿色条表示文本中讨论的药物。红色三角形指向用于实验验证的抗惊厥药物托吡酯。

托吡酯作为IBD适应症的实验验证

为了确定我们的生物信息学药物适应症预测将转化为治疗效果体内，我们使用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的IBD大鼠模型测试托吡酯是否对IBD有效。我们进行了一项初步的先导验证实验，随后进行了两项独立的复制实验，雄性Sprague-Dawley大鼠直肠内注射TNBS（5%w/v总计100 mg/kg）诱导结肠炎。最初的实验由18只大鼠组成，这些大鼠被分为三组，大小相等（每组6只）。一组未用TNBS诱导并用载体治疗，另一组用TNBS诱发并用载体（TNBS+载体）治疗，最后一组用TNBS诱导并经口灌胃用托吡酯（80 mg/kg/天）治疗（TNBS+托吡酯）。独立复制实验使用了60只动物（每组12只），并添加了第四组，第四组用TNBS诱导并用泼尼松龙（3 mg/kg/天）治疗，作为阳性对照（TNBS+泼尼松隆）。在初始TNBS诱导后，动物连续治疗7天，并在体内在第3天和第7天通过视频内窥镜检查。在治疗结束时对大鼠实施安乐死，并切除整个结肠进行组间病理评估。

在整个治疗过程中，通过观察临床症状和在终止治疗后对受影响结肠组织进行大体检查来评估疾病的严重程度。与受影响的动物单独使用载体（TNBS+载体）相比，使用泼尼松龙（TNBS+prednisolone）和托吡酯（TNBS+托吡酯）治疗的动物在治疗过程中出现腹泻的发生率降低(图2). 通过目测检查治疗第7天拍摄的内窥镜检查视频对结肠炎进行评估，结果表明托吡酯和泼尼松龙治疗组与未治疗组（TNBS+载体）相比，大体病理炎症和溃疡明显减轻（图3）。4A级；补充视频S1–4). 对大体病理特征的定量评估表明，与未治疗（TNBS+载体）组的动物相比，托吡酯治疗组（TNBS+topirate）的动物表现出明显减轻的肿胀、溃疡和其他大体病理特征(P（P）< 0.0001; Mann-Whitney U检验；n=每组12人）(图3B).

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通过各组内腹泻动物的百分比对治疗组之间的IBD严重程度进行总体临床评估。托吡酯治疗组和泼尼松龙治疗组的腹泻动物比例均低于仅服用溶媒的疾病诱导组。（n=每组12只动物）

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治疗组间IBD严重程度的病理评估。A） 研究第7天从活动物身上采集的临床内窥镜检查。B） 病理学总分。C） H&E染色结肠组织的照片显示治疗组之间结肠壁粘膜和上皮层的微观损伤。D） 通过固定结肠组织的光学显微镜评估宏观损伤评分。数据图表示三个独立实验的平均值和SEM估计值。（n=12只/组）（*=P（P）<0.05, ****=P（P）<0.00005; Mann-Whitney U试验）。

通过固定结肠组织切片的组织病理学分析评估微观损伤。对固定结肠组织的目视检查显示，未经治疗的结肠炎诱导组（TNBS+载体）结肠粘膜层广泛破坏，而接受托吡酯（TNBS+topirate）的结肠炎动物的结肠粘膜层明显改善(图3C). 组间微观损伤的定量评估表明，与未经治疗（TNBS+载体）组的动物相比，托吡酯治疗组的动物宏观损伤显著减少(P（P）< 0.05; Mann-Whitney U检验；n=每组12人）(图3D). 综上所述，这些数据证明托吡酯在TNBS模型中对IBD具有疗效，正如计算方法所预测的那样。

表达式签名评估

根据公共数据推断出IBD和托吡酯之间的预测有效关系，这表明特定的基因组会在药物和疾病之间表现出相反的表达。对克罗恩和托吡酯表达特征的比较目视检查揭示了药物和疾病之间预期的对立表达模式，功能富集分析表明与胃肠疾病、炎症反应、，其他免疫相关功能在受药物影响和受疾病影响的情况下表达不同(图2A)

