IDH突变损害组蛋白去甲基化并导致细胞分化阻滞

3T3-L1细胞分化，油红O染色

如前所述，进行3T3-L1细胞分化和Oil-Red-O染色²⁴简而言之，用含有0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、5μg/ml胰岛素和5μM曲格列酮（均来自Sigma）的鸡尾酒刺激融合的3T3-L1细胞以诱导分化。分化2天后，将细胞保存在含有胰岛素的培养基中，直至准备收获。对于Oil-Red-O染色，细胞在PBS中清洗，然后在室温（25°C）下用3%多聚甲醛固定20分钟。然后用去离子水清洗细胞，并用Oil-Red-O溶液染色。为了定量，将Oil-Red-O染色溶解在异丙醇中，并在500 nm处测量吸光度。

体外组蛋白去甲基化酶测定

组蛋白去甲基化酶测定如前所述进行²⁵简而言之，在含有50 mM Tris-HCl pH 8.0、蛋白酶抑制剂混合物、1 mMαKG、100μM FeSO的反应混合物中，将4μg散装小牛胸腺组蛋白（Sigma）与GST标记的KDM4C（1.42μg；BPS Bioscience）孵育₄和2 mM抗坏血酸在37°C下放置4小时，在没有或存在不同浓度的d日-2HG或我-2HG（西格玛）。用特异性抗体通过免疫印迹法分析反应混合物。

细胞培养、转染和转导、细胞系的生成

293T细胞，通过E6/E7/hTERT永生化的NHA细胞（由R.Pieper提供²⁶)和3T3-L1细胞在含有10%胎牛血清（FBS；CellGro）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Invitrogen）中培养。为了在293T细胞中表达野生型和突变型IDH1/2，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。为了产生IDH2逆转录病毒和转导3T3-L1细胞，72小时后收集转染pCL-Eco辅助病毒和质粒的293T细胞的上清液，过滤并应用于细胞过夜。为了产生野生型或突变型IDH2稳定表达的3T3-L1细胞系，细胞在2.5μg ml⁻¹逆转录病毒转导后，给予嘌呤霉素7天。获得耐嘌呤霉素细胞的集合，然后在嘌呤菌素中持续培养。为了产生IDH1逆转录病毒和转导NHA细胞，用等量的pVSV-G（Clontech，631512）和质粒转染GP2-293细胞（Clontech631458）的磷酸钙。在转染后第2天和第3天收集病毒，并将其置于对数生长的细胞上。感染后，将细胞置于800μmg ml⁻¹G418（Invitrogen）产生稳定的细胞系。对于KDM4C的siRNA敲除，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）进行转染，使用靶向KDM4C的siRNAs（#1:sense，5′-GCUUGAUCCCAAGAUAATT-3′；antisense，5′-UAUCU GGGAUUCAAGCTT-3′；#2:sense，5'-CAAAGUAUCUUGGAUCAAATT-3’；antisnse，5'-UUUUGAUCAAGAUACUUGCC-3′；#3：感觉，5′-GAGGAGUU UCGGGAGUUCAACAAAAU-3′；反义，5′-AUUUGUGAAACUCCCGAA ACUCCUC-3′）或非靶向对照（Dharmacon，#D-001810-01-20），浓度为40 nM。

突变分析

对于IDH突变分析，提取肿瘤基因组DNA，并通过PCR扩增IDH1密码子132和IDH2密码子140和172周围的区域，然后进行测序。IDH1分析使用正向引物5′-ACCAAATGGCACATACGA-3′和反向引物5’-TTCAACCTTGCTTAATGGGTGT-3′进行扩增，引物5'-CGGTCTTCAG AAGCCATT-3′进行测序¹IDH2分析使用正向引物5′-CAGAGAGAGGATGGCTAGG-3′和反向引物5’-GTCTGCCTG TTGTTG-3′进行扩增，并使用相同的正向引物进行测序²⁷在分析的42个肿瘤中，41个具有足够的高质量基因组DNA来识别IDH突变状态。无法归类为IDH野生型或突变型的一个样本被排除在进一步分析之外。

质粒构建

人IDH1的cDNA克隆({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC012846.1”，“term_id”：“15277487”}}BC012846.1号)从pCMV-Sport6的美国型培养物收藏中心和人类IDH2购买({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC009244”，“term_id”：“33871351”}}BC009244号)在pOTB7中从Invitrogen购买。采用标准的定点突变技术，通过在IDH1开放阅读框（ORF）中引入G395A碱基对的改变来生成IDH1 R132H。IDH2 R172K是通过在IDH2 ORF中引入G515A变更而制成的，而IDH2 R140Q是通过G419A变更制成的。然后将野生型和突变序列亚克隆到LPC载体中。在293T细胞中表达和逆转录病毒产生之前，通过直接测序确认所有序列。用于神经圈感染的逆转录病毒构建物是通过从先前制作的载体中用NotI和PacI限制酶切除野生型IDH1和IDH1 R132H，并将其并入pQCXIH（Clontech，631516）逆转录病毒载体而生成的。

