糖尿病。2012年11月；61(11): 2763–2775.
死亡蛋白5和p53凋亡预调节调节剂介导内质网应激-线粒体对话触发脂毒性啮齿动物和人β细胞凋亡
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,三 ,4 ,4 ,5 ,5 ,1和1,6
丹尼尔·库尼亚
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
玛丽亚娜·伊戈利洛·史蒂夫
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
埃斯特班·古尔佐夫
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
卡拉·杰尔马诺
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
纳吉布·纳曼
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
伊萨内·马霍夫（Ihsane Marhfour）
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
Makiko Fukaya先生
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
Jean-Marie Vanderwinden女士
2比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学神经生理学实验室
康尼·吉塞曼
三比利时鲁汶卡托利克大学医学院实验医学内分泌学实验室
香塔尔·马修
三比利时鲁汶卡托利克大学医学院实验医学内分泌学实验室
希瑟·P·哈丁
5剑桥大学代谢研究实验室和英国剑桥NIHR剑桥生物医学研究中心。
大卫·罗恩
5剑桥大学代谢研究实验室和NIHR剑桥生物医学研究中心，英国剑桥。
Décio L.艾齐里克
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
米里亚姆·科诺
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
6比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学伊拉斯谟医院内分泌科
1比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学实验医学实验室
2比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学神经生理学实验室
三比利时鲁汶卡托利克大学医学院实验医学内分泌学实验室
4意大利比萨比萨大学内分泌与代谢系
5剑桥大学代谢研究实验室和英国剑桥NIHR剑桥生物医学研究中心。
6比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学伊拉斯谟医院内分泌科
摘要
环境因素，如富含饱和脂肪的饮食，会导致糖尿病患者胰岛β细胞的功能障碍和死亡。饱和脂肪酸在β细胞中引发内质网应激。在这里，我们表明棕榈酸诱导的β细胞凋亡是由固有的线粒体途径介导的。通过微阵列分析，我们确定了棕榈酸酯触发的内质网应激基因表达特征以及BH3-only蛋白死亡蛋白5（DP5）和p53预调节凋亡调节剂（PUMA）的诱导。敲除任何一种蛋白减少的细胞色素c（c）大鼠和人β细胞的释放、caspase-3激活和凋亡。DP5（DP5）诱导依赖于肌醇需要酶1（IRE1）依赖的c-Jun NH2-末端激酶和PKR样ER激酶（PERK）诱导激活转录因子（ATF3）与其启动子结合。彪马通过tribbles 3（TRB3）调节AKT抑制和FoxO3a激活，PERK/ATF3的表达也是依赖性的。DP5（DP5）−/−高脂饮食诱导的小鼠糖耐量下降受到保护，胰腺β细胞质量增加两倍。这项研究阐明了脂毒性内质网应激与线粒体凋亡途径之间的相互作用，后者导致糖尿病中β细胞死亡。
全球2型糖尿病（T2D）患病率已达2.5亿，预计到2030年将增至近4亿(1). 在不利的遗传背景下，摄入富含饱和脂肪的高热量饮食是T2D发病的原因。外周组织中的胰岛素抵抗是T2D的主要特征，但糖尿病只发生在无法维持胰岛β细胞胰岛素释放代偿性增加的患者中。凋亡导致的β细胞质量损失是T2D患者进行性β细胞衰竭的原因之一(2). 饮食或脂肪酸衍生的游离脂肪酸（FFAs）导致T2D患者外周胰岛素抵抗和β细胞功能障碍及死亡。慢性高脂肪饮食（HFD）会导致胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗，从而导致高血糖(三,4)以及在体外暴露于饱和和较小程度的不饱和FFA会导致β细胞功能障碍和死亡(5,6).
FFA如何引起β细胞凋亡尚不清楚。一些研究表明内质网应激是一种潜在的介质(7–10). ER功能的扰动启动由三种ER跨膜蛋白控制的未折叠蛋白反应（UPR）：PKR样ER激酶（PERK）、肌醇需要激酶-1（IRE1）和激活转录因子（ATF）6。UPR的主要功能是通过减少蛋白质负荷、增加ER折叠能力和错误折叠的蛋白质降解来恢复ER稳态。蛋白质翻译的减弱是由PERK通过真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化来执行的，而另外两个分支通过上调内质网伴侣和内质网相关的蛋白质降解机制来增加内质网功能。未解决的内质网应激导致细胞死亡(11,12). ER应激可能导致T2D患者的β细胞衰竭，因为在T2D患者的胰岛中发现了ER应激标志物的表达增加，包括ATF3和C/EBP同源蛋白（CHOP；也称为GADD153或DDIT3）(11). 延长eIF2α磷酸化通过线粒体途径诱导β细胞凋亡(13–15)但脂毒性内质网应激反应如何最终触发和执行β细胞凋亡尚不清楚。
细胞死亡的内在或线粒体途径受到B细胞淋巴瘤（Bcl）2家族蛋白的严格调控，该家族由抗凋亡（Bcl-2、Bcl-XL、Bclw-、髓细胞白血病序列[Mcl]1和A1）和促凋亡成员组成，这些成员进一步细分为多域（Bax、Bak和Bok）和BH3-only蛋白（死亡蛋白5[DP5，也称为harakiri]、Bim、Bid、p53凋亡预调节调节剂[PUMA，也称为BBC3]、Bad和Noxa）(16). 细胞凋亡始于Bax从细胞质转移到线粒体膜，在线粒体膜上与Bak寡聚。Bax/Bak形成的孔导致线粒体外膜渗透，从而允许细胞色素等可溶性蛋白质c（c）扩散到细胞溶质。随后凋亡小体的形成导致caspase 9激活和caspase 3介导的细胞死亡。BH3-only蛋白以依赖细胞类型和刺激的方式诱导凋亡。这些蛋白质通过结合和抑制原存活的Bcl-2成员的能力，以及通过直接激活Bax和Bak，成为凋亡的重要启动子(17). BH3-only蛋白是转录调控的，有些，包括Bim和Bid，是翻译后修饰的。c-Jun NH2-末端激酶（JNK）在调节线粒体凋亡途径中起重要作用(18). JNK通过磷酸化激活Bax、Bim和Bad(19–21)上调肝细胞和神经元中的Bim、PUMA和DP5(22,23).