我们对死后结肠组织进行qPCR分析抽查，以评估在动物验证研究中是否观察到驱动我们预测的公共基因表达数据中反映的预期基因表达模式。我们从一组基因中随机选择了8个基因进行qPCR分析，这些基因在药物和疾病表达特征之间表现出相反的表达模式，并且可以使用商业引物（见方法）。qPCR分析显示其中两个基因，TRPV1型和国际单项体育联合会30在公共分子数据比较中预期的方向上，各治疗组之间的差异表达(图4B).TRPV1型托吡酯治疗组（TNBS+托吡酯）与未治疗疾病诱导组（TNBS+载体）相比显著上调(P（P）<0.05; Mann-Whitney U检验；n=每组12人）国际单项体育联合会30托吡酯治疗组与未治疗疾病影响组（TNBS+载体）相比显著下调(P（P）<0.005; Mann-Whitney U检验；n=每组12人）。这两个发现都证实了这些基因之间预期的对立关系，这些基因反映在用于计算预测托吡酯和IBD之间有效关系的表达特征中。

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药物复方托吡酯与克罗恩病基因表达特征的评估和比较。A） 克罗恩病特征（右）与托吡酯基因表达谱（左）的比较显示出一种普遍的反相关模式，表达模式最顶端和最底端的基因显示出普遍的对立表达模式。上调的基因以绿色显示。下调的基因以红色显示。途径和功能群显著富集（富集P（P）-值<0.05），25%的基因显示在右侧。B） qPCR结果显示TRPV1型和国际单项体育联合会30在动物验证研究中收集的结肠组织中，疾病状态（TNBS+载体）中的基因表达水平与药物治疗状态（TNBS+托吡酯）相对应，这从托吡酯和克罗恩表达特征的初始比较中证实了预期的对立关系。（n=12只/组）(*=P（P）<0.05, **=P（P）<0.005; Mann-Whitney U检验；误差线=SEM）

讨论

使用生物信息学基于整合公开可用基因表达数据的方法，我们推断抗惊厥药托吡酯可以作为一种新的IBD治疗方法，并进行了实验验证，证明托吡酯在改善TNBS诱导的IBD啮齿动物模型方面的功效。托吡酯的确切作用机制尚不清楚，但已知它能增强GABA激活的氯通道，在红藻氨酸和AMPA受体上显示活性，并抑制一些碳酸酐酶的活性(7). 托吡酯口服，经常用于治疗癫痫发作和偏头痛，并具有一定的抗抑郁活性。虽然托吡酯以前没有被建议作为IBD的治疗药物，但已经对其用于治疗肥胖和II型糖尿病的非标签用途进行了研究(8,9)最近被证明对多发性硬化症有疗效(10). 虽然在我们的研究中，托吡酯改善诱导的IBD表型的确切作用机制需要后续研究，这超出了初步研究的范围，但功能富集分析显示，与NF-kB信令,炎症反应,抗原呈递和其他与IBD病理生理学相关的功能过程在疾病和药物表达谱之间表达相反(图4).

使用TNBS诱导的IBD啮齿动物模型，我们证明，与相关载体治疗组（TNBS+载体）相比，用托吡酯（TNBS+topirate）治疗的诱导动物在疾病病理学的大体和微观测量方面都有所改善，终点甚至超过泼尼松龙治疗的阳性对照组。与溶媒治疗组（TNBS+溶媒）相比，托吡酯和泼尼松龙在治疗过程中均降低了腹泻的严重程度(图2)然而，只有托吡酯治疗组的大体病理学和微观损伤评分显著降低(图3B和3D). 虽然泼尼松龙是一种公认的治疗人类IBD的药物，并且通过我们的方法得到了正确的鉴定，但以前的研究报告称，泼尼松隆在化学诱导的IBD啮齿动物模型中的疗效有限(11). 泼尼松龙确实可以防止诱导溶媒治疗动物（TNBS+溶媒）粘膜层的完全丧失；然而，强的松可能具有强大的免疫抑制作用，从而大大减缓最初化学损伤的愈合速度，并可能使受损组织更容易受到继发性细菌感染。