组蛋白提取和蛋白质印迹

对于组蛋白酸提取，细胞在低渗裂解缓冲液中进行裂解（10 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂，0.5mM DTT，蛋白酶抑制剂）1小时₂SO公司₄在4°C的温度下旋转过夜，添加至0.2 N。旋下并收集上清液后，蛋白质在33%TCA中沉淀，用丙酮洗涤，然后在去离子水中重新悬浮。对于全细胞裂解物，细胞在标准RIPA缓冲液（1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1%Triton X-100、0.01 M Tris pH 8.0和0.14 M NaCl）中进行裂解和超声处理，然后在14000下离心裂解物克收集上清液并测量总蛋白浓度。对于western blotting，用SDS–PAGE分离裂解产物，转移到硝化纤维素膜上，在含有0.5%吐温-20的PBS中的5%非脂肪乳中封闭，用一级抗体进行探测，并用辣根过氧化物酶结合的抗兔或抗鼠抗体（GE Healthcare，NA934V和NA931V）进行检测。使用的主要抗体有：抗IDH1（Proteintech，12332-1-AP）、抗IDH2（Abcam，ab55271）、抗GST标记（Millipore，05-311）、抗H3K9me2，抗KDM4C（Abcam，ab85454）、抗乙酰基H3（Upstate，06-599）、抗H3（Cell Signaling Tech，4499）、反管蛋白（Sigma，T9026）、抗GFAP（Cell信号技术，3670）、抗β3-微管蛋白（Cell信令技术，5666）、抗p85（Millipore，06-195）、抗巢蛋白（Millipose，MAB5326）、反β-肌动蛋白（Simma，A5316）。抗IDH1 R132H突变抗体是Agios Pharmaceuticals赠送的。根据制造商的说明，使用Image J软件对western印迹带强度进行量化。

代谢物提取，GC-MS

轻轻去除培养基后，用冰镇80%甲醇快速淬火细胞，并在−80°C下培养20分钟。超声处理后，然后在14000℃下离心提取物克在4°C下保持20 min以去除沉淀蛋白，并在氮气下干燥上清液层中的水性代谢物。对于293T细胞，通过在去离子水中重新溶解干燥提取物，进一步纯化有机酸，然后在用五个柱体积洗涤后，用3 N HCl从AG-1 X8 100–200阴离子交换树脂（Bio-Rad）中洗脱。

对于GC-MS分析，将干燥提取物重新溶解在乙腈和N-甲基-N的1:1混合物中-第三种-丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA；Regis）并在70°C下加热75分钟以衍生代谢物。然后使用HP-5MS毛细管柱将样品注入安捷伦7890A GC中，并连接至安捷伦5975 C质量选择检测器，该检测器采用电离电压为−70 eV、电子倍增器设置为1060 V的电子碰撞电离，以无拆分模式运行。GC温度在100°C下启动3分钟，以4°C最小温度上升至230°C⁻¹保持4分钟，然后上升到300°C并保持5分钟。质量范围为50–500阿穆以每秒2.71次扫描的速度记录。使用从Sigma获得的标准物确认2HG代谢物峰的鉴定。通过峰面积积分量化2HG和谷氨酸信号强度。

定量实时PCR

使用Trizol（Invitrogen）分离RNA。与DNA酶孵育后，使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）合成cDNA。在7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上使用Taqman基因表达分析（AppliedBiosystes）进行定量PCR。基因表达数据归一化为18S rRNA。

炸薯条

使用Millipore Magna ChIP G试剂盒进行ChIP测试（Millipore，17-611）。简而言之，2000000个细胞在室温下与1%甲醛交联10分钟。用冷PBS洗涤后，离心细胞并在500μl SDS裂解缓冲液中在冰上裂解10分钟。然后使用生物破坏者声波仪（Diagenode）对裂解液进行声波处理，将DNA剪切至约200-600 bp。将样品离心下来，将50μl上清液稀释10倍后，用磁珠隔夜用于每次免疫沉淀。使用的主要抗体（每ChIP 3μg）为：抗H3K9me3（Abcam，ab8898）和抗H3K27me3（Millipore，17-622）。使用正常兔IgG（Millipore，12-370）作为对照，并显示出最小的富集。第二天，在低盐免疫复合物缓冲液、高盐免疫复合液缓冲液、氯化锂免疫复合液和TE缓冲液中清洗样品。组蛋白复合物在65°C的洗脱缓冲液和蛋白酶K中洗脱2 h。使用柱回收DNA。对纯化的DNA样品进行定量PCR。使用的底漆有：阿迪波克正向，5′-ATGGCTGAACCACACACATCA-3′；反面，5′-AGGGGTCAGGAGA CCTCCCTTT-3′；Cebpa公司正向，5′-CTGGAAGTGTGTGGACTTAGAGG-3′；背面，5′-GAGTGGAGACATAGTGCTAG-3′。数据点（Ct）转换为输入百分比。

定量DNA甲基化分析

使用MassARRAY EpiTyper（Sequenom）对从3T3-L1细胞中提取的亚硫酸氢转化DNA进行矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间质谱。MassARRAY底漆设计如前所述^28,29.