在这项研究中，我们使用了全球基因表达分析，然后进行了一系列综合性的重点实验，以表征脂毒性β细胞死亡中的凋亡途径及其受内质网应激反应的调节。我们证明棕榈酸激活JNK和PERK有助于诱导BH3-only蛋白DP5和PUMA，并且我们阐明了内质网应激-线粒体对话触发脂毒性β细胞凋亡，从而为预防T2D早期β细胞死亡提供了新的靶点。
研究设计和方法
INS-1E和初级荧光激活细胞分选机的培养-纯化大鼠β-和人胰岛细胞和功能研究。
INS-1E和初级荧光激活细胞分选器纯化的大鼠β细胞的培养在补充数据.
人类胰岛（来自4名63±7岁的供体，BMI 25±1 kg/m2采用胶原酶消化法和密度梯度纯化法分离脑出血死亡原因。如前所述，对胰岛进行培养、分散和转染(24). 胰岛素免疫荧光检测β细胞百分比(9)为69±11%。
对于FFA暴露，将原代β细胞培养在含有1%BSA但不含FBS的培养基中，将INS-1E细胞培养在含1%FBS和1%BSA的培养基上(5). 油酸盐和棕榈酸酯（Sigma，Schnelldorf，德国）溶解在90%乙醇中(6)并以0.5 mmol/L的最终浓度使用，在1%BSA的存在下，会导致游离FFA浓度在纳米摩尔范围内(5). 在FFA暴露之前和期间，以10μmol/L的浓度使用化学JNK抑制剂SP600125（Sigma）和肽JNK抑制物L-TAT-JNKi 2 h(9). 在FFA暴露期间，以25μmol/L的浓度使用IRE1抑制剂4μ8C(25).
有关微阵列分析、实时PCR引物、RNA干扰、染色质免疫沉淀（ChIP）、启动子报告分析和抗体的详细信息，请参阅补充数据.
β细胞凋亡评估。
用脱氧核糖核酸结合染料碘化丙啶（5μg/mL）和Hoechst 33342（10μg/mL）染色后，在荧光显微镜下计数凋亡的β细胞和INS-1E细胞(15). 通过其他方法证实细胞凋亡，包括Bax易位、caspase 9和3裂解以及细胞色素c（c）释放，按别处所述进行测量(13).
老鼠研究。
男性DP5（DP5）−/−和野生型（WT）C57BL/6J小鼠给予标准食物（脂肪占热量摄入的10%，D12450B）或HFD（脂肪占热量摄入的60%，D12492；研究饮食）。12周后，通过注射葡萄糖（2 mg/g体重）对禁食16小时的小鼠进行腹腔内葡萄糖耐量试验。在时间0、15、30、60、90和120分钟从尾部采集血液，并用FreeStyle Lite血糖仪（Abbott Diabetes Care）测量葡萄糖。通过离心分离血浆（10分钟，5000克)并储存在−20°C。使用超敏小鼠ELISA试剂盒（伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫Crystal Chem）测量血浆胰岛素。对于腹腔内胰岛素耐受性测试，在禁食4小时后注射0.75 mU/g体重的Actrapid（Novo Nordisk），并在前面列出的时间点测量血糖。
β-细胞质量。
在25周后用不同的饮食杀死小鼠，取其胰腺。用标准免疫过氧化物酶法标记三个间隔150µm的非连续5µm厚胰腺切片，石蜡切片用小鼠抗胰岛素抗体（1/4000；Sigma）。β细胞质量被盲目量化为β细胞体积密度乘以胰腺重量(26). 为了评估β细胞大小，核拥挤被确定为每100μm的β细胞核数2β细胞细胞质(27). 按照补充数据。
葡萄糖刺激胰岛素分泌。
隔离后，DP5（DP5）−/−和WT小鼠胰岛在含有5.6 mmol/L葡萄糖的M199培养基中培养30分钟，并用改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES溶液（150 mmol/LNaCl、3.5 mmol/LKCl、0.5 mmol/LMgCl）洗涤2，1.5 mmol/L氯化钙2，5 mmol/L NaHCO三，0.5毫摩尔/升NaH2人事军官4、10 mmol/L HEPES和0.1%BSA（pH 7.4）。用含有1.7或16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES溶液孵育1小时，诱导胰岛素分泌。用ELISA法测定无细胞上清液和酸乙醇提取的细胞裂解液中的胰岛素。
统计分析。
数据表示为所示数字的平均值±SE(n个)独立实验。通过方差分析进行比较，然后进行配对t吨使用Bonferroni校正进行多重比较的测试。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
棕榈酸酯通过线粒体凋亡途径诱导β细胞死亡。
