谷氨酰胺缺乏和葡萄糖缺乏通过独特的基因表达重组触发生长抑制

转录调节因子对Gln耗竭的功能反应

众所周知，氨基酸饥饿会触发GCN2-eIF2α轴的激活，这通常会抑制蛋白质的翻译，但特别会刺激IRES启动的ATF4翻译，导致ATF4靶基因的上调。²⁶考虑到改变基因表达的广度，我们想知道是否牵涉到其他转录调节因子。由于大多数转录调节器的功能受多种生理或病理改变的调节，转录调节器mRNA水平不是其功能状态的最可靠指标。我们使用IPA程序分析了我们的基因表达数据集，该程序根据已知下游基因的表达方向（上调或下调）预测转录调节器的功能激活或抑制。IPA程序使用已建立的算法和标准，根据所有已知下游靶基因的响应计算给定转录调节器的调节z评分，并使用z评分作为客观参数来估计置信水平。基于此分析，25个转录调节器的得分小于-2.00，因此，预计受到抑制。HNF1、HNF4、SREBF2和FOXO1是这些可能受到抑制的转录调节剂中的一种，这表明当Gln耗尽时，肝细胞的正常功能通常会受到抑制，以保存Gln及其代谢衍生物。虽然观察到许多转录调节器在Gln耗尽时被抑制并不奇怪，但我们很困惑地发现，8个转录调节器的功能被预测激活（调节z评分>2.00）(表2). 在这些被激活的调节器中，有著名的细胞周期阻遏物RB和MDM2，它们编码一种调节p53稳定性的蛋白质，这表明两个关键的细胞周期调节器pRb和p53参与了Gln耗竭触发的生长停滞。这个观察结果与G的重编程一致₁/S和G₂/M检查点调节器(图2E).

此外，PLAG1、TCF3、TOB1、Cux1、HEY2和MXD1被评为激活的转录调节剂，它们参与营养物质消耗的情况以前没有报道过。尤其是PLAG1（多形性腺瘤基因1）编码锌指蛋白，其表达受发育调控。PLAG1的染色体易位在涎腺多形性腺瘤中经常被观察到。²⁸IPA分析通过Gln缺失预测PLAG1的激活(表3).TCF3，也称为E2A、E47、ITF1、VDIR和bHLHb21，已被鉴定为多种转录复合物的一种成分。²⁹IPA分析表明TCF3在Gln耗尽后激活(表S3). Cux1（CUTL1，CDP，CDP/Cux）是一种Rb相互作用蛋白，已被发现可调节形态发生、分化和细胞周期进展，特别是在S期。它也被认为是子宫肌瘤和乳腺癌的抑癌基因。³⁰TOB1（ERBB2传感器）编码抗增殖蛋白tob/btg1家族的一个成员。据报道，当TOB1在培养细胞中外源性表达时，会抑制细胞生长。³¹HEY2（与YRPW基序蛋白2相关的毛状/增强子裂体）也称为心血管螺旋环螺旋因子1（CHF1）。³²HEY2是基本螺旋-环-螺旋（bHLH）型转录调节剂的分裂相关（HESR）家族中的一员。编码蛋白形成同源或异源二聚体，并与组蛋白脱乙酰化酶复合物（如Sirtuin 1和核受体辅阻遏物1）相互作用，以抑制多种基因的转录。³³MXD1编码MAD蛋白，与Myc竞争Max以形成异二聚体。由于MAD还招募HDAC2和Sin3A，MAD抑制Myc依赖性转录。^34,35与这一发现一致，发现Myc和N-Myc的功能受到抑制(表1). 这些转录调节因子在谷氨酰胺耗竭时激活的确切生物学意义尚待确定。