尽管IBD啮齿动物模型的实验结果证实了我们从人类疾病基因表达测量中得出的计算预测，但仍有一些警告可能会限制对结果的解释。首先，我们仅在TNBS诱导的动物模型中证明托吡酯对IBD的疗效，我们承认托吡酯可能并不完全代表人类IBD的病理。其次，该模型的性质使其更能代表急性IBD发作，因此需要进一步研究以确定托吡酯是否可以作为人类慢性IBD的有效长期治疗方案。我们还注意到，在为PCR验证选择的八个基因中，只有两个在诱导未治疗组（TNBS+载体）和托吡酯治疗组（TNBS+托吡酯）之间显示出统计意义，然而，这可能是由于用于选择基因的人类肠组织之间基因表达的物种差异所解释的，和大鼠肠道组织。此外，该实验反映了一种急性治疗情景，其中一些基因可能只有经过较长时间的治疗才能达到不同的表达水平。最后，我们注意到，我们的研究仅评估了托吡酯的一个单一的，尽管相对保守的剂量，因此需要进行额外的研究来评估托吡酯治疗人类急性和慢性IBD的可能最佳剂量范围。

在本研究中，我们证明利用公共基因表达微阵列数据的计算方法可以用于推断IBD的新药物治疗，并提供实验证据证明抗惊厥药托吡酯能够改善TNBS诱导的IBD啮齿动物模型的疾病病理生理学。因为托吡酯已经被确定为一种安全有效的治疗人类神经系统疾病的药物，而且副作用通常比大多数通常用于治疗IBD的药物更有利(2,12)这些结果支持需要对托吡酯治疗人类IBD的使用进行额外的临床研究。此外，这些发现支持并激发了对未来研究的需求，通过这些研究，可以进一步开发利用公开可用的分子数据进行药物再利用的计算方法，并将其应用于导致现代人群发病率和死亡率显著增加的其他疾病。

方法

新型IBD疗法的计算预测和评估

如一篇合著论文所述，对新型IBD治疗方法进行了计算预测和评估。简而言之，克罗恩病和溃疡性结肠炎的公开基因表达测量数据来自NCBI GEO(5)使用先前发表的一项实验的数据，该实验测量了通过活检获得的人类肠道组织中的克罗恩病和特发性结肠炎（GDS2642）。使用AILUN系统将阵列探针映射到NCBI Entrez基因标识符(13). 在多个微阵列探针映射到同一NCBI基因标识符的情况下，我们平均了各个探针的表达值，并将平均值分配给该基因。我们创建了一个疾病基因表达特征（即。，疾病特征)通过使用微阵列显著性分析（SAM）软件推导受疾病影响的样本和健康对照样本之间的差异表达基因集(14).

我们系统地比较了从连接图中获得的药物基因表达谱(4)得出治疗评分。描述分数。采用随机化方法确定统计显著性，预测治疗得分低于显著性阈值的药物根据其得分按相反顺序排列。具有显著负分的药物具有与疾病基因表达模式反相关或相反的基因表达模式，因此代表了假定的新的治疗适应症。

IBD和托吡酯表达特征的功能分析

克罗恩和托吡酯标记中上调和下调基因的功能分析(图4)通过使用IPA（Ingenuity®系统，网址：www.intenuity.com). 该功能分析确定了对数据集最重要的生物功能和/或疾病。分析中考虑了受药物影响和疾病状况中排名最高和最低的25%与正常的基因，以及与灵巧知识库中的生物功能和/或疾病相关的基因。右尾Fisher精确检验用于计算p值，以确定分配给该数据集的每个生物功能和/或疾病仅由偶然性引起的概率。

