代谢型谷氨酸受体二聚体在激动剂激活和G蛋白偶联中的不同作用

mGluR 7TM的表达、洗涤剂溶解和纯化。

为了进一步研究单体mGlu 7TM结构域的功能，我们开发了一种体外方法，使用在脂质纳米盘中重组的纯化mGlu 7 TM，这是一种成功分离GPCR单体的方法(26——28). 为此，截断了mGlu5和mGlu2受体的7TM版本(23,29)携带FLAG表位和β2-肾上腺素受体N末端结构域(30)（详见SI材料和方法)利用重组杆状病毒技术在昆虫细胞中产生(31) (图S1). mGlu∆5∆保留其结合NAM的能力[^三H] -MPEP，带K（K）_d日8.8±0.7 nM，与报道的全长受体相似(32) (图S2A类). 然后使用0.12%Fos-胆碱14、0.01%（wt/vol）胆固醇半琥珀酸酯（CHS）和0.6%[3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨]-1-丙烷磺酸盐]（CHAPS）的脂状洗涤剂组合溶解Δ5Δ(图S2B类). 发现这些条件对于维持蛋白质的稳定性和保持其结合能力是最有效的[^三H] -MPEP。同样的条件也能有效地溶解密切相关的受体Δ2Δ。通过免疫色谱法纯化可溶性mGlu 7TM，并使用SDS/PAGE显示预期分子量（Δ5Δ为36.5kDa，Δ2Δ为362kDa）(图S2C类). 密度分析估计蛋白质的纯度约为70%。

分离的7TM重组成纳米盘保留其激活G蛋白的能力。

按照公布的方案，将纯化的∆2∆蛋白并入脂质纳米盘(33). 简言之，使用两种不同的比例将纯化的蛋白质与膜支架蛋白（MSP）MSP1E3D1以及1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）混合。当使用150:1:1的POPC:MSP:Δ2Δ比时，所得纳米盘制备物主要富集在含有∆2∆单体的结构中。尺寸排除色谱图很好地说明了这种富集(图2A类)和蓝色天然（BN）-PAGE分析(图2B类)，其中与预期单体（～100 kDa）对应的峰值占主导地位。相反，当使用90:1:1的比率时，含有两个∆2∆蛋白质（～140 kDa）的纳米盘对应的峰值占主导地位。使用两种不同比例的脂质、MSP和受体，可以分离出主要包含一个或两个mGlu2受体7TM结构域的纳米盘。电子显微镜显示出直径为12.6 nm的粒子，这与报道的视紫红质纳米盘的结果一致(26) (图S3)。

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图2。

含∆2∆的纳米盘的形成和生化特性。(A类)Δ2Δ纳米盘制剂的尺寸排除色谱图。(B类)BN-PAGE分析峰1和峰2A类含5μg总蛋白。Δ2Δ单体纳米盘对应于～100 kDa[2MSP（2×30 kDa）+1Δ2△（36.2 kDa，+脂质]带，而含有两个Δ2δ的纳米盘对应着～140 kDa（2×30+2×36.2 kDa+脂质）带。(C类)Δ2Δ单体纳米盘的结合性能。在室温下，随着MNI-136量的增加，将纳米盘（20μM）培养15分钟。色氨酸荧光值（λ_交易所=300 nm，λ_{相对长度单位}=345 nm），与配体受体浓度比（L/R）相对。

我们评估了在纳米盘中重组的7TM单体结合配体并与G蛋白偶联的能力。根据固有色氨酸荧光的变化，单体部分仍然可以结合mGlu2 NAM、MNI-136(34)，表观亲和力为770±60nM，最大影响为总荧光强度变化36%(SI结果和图S4A类). 为了估算结合化学计量比，我们测定了在高纳米盘浓度（20μM）下进行的平衡滴定的中断。这里，通过荧光变化监测配体结合，随着配体浓度的增加，配体结合呈线性增加，当所有可用的结合位点都被占据时，配体的结合就饱和了。我们观察到配体与受体的比率为0.8–0.9(图2C类)导致结合位点饱和，这表明在我们的制备中，80-90%的受体被正确折叠并能够结合配体。

重组单体∆2∆也可以有效激活纯化的Gαi2蛋白，正如Hamm及其同事描述的特征良好的核苷酸交换分析所证明的那样，并且基于色氨酸荧光测量(35). 鉴于PAM{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY487379”，“term_id”：“1371015382”}}LY487379磅在很大程度上增加了GTPγS的交换，NAM MNI-136显著降低了在单体∆2∆纳米盘存在的情况下测量的基本速率(图3A类)与∆2∆的轻微构成活性一致，也在转染细胞中观察到(图S5). 比较以下位置的值时t吨=0和t吨=40分钟，我们常规观察到PAM治疗后基础值增加了三到四倍，基础汇率(k个0.05±0.01分钟⁻¹和经PAM处理的k个0.15±0.02分钟的值⁻¹这些值与Gαi中基础和视紫红质催化的GTPγS交换的报告值一致(35,36). 此外，PAM和NAM效力（EC₅₀和IC₅₀分别为115±19 nM和430±60 nM(图3B类)，与在活细胞中获得的数据一致(29). 在含有突变∆2∆的空纳米盘或纳米盘中，未观察到PAM或NAM诱导的GTPγS交换，其激活G蛋白（Phe756Pro）的能力受损(37) (图3C类)尽管这个突变体能与PAM完美结合(SI结果和图S5B类)。