转录调节剂对Glc耗竭的功能反应

Glc和Gln对大多数细胞来说都是不可或缺的，它们都作为增殖生物合成的碳源，具有共同的代谢作用。然而，Glc缺失引发的基因表达改变与Gln缺失明显不同(图1A和​和2）。2). 此外，Gln也是合成含氮生物分子的重要氮源。¹⁴为了预测转录调节器的功能状态并识别与Glc耗竭反应相关的潜在转录调节器，我们使用IPA分析微阵列数据。如所示表4，16个转录调节器的z评分大于2.0（因此被预测在功能水平上被激活）。活化的CDKN2A、TP73、RB1、YY1和TP63是增殖抑制物，与观察到的与Glc耗竭相关的细胞生长停滞一致。此外，E2F1和E2F2都是被Glc耗竭抑制的调节因子。其他功能受抑制的转录调节因子在肝细胞的正常代谢调节中发挥作用。这些发现表明，Glc耗竭引起的细胞应激与Gln耗竭引发的细胞应激不同。

值得注意的是，ATF4和ATF6这两种已知参与ER应激反应的调节因子在这些激活的调节因子中被发现，这与其他独立研究的报告一致。^36,37虽然XBP1被预测为受到Gln缺失的功能性抑制，但它被Glc缺失显著激活（z评分：4.12）(表S4).

适应长期谷氨酰胺缺乏的细胞中基因表达的改变

通过在补充有氨的无谷氨酰胺培养基中培养Hep3B细胞，我们建立了一个具有缓慢生长表型的细胞系MM01，这是长期适应谷氨酰胺不足的结果。¹⁴通过比较MM01细胞和急性Gln-去细胞Hep3B细胞的基因表达，我们希望能够揭示适应性机制。微阵列分析显示，MM01细胞中只有292个基因上调，而398个基因下调。在上调的基因中，166个也上调，而43个在急性谷氨酰胺缺乏状态下下调(图3A). 为了深入了解急性Gln耗竭后的生长抑制，我们比较了细胞周期调节因子的基因表达。根据IPA分析，急性谷氨酰胺缺乏导致三组细胞周期相关基因的显著重编程：G₁/S检查点，G₂/M检查点、细胞周期蛋白和细胞周期调节因子(图3B). 而在适应性MM01细胞中，这些基因组没有显著改变。上述结果可以解释为什么MM01细胞持续但缓慢地增殖。qRT-PCR进一步证实了所选基因的上调，如图3C。通过IPA进行的数据分析预测了几种转录调节器的反应，总结如下表5除ATF4外，预测上调的其他转录调节因子包括SMAD2、SMAD3、ESR1、PPARA、DDIT3、TP73和HIC1。与急性谷氨酰胺缺乏时不能增殖的细胞相比(表2)在适应性细胞中ATF4、SMAD2、SMAD3、ESR1和PPARα的激活尤其有趣。IPA分析表明MM01细胞中PPARα激活(表S5).

在单独的窗口中打开

图3。MM01细胞的基因表达和细胞周期调控。与急性谷氨酰胺缺乏细胞相比，MM01细胞已适应无谷氨酰胺培养基。（A） MM01中上调的基因及其在急性谷氨酰胺缺乏细胞中的表达状态。在MM01细胞中，292个基因被鉴定为上调（log2比率>1.0）。其中166例在急性谷氨酰胺缺乏细胞中上调，43例下调。（B） 急性Gln-缺失Hep3B和MM01细胞中细胞周期调节因子的功能分析。在急性谷氨酰胺缺乏细胞中，所有四组细胞周期调节基因均被显著重新编程（给出了-log p值）。另一方面，相同的基因组没有受到显著影响。注意G的一些调节因子的表达水平₁/MM01中的S检查点受到影响，但总体而言，这组基因的变化在统计学上仍不显著（p=0.084）。（C） MM01细胞中选定基因上调的验证。通过微阵列分析确定为上调的代表性基因被挑选出来进行进一步验证。通过qRT-PCR测定mRNA水平。从完整培养基中培养的Hep3B细胞分离的RNA样品用作对照，对照样品中的mRNA水平任意定义为1。

RNA分离

MM01和Hep3B细胞按上述方法处理24小时，然后用冰镇PBS洗涤两次。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从细胞中提取总RNA。使用纳米滴分光光度计（纳米滴技术）在260/280 nm处测定RNA浓度。