棕榈酸酯诱导的细胞色素c（c）线粒体释放()，Bax从胞浆转运到线粒体()以及caspase 9和3激活()证明棕榈酸酯参与胰腺β细胞凋亡的内在途径。油酸能减少细胞死亡(5,13)不刺激细胞色素c（c）释放。在一项时间过程研究中，棕榈酸酯从16小时起降低Bcl-2蛋白表达，与BCL2级信使核糖核酸表达(补充图1). Bcl-2的敲除诱导细胞凋亡并使细胞对FFAs敏感(补充图1B类). 棕榈酸酯也降低了Bcl-XL蛋白水平，但仅在24小时的后期(补充图2A类). 与Bcl-2类似，Bcl-XL敲低诱导β细胞凋亡(补充图2B类). 这些结果证实了Bcl-2和Bcl-XL在基础和脂毒性条件下对β细胞的抗凋亡作用。棕榈酸酯处理细胞的线粒体形态呈点状，而对照细胞的网状腺苷5′-三磷酸（ATP）合成酶β染色呈点状(补充图1C类和D类)这与Bcl-2蛋白表达的显著下降相一致，表明棕榈酸酯消耗Bcl-2有助于线粒体网络的破坏。
棕榈酸酯通过线粒体途径诱导细胞凋亡。A类：将INS-1E细胞暴露于棕榈酸酯中24小时并进行细胞色素染色的典型免疫荧光图像c（c）（绿色）和DNA（带有Hoechst 33342，蓝色）（bar 20μm）。B类：用棕榈酸酯处理24小时的INS-1E细胞的代表性免疫荧光图片，并染色Bax（红色）、ATP合成酶β（绿色）和DNA（Hoechst，蓝色）（条形代表20μm）。箭头指向Bax易位到线粒体的细胞。C类：线粒体Bax易位或细胞色素的INS-1E细胞百分比c（c）棕榈酸酯处理指定时间后的释放(n个= 3–4).D类：用棕榈酸酯处理24小时的INS-1E细胞的共焦显微镜，并对Bax（绿色）、ATP合成酶β（红色）和DNA（Hoechst，蓝色）进行染色(顶部). 通过共焦显微镜图像中的线扫描测量3个对照细胞和4个棕榈酸酯处理细胞的Bax和ATP合成酶β的荧光强度散点图。线性回归显示棕榈酸酯处理的细胞紧密相关(右下角)与控制条件相比(左下角)提示Bax易位到线粒体。E类：通过Western blot分析棕榈酸酯处理的INS-1E细胞中caspase 9和3激活的时间进程。显示了3个独立实验的代表性印迹*P（P）与对照组相比<0.05。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
棕榈酸酯调节β细胞中的细胞死亡和其他基因网络。
接下来，我们分析了INS-1E细胞暴露于棕榈酸酯6和14小时后的整体基因表达。在阵列分析中，检测到对照细胞或棕榈酸酯处理的β细胞中存在20405个对应于10524个基因的探针组。棕榈酸酯分别在6小时和14小时改变了6.7%（792个基因）和8.2%（1074个基因）探针组的表达。顶级功能簇包括基因表达、脂质代谢、细胞生长、细胞功能和维持以及6小时时的细胞妥协和14小时时的死亡、细胞功能、细胞妥协、蛋白质合成和脂质代谢。两个网络富含促凋亡信号分子。6小时后，棕榈酸酯上调内质网应激标记物，包括ATF4、ATF3、CHOP、生长停滞和DNA损伤蛋白34和TRB3(补充图3)这与我们之前关于UPR的PERK分支中促凋亡信号的研究结果一致(9,15). 14小时时，我们检测到一个线粒体细胞死亡基因网络，其中包含DP5（DP5）和彪马,PERK公司、和六月提高管理水平(补充图4).
基因也通过之前描述的人工筛选进行分类(28)根据它们在β细胞功能障碍和死亡中的潜在作用(补充表1). 棕榈酸酯降低参与糖酵解和柠檬酸循环的葡萄糖代谢基因的表达，并上调脂质代谢基因，如Acsl公司,Cpt1a型、和传真1AP-1转录因子家族，包括c-6月和c-Fos基因，在两个时间点都被诱导。在UPR的不同分支中诱导了介导ER功能和信号转导的基因，包括自动变速箱3,ATF4型,CHOP公司、和三号机房还有第61a1节和Dnajc3号机组(补充表1). 生产基因的mRNA表达，如巴克斯,贝克，和比姆没有显著改变；然而，BH3-only蛋白DP5和PUMA显著上调。在这些基因表达分析的基础上，进一步研究了这两个Bcl-2成员在线粒体β细胞死亡中的作用。
BH3-only蛋白DP5和PUMA有助于棕榈酸酯诱导的细胞凋亡。
通过实时PCR，我们证实了棕榈酸酯诱导的DP5（DP5）表达，16小时后达到最大值(). 另一方面，油酸盐没有诱导DP5（DP5）表达式(). 通过RNA干扰高效敲除DP5()还原细胞色素c（c）棕榈酸酯处理细胞的释放、caspase3激活和凋亡()但不能阻止轻度油酸诱导的细胞凋亡(). 棕榈酸酯诱导DP5（DP5）在原代大鼠β细胞中()和DP5敲除部分保护β细胞免受棕榈酸(). 在人类胰岛细胞中，棕榈酸酯也能诱导DP5（DP5）()和DP5敲除保护细胞免受脂肪毒性().