免疫组织化学

使用Discovery XT处理器（Ventana Medical Systems）进行免疫组织化学检测。将组织切片在含0.2%BSA/PBS的10%正常山羊血清中封闭30分钟，然后用0.1μg ml孵育5小时⁻¹兔多克隆抗H3K9me3抗体（Abcam，ab8898）或1μg ml⁻¹兔多克隆抗H3K27me3（Millipore，07-449）抗体，并与生物素化山羊抗兔IgG（Vector labs，PK6101）以1:200稀释度孵育60分钟。使用DAB-MAP套件（Ventana Medical Systems）进行检测。整个幻灯片由蔡司Mirax扫描（卡尔蔡司）使用X20/0.8物镜进行扫描。扫描的图像被导出到图像分析软件Metamorph（Molecular Devices）中。确定DAB阳性细胞核的颜色阈值，并为所有图像设置颜色阈值。DAB信号和苏木精反染总核阈值以上的区域以自动方式测量。计算并分析了这两个参数之间的比值，以获得统计学显著性。

1-辛基的合成-d日-2-羟基戊二酸

商业对将（-）-四氢-5-氧呋喃-2-羧酸（140 mg，1.076 mmol）溶解在H中₂O（1 ml），冷却至0°C并用1 N KOH（2.16 ml，2.15 mmol）处理。在此温度下将所得溶液搅拌5 min，并在环境温度下搅拌2 h。然后将其浓缩至减压干燥并干燥。将残渣在0℃下溶解于三氟乙酸酐（8 ml）中，在0℃搅拌30 min，在室温下搅拌2 h，然后在减压下蒸发挥发物。将残留物干燥并溶解在无水四氢呋喃（6 ml）中。将辛醇（0.3 ml，2.1当量）添加到0°C的溶液中，并在环境温度下将混合物搅拌过夜。添加水以冷却反应，并用EtOAc萃取混合物。合并提取物经MgSO干燥₄，通过快速色谱法（EtOAc:己烷1:3和1:1）浓缩和纯化，得到1-辛基-d日-2-羟基戊二酸（110 mg，39%）。

神经球的分离、培养和分化

产后六天墨水4a/Arf空(第16页/第19页^−/−)处死小鼠，将分离的脑室下区进行化学（Pronase E，Calbiochem 7433-2）和机械分离，以获得完全神经基底培养基中的单细胞悬浮液（神经基底培养液，GIBCO 21103；不含维甲酸的B27补充剂，GIBCO12587-010；谷氨酰胺，GIBCO35050；20 ng ml⁻¹EGF，研发系统236-EG；20纳克毫升⁻¹基本FGF，Millipore GF003）。第二天，细胞被旋转下来，重新悬浮在新鲜培养基中，一旦在培养基中形成神经球，收集这些球，并将其化学分解（Accumax，Innovative Cell Technologies AM105）回到新鲜培养基的单个细胞中。

最终感染后一天，将感染的神经球和未感染的对照物放入400 mgμl⁻¹湿霉素B（InvivoGen，ant-hg-1）。一旦选择完成，将保存在全神经基底培养基中的等基因细胞系化学分解为单个细胞，并在全神经基础培养基中以相同密度镀上维甲酸（Sigma-Aldrich，R2625）。72小时后收集细胞，并通过western blotting分析蛋白质的表达。

CpG总甲基化的测量

如前所述评估DNA甲基化³⁰简言之，1×10⁶用PBS清洗NHA细胞，并在室温下用2%多聚甲醛固定10分钟，用0.5%Triton X-100渗透10分钟。然后在室温下，用2 N HCl处理细胞20分钟，然后用100 mM Tris-HCl（pH 8.0）中和。细胞与抗5-甲基胞嘧啶抗体（Calbiochem，NA 81）在室温下以1:100稀释培养30分钟。用PBS洗涤后，将细胞与二级抗体偶联ALEXA FLUOR 488（Invitrogen）在黑暗中孵育30分钟。使用Becton Dickinson Calibur流式细胞仪进行流式细胞术，并使用FlowJo软件进行分析。

我们感谢汤普森实验室的成员对手稿的技术帮助和批判性阅读。我们感谢T.A.Gocke和宾夕法尼亚大学基因组核心对微阵列研究的帮助；纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）的分子细胞学核心设施，为免疫组织化学研究提供技术帮助；O.Ouerfelli和M.K.Spassova担任MSKCC有机合成核心，负责合成辛基-2HG。这项工作得到了国家癌症研究所和国家卫生研究院的资助。R.L.L.是霍华德·休斯医学院的早期职业奖获得者，也是MSKCC的杰弗里·比恩初级主席。D.M.O·R。由宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心贝齐·科恩基金会资助。I.K.M.得到了NCI-U54CA143798、多丽丝·杜克慈善基金会和美国临床肿瘤学会颁发的胶质瘤高级临床研究奖的支持。