微阵列分析

通过OneArrays（Phalanx Biotech Group）进行基因表达谱分析。人类OneArrays包含32275个寡核苷酸、29187个人类基因组探针和1088个实验对照探针，这些探针形成了60个单链DNA元素。将Hep3B和MM01细胞的样本与阵列芯片杂交，并使用GenePix Pro 4.0版（Axon）测量和处理信号强度。GenePix数据使用Array Studio（Omicsoft Corp）进行分析。显著表达差异定义为p值<0.05，并显示为log₂比率值>1.00或<-1.00。

选定基因的定量实时PCR（qRT-PCR）确认

总RNA首先使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）逆转录到cDNA。β-肌动蛋白PCR用于确认cDNA质量。然后以1/50的比例稀释cDNA，并使用经验证的基因特异性TaqMan探针（应用生物系统）进行定量分析。β-actin被用作RNA负荷正常化的看家基因。使用StepOne™Software v2.1（Applied Biosystems）从收集的数据（阈值循环数，简称Ct）进行相对定量（RQ）研究。

创意途径分析

使用Ingenuity pathway analysis（IPA，网址：www.intenuity.comIngenuity Systems，Inc.）。IPA可用于根据基因本体论、与经典途径的相关性和基于先前发表的哺乳动物生物学发现的分子网络生成基因功能或代谢网络。以下是基本过程：（1）过滤每组的微阵列数据；将检测到的p值小于0.05的基因包括在内进行进一步的比较分析；对于差异表达基因，log₂将p<0.05的比值作为重要数据。（2） 将每次观察的数据上传至IPA，日志₂如果未另行规定，则比率值>1.00或<-1.00用作上传期间的截止值。（3） 通过（a）计算微阵列数据中的基因占某一特定典型路径中基因总数的百分比，或（b）确定概率（重叠p值），对微阵列数据与已知典型路径之间的关联进行生物统计分析通过Fischer精确检验，我们的数据与标准路径之间的关联；重叠p值测量上传数据集中的基因与转录因子调节的基因之间的显著重叠（它将p值设置为小于0.01作为生物统计意义）。（4） 计算网络分数（Z分数）。这些分数反映了我们的数据与典型路径的偶然关联；得分越高意味着随意联想的可能性越低。我们的数据集已上传至IPA程序（内容版本：11904312，发布日期：2011-12-15）。然后使用核心分析算法（Ingenuity系统中集成的几种算法之一）构建我们实验中的假设网络。然后从IPA生成并导出数据和网络，并重新格式化以进行演示。

蛋白质印迹分析

使用含有6.6M尿素、10mM TRIS-HCl、1%SDS、5mM DTT、1%Triton X-100、10%甘油和1x蛋白抑制剂混合物的尿素裂解缓冲液收集全细胞裂解液。将相同数量的蛋白质装入微型蛋白TGX预制凝胶（Bio-rad）中，并按照制造商的方案运行。将分离的蛋白质转移到免疫印迹PVDF膜（Bio-rad）上，用5%脱脂奶粉在TBST缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，150 mM NaCl，0.2%吐温20）中封闭，并用抗磷蛋白eIF2α（细胞信号）、总eIF2β（细胞信号传递）和α-微管蛋白（Sigma-Aldrich）抗体进行探测，用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体结合化学发光系统（Thermoscific）观察条带。

细胞周期分析

Hep3B和HeLa细胞在完全培养基或不含Gln或Glc的培养基中培养18 h。然后，用胰蛋白酶化细胞并用碘化丙啶染色。每个样本均使用流式细胞仪和FACScan流式细胞计（Becton Dickinson Biosciences）以及488-nm激光进行分析。至少收集了10000个事件，以最大限度地提高分析的统计有效性。

这项工作得到了NCI、国立卫生研究院（NIH）的R01-CA129494（给NS）拨款和德雷克塞尔大学的启动资金的部分支持。