棕榈酸酯诱导DP5（DP5）表达有助于β细胞死亡。A类：时间进程分析DP5（DP5）油酸或棕榈酸处理的INS-1E细胞中mRNA的表达(n个= 4).B类:DP5（DP5）转染阴性或阴性的INS-1E细胞的mRNA表达DP5（DP5）siRNA和棕榈酸处理16小时(n个= 5).C类：细胞质细胞色素c（c）转染阴性（N）或DP5（DP5）（D） siRNA和棕榈酸酯处理16 h。凋亡诱导因子（AIF）的表达被用作线粒体控制，β-肌动蛋白被用作细胞质控制，α-微管蛋白被用作caspase 3印迹的蛋白质负载控制。右侧的单独斑点显示了非细胞溶质部分，包括线粒体，用作细胞色素的阳性对照c（c）以及AIF印迹。显示了5个独立实验的代表性印迹。D类：转染阴性或阴性的INS-1E细胞的凋亡DP5（DP5）siRNA，然后用油酸盐或棕榈酸盐处理16小时(n个= 3–4).E类:DP5（DP5）转染阴性或阴性大鼠β细胞的mRNA表达DP5（DP5）siRNA并用棕榈酸酯处理24小时，然后评估细胞凋亡(n个= 4).F类：通过敲除分散的人类胰岛细胞中的DP5，防止棕榈酸诱导的细胞死亡。细胞被转染DP5（DP5）siRNA和2天后暴露于棕榈酸酯24小时(n个= 4). GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶*P（P）对于未处理的细胞，<0.05#P（P）< 0.05.
彪马棕榈酸显著诱导，16小时达到峰值，但油酸盐没有诱导(). PUMA的淘汰()棕榈酸诱导的细胞色素减少c（c）释放、caspase 3激活与细胞凋亡()，但不影响油酸盐毒性(). 棕榈酸酯也被上调彪马荧光活化细胞分选仪纯化的大鼠β细胞和人胰岛细胞的表达().彪马RNA部分干扰()几乎完全()分别防止了原代大鼠β细胞和人胰岛细胞的棕榈酸酯毒性。作为阴性对照，我们研究了一个在阵列分析中未检测到改变的基因，即比姆与DP5和PUMA不同，比姆不是由棕榈酸酯诱导的(补充图2C类)其蛋白产物的敲除并没有改变细胞凋亡率(补充图2D类)，确认比姆在脂毒性β细胞死亡中不起主要作用。
棕榈酸酯诱导彪马表达有助于β细胞死亡。A类：时间进程分析彪马油酸和棕榈酸处理的INS-1E细胞中mRNA的表达(n个= 4).B类:彪马转染阴性或阴性的INS-1E细胞的mRNA表达彪马siRNA和棕榈酸处理16小时(n个= 5).C类：细胞质细胞色素c（c）和用阴性（N）或彪马（P） siRNA和棕榈酸酯处理16h后，以凋亡诱导因子（AIF）的表达作为线粒体控制，以β-肌动蛋白作为细胞质控制，以α-微管蛋白作为裂解caspase 3印迹的蛋白载量控制。右侧的单独印迹显示非胞质部分，包括线粒体，用作细胞色素的阳性对照c（c）和AIF印迹。显示了5个独立实验的代表性印迹。D类：转染阴性或阴性的INS-1E细胞的凋亡彪马siRNA，然后用油酸盐或棕榈酸酯处理16小时(n个= 3–4).E类:彪马转染阴性或阴性大鼠β细胞的mRNA表达彪马siRNA并用棕榈酸酯处理24小时，然后评估细胞凋亡(n个= 4).F类：通过击倒分散的人类胰岛细胞中的PUMA，防止棕榈酸诱导的细胞死亡。细胞被转染彪马siRNA和2天后暴露于棕榈酸酯24小时(n个= 4). GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶*P（P）对于未处理的细胞，<0.05#P（P）< 0.05.