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图3。

Gi将∆2∆重组为纳米盘的耦合特性。(A类)10μM处理的Δ2Δ纳米盘中GTPγS与Gi的结合动力学{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY487379”，“term_id”：“1371015382”}}LY487379号（PAM）或10μM MNI-136（NAM）。数据分析如所述SI材料和方法.数据点表示三个代表性实验中三次测定的平均值±SEM。(B类)剂量-反应{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY487379”，“term_id”：“1371015382”}}LY487379号和MNI-136在Δ2Δ纳米盘上。数值对应于（Δ−Δ）给出的分数GTPγS结合_裁判)/(Δ_最大值−Δ_裁判)，式中Δ_裁判是I吗_第40页−I_t0（吨）PAM曲线无配体或NAM曲线有10μM PAM时的值。(C类)GTPγS结合（I_t40型−I_t0（吨）值），使用空纳米盘、纳米盘∆2∆WT或∆2ΔF756P在10μM PAM存在下测量。中的数据点B类和C类表示三个独立实验的平均值±SEM。

然后，我们检查了单体制剂的观察到的活性可能是由于含有Δ2Δ二聚体的少量纳米盘引起的。如果这种可能性是真的，那么含有两个Δ2Δ物种的纳米盘制剂的信号应高于单体制剂。情况显然并非如此(SI结果和图S6)，因为两种制剂都得到了相似的反应。这一发现并不是由于检测饱和，因为含有BLT1受体的纳米盘可以获得更大的信号(SI结果和图S6). 综上所述，这些数据表明，单个7TM的mGlu受体可以以单体形式激活G蛋白。

mGluRs的表达和纯化。

截短的mGlu和mGlu2-C121A受体的构造和特征描述见SI材料和方法.Sf9昆虫细胞在28°C的insect-Xpress培养基（Lonza）或Ex-Cell 420（Sigma）培养基中悬浮培养。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）在Sf9细胞中生成重组杆状病毒。对于受体纯化，Sf9细胞培养物的感染密度为～3×10⁶每毫升含有适当病毒的细胞数，60小时后通过离心（5000×10分钟克). 在用于纯化之前，细胞颗粒保持在−80°C。膜制备和结合实验协议见SI材料和方法如前所述，在M1 Flag抗体亲和树脂（Sigma）上进行受体纯化(31,52)。

纳米盘的制备。

如所述纯化膜支架蛋白MSP1E3D1和MSP1D1(53). 将适量的MSP1E3D1或MSP1D1和1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰胆碱（POPC）（Avanti Polar Lipid）在不存在的情况下（空圆盘）或与纯化受体在4°C下孵育1小时。自组装过程通过使用0.5 g BioBeads SM-2（Biorad）对1 mL混合物进行清洁剂去除来启动，并允许在4°C下过夜。然后通过离心去除生物球，将回收的上清液浓缩至500μL，并离心5 min 20000×克加载到自制柱（直径10 mm，长度400 mm）上之前，该柱由Superdex S200树脂（GE Healthcare）制备。在室温下，在含有20 mM Hepes（pH 7.5）和50 mM NaCl的缓冲液中进行尺寸排除色谱。按照Schägger小组的描述，通过BN-PAGE电泳汇集并分析感兴趣的峰(54)以及通过负染色透射电子显微镜（如SI材料和方法). 考虑到30000 M的摩尔吸收系数，通过UV吸光度估算纳米盘浓度⁻¹厘米⁻¹用于MSP1E3D1，21400 M⁻¹厘米⁻¹用于MSP1D1，36000 M⁻¹厘米⁻¹对于Δ2Δ和100000 M⁻¹厘米⁻¹用于mGlu2-C121A。

我们感谢Juan Jose Fung、Aashish Manglik（斯坦福大学）、Cathy Royer（蒙彼利埃生物结构中心）和Laátitia Comps-Agrar（蒙彼里埃大学盖诺米克·福辛内尔研究所）对手稿的批判性阅读；Gilles Tamagnan（纽黑文神经退行性疾病研究所）为我们提供了mGlu2-阴性变构调节剂；与Thierry Durroux（蒙彼利埃大学盖诺米克学院）进行建设性讨论。这项工作得到了CNRS、INSERM、“Recherche国家机构”授权ANR-09-PIRI-0011和Bettencourt Schueller基金会的支持。