托吡酯在IBD鼠TNBS模型中的实验评价

使用TNBS（三硝基苯磺酸，也称为苦基磺酸）诱导的IBD啮齿动物模型对治疗效果进行实验验证(15,16). 研究中使用了体重约300-350克的雄性Sprague-Dawley大鼠。在研究开始前，大鼠被禁食一晚。在2%异氟烷吸入麻醉下，通过离肛门4-5 cm的聚乙烯导管（PE-90）给大鼠直肠灌肠，给大鼠100 mg/kg体重（BW）稀释在50%乙醇中。对照组大鼠取等量溶媒（50%乙醇水溶液）。托吡酯（80mg/kg BW）溶于1M氢氧化钠（2.5%V/V）或托吡酯所用载体中，通过不锈钢喂食针口服，从服用TNBS的第二天开始，每天灌胃7天。每天监测大鼠的结肠炎（腹泻）症状。第8天，处死所有大鼠，并采集组织（结肠远端）进行宏观损伤评分和组织学检查。最初的试点研究每个治疗组使用8只动物。两项独立的复制研究每个治疗组使用了12只动物。最初的动物研究是在斯坦福大学医学院进行的。独立复制研究由Biomodels LLC（美国马萨诸塞州沃特敦）和MD Biosciences，Inc.（美国明尼苏达州圣保罗）进行。

qRT-PCR分析

RNA提取

使用TRIzol®（Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA）/Cloroform的标准方案从组织中提取RNA。简而言之，将冷冻结肠组织转移到1mL Trizol中，并使用转子-定子均质机（Polytron PT 1200 E Kinematica AG，Lucerne，Switzerland）进行均质。均质化并加入氯仿后，将组织悬浮液在4°C下离心15分钟，形成三相。随后使用异丙醇（100%）沉淀位于上层水相的总RNA。在75%乙醇中经过2次洗涤步骤后，将RNA造粒并在TE-Buffer中稀释（Ambion，Life Technologies，Foster City，CA）。RNA浓度由NanoDrop（NanoDrot，Thermo Fisher Scientific Inc.，Wilmington，DE）评估。在每种实验情况下都遵循标准的动物护理程序。

反向转录

对于cDNA合成，根据制造商的协议，使用Superscript III（Invitrogen，Carlsbad，CA）逆转录2μg总RNA。

基因表达分析

使用qRT-PCR在36个重复样品（12个对照、12个载体治疗、12个药物治疗大鼠）中评估了9个基因的转录水平，包括18S作为内源性控制基因。所有试剂均购自Applied Biosystems，反应在TaqMan HT7900机器上进行，共进行40个周期。基因表达分析具有以下登录号：18S（Hs99999901_s1）；ALOX5（Rn00563172_m1）；ALOX5AP（Rn00568506_m1）；TRPV1（Rn00583117_m1）；CHRM3（0560986_s1卢比）；IFI30（Rn01420317_m1）；MAPK3（Rn00820922_g1）；白介素-6（Rn01410330_m1）；IL-10（Rn00563409_m1）。使用ΔΔCt方法计算基因表达水平。

宏观损伤评估

通过检查研究结束时采集的切除结肠，以盲法评估宏观损伤评分（MDS）。移除远端结肠段（约5–7cm）后，纵向切割组织标本，用生理盐水轻轻冲洗，以清除粪便并拍照。由一名盲法观察者根据以下标准对组织损伤进行评分：0–无炎症，1–肿胀或发红，2–肿胀和发红，3–1或2个溃疡，4–2个以上溃疡或1个大溃疡，5–坏死。

组织病理学和显微损伤评估

将一块结肠组织放置在10%的福尔马林缓冲液中，并固定过夜。第二天，他们被石蜡包埋并切割成5微米的切片。切片用苏木精和伊红（H&E）染色，并在光学显微镜下进行检查。根据之前建立的评分系统对幻灯片进行评分(17).

内窥镜检查

使用小型动物内窥镜以盲法进行内窥镜检查（Karl Storz Endoskope，德国）。为了评估结肠炎的严重程度，用异氟醚麻醉动物，并对其下结肠进行视频内镜检查。

补充材料

补充表1

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补充视频1

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补充视频2

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补充视频3

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补充视频4

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致谢

这项工作得到了国家普通医学科学研究所（R01 GM079719）、霍华德·休斯医学研究所、美国药物研究与制造商基金会、露西尔·帕卡德儿童健康基金会、惠普基金会、美国国家医学图书馆（T15 LM007033）的支持。我们感谢斯坦福大学的Alex Skrenchuk和Boris Oskotsky提供的计算机支持，以及斯坦福大学的Eugene Davydov、Chung Do、Samuel Gross和Marc Schaub进行的建设性讨论。

工具书类

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