JNK介导脂肪毒性诱导DP5（DP5）但不是PUM公司答：。
评估棕榈酸诱导的机制DP5（DP5）表达式，aDP5（DP5）启动子荧光素酶报告子。启动子序列在−125到−85之间对于棕榈酸酯诱导DP5很重要，因为与完整结构相比，其缺失使启动子活性降低了42%(). 该启动子区域有一个保守的ATF位点，其中c-Jun在JNK磷酸化后结合(23). 棕榈酸激活的JNK及其靶点c-Jun从30分钟后开始，在4-8小时达到峰值(补充图5A类和B类). SP600125抑制JNK降低c-Jun磷酸化()并废除棕榈酸诱导DP5（DP5）INS-1E细胞中启动子激活和mRNA表达()和初级β细胞(). 小肽JNK抑制剂L-TAT-JNKi，以前被证明可以抑制JNK并保护β细胞免受棕榈酸处理(9)产生类似的c-Jun磷酸化减少，并减少棕榈酸诱导的DP5（DP5）表达式(补充图5C类和D类). 这个第页-c-Jun绑定到DP5（DP5）如ChIP实验中观察到的那样，促进剂被棕榈酸酯增加()，表明第页-c-Jun转录诱导DP5（DP5）.IRE1α击倒降低（76±3%）XBP1型剪接（46±6%）并降低棕榈酸诱导的JNK磷酸化(). 通过使用新型IRE1抑制剂4μ8C，为IRE1的作用提供了额外支持(25). 这个小分子非常有效地阻断了IRE1，抑制了剪接XBP1型表达96±1%，并显著降低JNK磷酸化和DP5（DP5）表达式()，确认IRE1-JNK介导DP5（DP5）归纳。4μ8C没有通过白细胞介素-1β和干扰素-γ抑制JNK磷酸化，表明它不会直接使JNK失活（数据未显示）。
JNK激活有助于DP5（DP5）棕榈酸酯对β细胞的诱导作用。A类:DP5（DP5）转染INS-1E细胞的启动子研究DP5（DP5）不同长度的启动子片段(左边)和对照质粒CMV-RL，然后用棕榈酸酯处理16h。萤火虫荧光素酶（LUC）活性归一化为肾素荧光素酸酶活性，并表示为对照的折叠诱导(n个= 4).B类：用棕榈酸酯或JNK抑制剂SP600125（10μmol/L）处理16 h的INS-1E细胞中的JNK和c-Jun磷酸化。显示了3个独立实验的代表性印迹。C类:DP5（DP5）全基因转染INS-1E细胞的启动子研究DP5（DP5）启动子并用JNK抑制剂SP600125处理B类(n个= 4).D类:DP5（DP5）INS-1E细胞的mRNA表达(左边)或原代β细胞(正确的)在有无SP600125的情况下，分别暴露于棕榈酸酯16小时或24小时(n个= 4).E类：ChIP显示的绑定第页-c-Jun至DP5（DP5）用棕榈酸（PAL）处理或不处理（CTL）4h的INS-1E细胞中的启动子(n个= 3). 样品与第页-c-Jun抗体（IP）或山羊血清（血清，阴性对照）。输入的是样本中的总DNA。显示了3个独立实验的代表性图像。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）启动子作为阴性对照。F类：用阴性（N）或IRE1α（I）siRNA转染INS-1E细胞，用棕榈酸酯处理3天后达到指定时间。IRE1α蛋白表达和JNK蛋白磷酸化的代表性印迹显示（n=4）。G公司和H（H）：JNK磷酸化(G公司)和DP5（DP5）mRNA表达(H（H）) (n个=3–4）在用棕榈酸和/或IRE1抑制剂4µ8C（25μmol/L）处理16小时的INS-1E细胞中G公司，显示了4个独立实验的代表性图像*P（P）<0.05，针对未处理的细胞#P（P）< 0.05.
彪马表达受不同转录因子控制，包括p53和核因子-κB（NF-κB）(29,30). 时间进程实验表明，INS-1E细胞中的p53不是由棕榈酸酯诱导的，这表明β细胞中的PUMA调节依赖于p53(补充图5E类). 激活彪马棕榈酸酯启动子不受NF-κB结合位点突变的影响(补充图5F类)，先前证明对细胞因子介导的彪马上调(31). 此外，彪马启动子活性和彪马JNK抑制剂未改变mRNA诱导(补充图5G–I型)，表明JNK在调节DP5（DP5）和彪马发起人。
PERK-ATF3信号诱导DP5（DP5）和彪马.
PERK通路及其下游效应物CHOP和TRB3在棕榈酸处理的β细胞中具有促凋亡作用(9,15,32). 小干扰RNA（siRNA）敲除PERK可降低基础和棕榈酸诱导的eIF2α磷酸化(补充图6A类–C类)但没有阻止JNK激活(补充图6D类). PERK击倒降低DP5（DP5）和彪马棕榈酸诱导(). 敲除ATF4或CHOP不会影响棕榈酸酯对BH3-only蛋白的诱导(补充图6E类–H（H）). 然而，ATF3 siRNA模拟了PERK siRNA对DP5（DP5）和彪马表达式()表明棕榈酸激活PERK-ATF3导致DP5（DP5）和彪马表达式。在原代β-细胞中，PERK或ATF3的敲除也降低了棕榈酸诱导的DP5（DP5）和彪马(). 这与推测的ATF3结合位点在DP5（DP5）启动子区−125至−85。INS-1E细胞暴露于棕榈酸酯刺激ATF3与DP5（DP5）启动子，表明该BH3-only蛋白是PERK-ATF3途径的直接靶点(). 这个彪马另一方面，启动子不包含ATF3结合位点，表明ATF3间接调节PUMA。
PERK-ATF3途径调节DP5（DP5）和彪马表达。A类：转染阴性、ATF3或PERK siRNA的INS-1E细胞的PERK和ATF3蛋白表达，并在棕榈酸酯（PAL）或未处理（CTL）处理3天后处理16小时。显示了3个独立实验的代表性印迹。B类：DP5（DP5）和彪马INS-1E细胞的mRNA表达A类(n个= 4).C类:DP5（DP5）和彪马转染阴性、ATF3或PERK siRNA的原代大鼠β细胞的mRNA表达以及棕榈酸处理24小时后3天的表达。D类：ChIP显示ATF3与DP5（DP5）棕榈酸（PAL）处理或不处理（CTL）8小时后INS-1E细胞中的启动子(n个= 3). 样品与ATF3抗体（IP）或山羊血清（血清，阴性对照）孵育。输入的是样本中的总DNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）启动子作为阴性对照。显示了3个独立实验的代表性图像。E类：转染阴性（N）或ATF3（A3）siRNA并用棕榈酸酯处理16h的INS-1E细胞的ATF3和TRB3蛋白表达。显示了3个独立实验的代表性印迹。F类：转染阴性（N）或TRB3（T）siRNA的INS-1E细胞中FoxO3a和AKT蛋白磷酸化和TRB3蛋白表达，并用棕榈酸酯（PAL）处理或不处理（CTL）指定时间。显示了4个独立实验的代表性印迹。G公司:DP5（DP5）和彪马转染阴性或TRB3 siRNA并用棕榈酸酯处理16 h的INS-1E细胞中mRNA的表达(n个= 4).H（H）：转染INS-1E细胞的细胞凋亡G公司(n个= 4). *P（P）对于未处理的细胞，<0.05#P（P）< 0.05.
TRB3-AKT-FoxO3a信号通路有助于诱导彪马通过棕榈酸。
在微阵列分析中，棕榈酸盐显著上调三号机房(补充图3和补充表1)，PERK途径中的ER应激诱导型和促凋亡基因(33). 因为CHOP的敲除并没有改变TRB3的表达(补充图6G公司)，我们检查了ATF3的作用。棕榈酸ATF3敲除减弱TRB3诱导(). TRB3是一种抑制AKT磷酸化的假激酶，可激活包括GSK-3β在内的死亡途径。由于AKT使叉头盒O（FoxO）转录因子家族失活，其中FoxO3a被证明能诱导PUMA依赖性凋亡，因此我们检测了TRB3-AKT-FoxO3通路是否在诱导PUMA凋亡中起作用DP5（DP5）和彪马通过棕榈酸酯。归纳三号机房棕榈酸mRNA在蛋白质水平上得到证实()FFA降低了AKT和FoxO3a磷酸化(和). FoxO3a的去磷酸化()伴随着核移位()，确认转录因子的激活。TRB3的敲除部分阻止了AKT和FoxO3a磷酸化的早期变化(). 同时，TRB3敲除降低了棕榈酸诱导的彪马表达式（但不是DP5（DP5）表达），并减少脂毒性β细胞凋亡(). 额外的TRB3/AKT独立机制可能在以后的时间点调节FoxO3a的激活。在硅片分析中DP5（DP5）和彪马启动子在两个BH3-only基因中确定了推测的FoxO3a结合位点，而ChIP证明棕榈酸诱导FoxO3a与这两个启动子结合(). FoxO3a基因敲除部分阻止了DP5（DP5）和彪马棕榈酸酯()表明内质网应激下游的AKT-FoxO3a通路控制BH3-only基因表达，并导致β细胞死亡。
棕榈酸诱导的FoxO3a活化调节DP5（DP5）和彪马表达。A类：接触棕榈酸酯的INS-1E细胞FoxO3a和AKT磷酸化的时间-过程分析。显示了5个独立实验的代表性印迹。B类和C类：代表性免疫荧光图片(B类，bar表示20μm）和量化(C类)用棕榈酸酯（PAL）处理INS-1E细胞的FoxO3a阳性细胞核达指定时间。在B类，FoxO3a染成红色，DNA染成蓝色(n个= 3).D类：ChIP显示FoxO3a与DP5（DP5）和彪马与未经处理的细胞（CTL）相比，用棕榈酸酯（PAL）处理INS-1E细胞4h的启动子。将样品与FoxO3a抗体（IP）或山羊血清（血清，阴性对照）一起孵育。输入是来自样本的总DNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）启动子作为阴性对照。显示了3个独立实验的代表性图像。E类：用靶向FoxO3a（F1和F2）的阴性或两种不同siRNAs转染INS-1E细胞，然后用棕榈酸处理16小时后，FoxO3a蛋白表达(n个= 3–4).F类:DP5（DP5）和彪马INS-1E细胞中mRNA的表达E类.G公司：主要发现的示意图；有关详细信息，请参阅文本。粗箭头向上表示棕榈酸酯处理诱导，粗箭头向下表示下调*P（P）对于未处理的细胞，<0.05#P（P）< 0.05. （该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
DP5（DP5）−/−小鼠受到HFD诱导的糖耐量下降的保护，并增加了β细胞质量。
因为DP5位于PUMA的上游(17)我们选择DP5而非PUMA敲除在早期点（数据未显示）提供对β细胞的完全保护DP5（DP5）−/−用于体内研究的小鼠。DP5（DP5）−/−给WT小鼠喂食标准食物或HFD（脂肪占热量摄入的60%）。12周后，两种HFD喂养基因型的体重增加和胰岛素敏感性相似(). 与此相一致，在WT或WT中观察到类似的体重增加、肾周脂肪堆积和肝胰岛素诱导的AKT磷酸化DP5（DP5）喂食或HFD 25周后敲除小鼠（数据未显示）。DP5（DP5）喂食HFD的WT小鼠胰岛中mRNA表达增加了三倍(P（P）= 0.17,n个= 5–6).DP5（DP5）−/−小鼠受到HFD诱导的糖尿病的保护()由于胰岛素分泌显著增加(). 与HFD-fed隔离的岛屿DP5（DP5）−/−葡萄糖刺激后，小鼠的胰岛素分泌量增加了两倍()提示在β细胞水平上具有保护作用。缺乏DP5（DP5）该基因还保护小鼠胰岛免受棕榈酸诱导的细胞死亡(). 这种对脂肪毒性的抵抗与HFD喂养的β细胞质量加倍相平行DP5（DP5）−/−小鼠，但不包括WT小鼠()，证实了DP5在体内的生理作用。我们无法在HFD喂养的WT小鼠体内检测到凋亡的β细胞（数据未显示），因此无法评估DP5缺乏的假定保护作用。Ki67染色评估β细胞增殖增加()和β细胞肥大()可能导致β细胞质量增加DP5（DP5）−/−老鼠。因此，DP5不仅可能在β细胞凋亡中起作用，而且可能对β细胞生长和增殖起抑制作用。
DP5（DP5）敲除小鼠部分免受HFD诱导的糖耐量受损的影响。A类：WT或DP5（DP5）−/−接受标准食物（C，虚线)和HFD(全线)都是类似的。B类：腹腔胰岛素耐受性试验期间的血糖水平(n个= 8–15).C类和D类：血糖(C类)和血浆胰岛素(D类)腹腔葡萄糖耐量试验期间的水平(n个= 8–15).E类和F类：葡萄糖刺激胰岛素分泌(E类)和胰岛素含量(F类)在分离的胰岛中，以总蛋白含量标准化。在所有条件下，16.7 mmol/L葡萄糖下的胰岛素分泌均显著高于1.7 mmol/L(P（P）< 0.01;n个= 4).G公司：WT和DP5（DP5）−/−用0.5 mmol/L棕榈酸酯处理小鼠胰岛2天(n个= 3).H（H）：在WT和DP5（DP5）−/−小鼠在食物或HFD上总共停留25周(n个= 5–6).我：在喂食HFD的小鼠中，每个胰岛Ki67阳性（分裂）β细胞的数量增加(n个= 3–4).J型：测量β-细胞核拥挤度以评估β-细胞肥大(n个= 3–4). *P（P）同一饮食中不同基因型之间的比较<0.05#P（P）食物和HFD之间的比较<0.05。§P（P）<0.05，如图所示。
讨论
胰腺β细胞无法补偿高胰岛素需求是T2D发病机制的核心，一些研究报告T2D中β细胞质量显著降低(2,26). 长期接触FFA会导致功能性β细胞质量下降(34,35)并可能导致T2D。饱和脂质对β细胞有害，有人提出了明显的内质网应激信号（尤其是在PERK通路中）来介导脂毒性细胞凋亡(7–10,15). 如细胞色素所示，FFA诱导的凋亡通过线粒体途径进行c（c）棕榈酸酯处理后线粒体的释放(13,36,37)但棕榈酸酯诱导的内质网应激如何与线粒体相互作用，最终导致β细胞死亡尚待阐明。我们现在已经回答了这个问题，表明棕榈酸酯通过PERK依赖性转录诱导BH3-only蛋白DP5和PUMA自动变速箱3表达式().
在Bax/Bak激活的层次模型中，BH3-only“敏化剂”蛋白DP5、Bad、Bik、Bnip3、Bmf和Noxa中和原生物Bcl-2蛋白，允许释放BH3-onlyly“激活剂”PUMA、Bim和tBid来激活Bax/Back(38,39). 促凋亡刺激后不同促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的使用取决于细胞和环境。
棕榈酸酯降低Bcl-2的表达(13); 然而，其对脂毒性β细胞死亡的作用尚未被研究。我们现在发现，在棕榈酸盐暴露的β细胞中，Bcl-2蛋白表达的降低与线粒体断裂和细胞凋亡同时发生。只有在棕榈酸酯暴露24小时后，Bcl-XL蛋白才出现减少，这表明Bcl-XL水平的降低在棕榈酸盐诱导的细胞凋亡中并不起关键作用。在棕榈酸酯和内质网应激诱导的β细胞凋亡中，也报道了Mcl-1蛋白下调的作用(40).
BH3在脂肪毒性中只产生增敏剂和活化剂，目前尚不清楚。棕榈酸酯处理的β细胞的基因表达谱表明，棕榈酸酯在早期时间点诱导了内质网应激的基因表达特征(6小时). 在稍后的时间点(14小时)棕榈酸酯上调凋亡相关基因，从适应性反应转变为细胞死亡反应。作为促凋亡信号网络的一部分DP5（DP5）和彪马，两种BH3-only蛋白的基因在暴露于细胞因子的β细胞凋亡中起作用(31,41). 敲除BH3-only敏化剂DP5和活化剂PUMA可保护β细胞免受棕榈酸酯损伤，从而确定其对饱和FFA诱导的凋亡的作用。由于保护作用在大鼠β细胞中是部分的，其他BH3-only蛋白或其他死亡机制可能发挥额外的作用。值得注意的是，油酸没有增加DP5（DP5）或彪马表达，与FFA毒性小得多的观察结果一致(5,9).
接下来，我们着手确定棕榈酸酯诱导这些生产蛋白的机制。尽管上游UPR已被详细描述，内质网应激与线粒体凋亡相关的下游转导机制仍不清楚。通过启动子分析，我们在DP5（DP5）发起人，并确认第页-c-Jun通过ChIP绑定。抑制IRE1依赖性JNK激活减少DP5（DP5）棕榈酸对启动子的激活和mRNA的诱导。这些结果与我们之前的发现一致，即JNK抑制可防止脂毒性β细胞死亡(9). JNK通过Bcl-2家族成员的转录和转录后修饰调节内在死亡途径(42,43).
仅BH3激活器彪马并不是由JNK、p53或NF-κB诱导的，之前的研究表明它们可以调节彪马表达式(29–31,44). 因此，我们研究了内质网应激在彪马表达式。在UPR的三个分支中，PERK通路的持续激活在β细胞凋亡中起着重要作用(14,15). 在PERK下游，CHOP参与棕榈酸诱导的细胞凋亡(9).CHOP公司在T2D小鼠模型中，缺失还能改善血糖控制并防止β细胞丢失(45). ATF3也由PERK诱导；其在β细胞死亡中的作用更具争议性。ATF3基因敲除对细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡具有轻微保护作用(46)这可能涉及胰岛素受体底物2的调节(47). 另一方面，在HFD喂养的小鼠中，ATF3通过调节胰岛素合成起到保护作用(48). 我们现在已经证明，PERK诱导的ATF3，而不是ATF4-CHOP，诱导两者彪马和DP5（DP5）有趣的是，ATF3调节的机制DP5（DP5）和彪马表达式不相似。ATF3直接调制DP5（DP5）mRNA表达，如其与DP5（DP5）启动子，而彪马调控依赖于涉及TRB3、AKT和FoxO3a的复杂途径().
TRB3被鉴定为CHOP和ATF4的促凋亡效应物(49). 增加三号机房在T2D供体和HFD喂养小鼠的胰岛中观察到表达(50). 在同一研究中，TRB3和ATF4之间的相互作用通过减少胞吐相关基因的表达而降低胰岛素分泌。我们在这里展示三号机房由ATF3而非CHOP诱导，并导致FoxO3a依赖性彪马诱导和细胞死亡。在其他类型的细胞中，FoxO3a被证明可以诱导彪马独立于p53的表达(51). 我们还证明了这一点DP5（DP5）上调部分依赖于FoxO3a，这与其启动子中存在假定的FoxO3结合位点一致。这个DP5（DP5）FoxO3a的诱导作用明显依赖于TRB3，这表明FoxO3a的激活机制是另一种选择。
这些发现的生理相关性在DP5（DP5）−/−接触HFD的小鼠。与WT小鼠相比DP5（DP5）−/−由于葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著增加和β细胞质量的适应性增加，小鼠对糖耐量的脂毒性损失具有抵抗力。有趣的是，喂食HFD的小鼠β细胞增殖和肥大增加DP5（DP5）−/−小鼠，指出了迄今为止未知的DP5（DP5）在细胞生长和细胞周期中。因为这些小鼠是全身敲除的，所以不能排除DP5（DP5）缺乏也对周围组织产生有益影响。
总之，脂毒性内质网应激导致JNK和PERK依赖的ATF3和TRB3-FOXO3a激活，这些转录因子调节Bcl-2家族成员的表达。棕榈酸酯通过诱导BH3-only敏化剂DP5、抗凋亡Bcl-2和Mcl-1的缺失以及上调BH3-only-activator PUMA参与细胞死亡的线粒体途径，最终激活Bax/Bak和线粒体通透性(). 这些结果为深入了解脂毒性β细胞内质网应激的机制提供了线索，并确定了迄今为止未知的内质网胁迫与线粒体凋亡之间的转录调控和信号转导。研究结果还揭示了β细胞治疗在T2D预防和治疗中的潜在新领域。
致谢
这项工作得到了欧盟（框架计划7中的合作项目CEED3和BetaBat）、欧洲糖尿病研究基金会（EFSD）/礼来基金会、国家科学基金会（FNRS）、科学基金会的支持和比利时法兰西公社音乐会行动。D.A.C.由FNRS博士后奖学金资助，E.N.G.由EMBO长期奖学金资助，J.-M.V.是FNRS的研究主管。
未报告与本文相关的潜在利益冲突。
D.A.C.、E.N.G.、D.L.E和M.C.对研究的实验设计做出了贡献。D.A.C.、M.I.-E、E.N.G.、C.M.G.、N.N.、I.M.、M.F.、J.-M.V.、C.G.和D.R.进行了实验，或帮助进行了数据分析，或两者兼而有之。C.M.、L.M.、P.M.、H.P.H.和D.R.提供了材料和数据解释。D.A.C.、M.I.-E.、E.N.G.、D.L.E和M.C.对数据进行了分析和解释。D.A.C.、D.L.E和M.C.撰写了这份手稿。M.C.是这项工作的担保人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。
作者感谢中山大学李明涛提供DP5（DP5）发起人；Lin Zhang，匹兹堡大学彪马发起人；多伦多大学Andrea Jurisicova和密歇根大学Gabriel NuñezDP5（DP5）−/−老鼠；布鲁塞尔自由大学Miriam Hernangomez Herrero为小鼠实验提供帮助；以及吉尔伯特·范登布鲁克、玛丽·安妮·内夫、玛丽斯·乌尔班、安妮莎·穆苏亚、斯蒂芬妮·默滕斯和拉希德·马赫纳斯，他们都来自布鲁塞尔自由大学，寻求专家技术援助。
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