代谢组学。作者手稿;PMC 2013年1月1日提供。
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PMCID公司:项目经理3477816
美国国立卫生研究院:美国国家卫生研究院344539
直接熔融FTICR-MS对核苷酸及其同位素富集同位素的高通量分析
,1 ,1,2,三 ,2,三和1,2,三
帕维尔·洛基维茨
1路易斯维尔大学化学系,2210 S.Brook St,348室John W.Shumaker Research Building,Louisville,KY 40292,美国
理查德·东芝
1路易斯维尔大学化学系,2210 S.Brook St,348室John W.Shumaker Research Building,Louisville,KY 40292,USA
2监管环境分析代谢组学中心,2210 S.Brook St.,Louisville,KY 40292,USA
三JG Brown癌症中心,临床转化研究大楼,505 S.Hancock St.,Louisville,KY 40202,USA
安德鲁·莱恩
2监管环境分析代谢组学中心,2210 S.Brook St.,Louisville,KY 40292,USA
三JG Brown癌症中心,临床转化研究大楼,505 S.Hancock St.,Louisville,KY 40202,USA
特蕾莎·W·M·范
1路易斯维尔大学化学系,2210 S.Brook St,348室John W.Shumaker Research Building,Louisville,KY 40292,美国
2监管环境分析代谢组学中心,2210 S.Brook St.,Louisville,KY 40292,USA
三JG Brown癌症中心,临床转化研究大楼,505 S.Hancock St.,Louisville,KY 40202,USA
1路易斯维尔大学化学系,2210 S.Brook St,348室John W.Shumaker Research Building,Louisville,KY 40292,USA
2监管环境分析代谢组学中心,2210 S.Brook St.,Louisville,KY 40292,USA
三JG Brown癌症中心,临床转化研究大楼,505 S.Hancock St.,Louisville,KY 40202,USA
通信地址:路易斯维尔大学化学系Teresa W-M.Fan,2210 S.Brook St,Rm。348 John W.Shumaker Research,Building,Louisville,KY 40292,美国,moc.liamg@nafmwt,电话:502-852-6448 - 补充材料
1
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摘要
傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)能够获得稳定同位素解析代谢组学(SIRM)所需的无与伦比的同位素数据质量。这种能力促使需要不断引入离子以获得最佳同位素比率。在这里,我们报告了通过采用用于LC-MS分析的离子镀样品制备方法,用FTICR-MS同时分析粗极性提取物中的单核苷酸和二核苷酸。这包括快速清除含有C的移液管尖端上提取的核苷酸18固定相,可以对核苷酸及其13通过直接注入纳米电喷雾FTICR-MS和5分钟的数据采集,获得纳米摩尔浓度的C同位素。分辨率和质量准确度使计算机辅助对大多数核苷酸物种进行了明确分配,包括腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶、胞嘧啶核苷酸、NAD的所有磷酸化形式+、NADH、NADP+、NADPH、环核苷酸、几个UDP-己糖及其所有13C同位素。该方法应用于在[U-13C] 葡萄糖加或不加抗癌剂甲基硒酸。在m/z分辨率为400000时,13核苷酸的C同位素与所有其他元素同位素完全分离,因此允许它们13准确测定C部分富集度。该方法实现了SIRM研究中用于代谢途径重建的核苷酸的高样本和高信息量分析。
关键词:核苷酸,稳定同位素解析代谢组学(SIRM),直接输注,同时检测,FTICR MS,离子对,13C-葡萄糖,A549,甲基硒酸
介绍
核苷酸在细胞中具有多种基本功能(穆雷,2009年;Nelson和Cox,2005年). 例如,三磷酸核苷是核酸的活性构建块,是通过ATP和GTP水解进行合成代谢的能量驱动因素。烟酰胺和黄素核苷酸是氧化还原代谢和能量产生的关键辅因子。核苷酸己糖对复杂碳水化合物和糖蛋白的生物合成至关重要。此外,ATP、NAD+、和核苷酸己糖(例如UDP-N-乙酰氨基葡萄糖)分别是翻译后蛋白质修饰的活化底物,如磷酸化、ADP核糖基化和O-和N-连接的糖基化,这些修饰调控着多种关键生物过程。因此,追踪细胞或组织中核苷酸代谢的能力对于理解细胞功能和调节至关重要。
虽然代谢物的识别和量化是代谢组学分析的重要内容,但测量代谢网络的动态变化,如代谢物合成和利用,对于深入了解生化途径和代谢网络的分子调控是必不可少的。这些信息可以从稳定同位素再溶代谢组学(SIRM)研究中获得(风扇等。, 2009;车道等。, 2011;车道等。, 2009;莫斯利等。, 2011). 在这种方法中,将稳定同位素标记示踪剂的单个原子合并到多个产品中的过程被同时跟踪,从而可以重建参与转换的多个代谢途径。几十年来,示踪剂研究中经常使用两种分析平台,即核磁共振和质谱(MS)。核磁共振通常是确定代谢物结构及其在特定原子位置(位置同位素)的标记模式的首选(风扇等。, 2008;Fan and Lane,2008年;风扇等。,2011年b). 然而,核磁共振有时受到检测标记代谢物的灵敏度和分辨率的限制。质谱,尤其是最新的傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS),由于其更高的灵敏度和卓越的能力,能够解析和量化标记代谢物的质量同位素(不同于标记原子的数量),是对核磁共振的补充(车道等。, 2008).
基于色谱的MS分析核苷酸的方法在一些研究中已有报道。这些方法主要结合离子对反相(例如C-18)色谱法,用于核苷酸分离和MS检测(库利耶等。, 2006;多迪比巴等。, 2010;卢等。, 2010). 常用离子对试剂(IPR),如三丁胺(卢等。, 2010;罗等。, 2007),己胺(HA)(库利耶等。, 2006)或有机阳离子(多迪比巴等。, 2010)预期与核苷酸的磷酸基团相互作用,从而增强其与疏水相的亲和力。与诸如n-烷基全氟羧酸等碱基氨基相互作用的IPR也用于LC-MS分离(冯等。, 2008). 其他替代LC-MS技术基于混合模式反相/弱阴离子交换(Hinterwirth公司等。, 2010),亲水作用色谱(井上等。, 2010)或亲和层析(Kammerer公司等。,2005年a;卡默尔等。2005年b). 除了液相色谱分离外,毛细管电泳与质谱联用也被用于检测核苷酸(苏等。, 2004)
更不常见的描述是粗提取物中核苷酸和核苷酸糖的连续离子导入MS分析方法。为了获得最高质量的同位素数据,同时提供更高的样本吞吐量分析,需要使用这些方法。过去的演示是基于MALDI源与飞行时间(TOF)质量分析仪的结合使用(爱德华兹和肯尼迪,2005年;三浦等。, 2010). MALDI源的离子产额快速变化,这与给定离子源的色谱输入存在相同的缺点。此外,离子源与质谱仪耦合,分辨率不足,无法区分许多标记代谢物的近距离同位素峰,这是SIRM研究通常需要的。
相比之下,FTICR-MS在400000分辨率下运行时,对于标记代谢物的直接全局分析,具有足够的分辨率和准确性。此外,当与纳米电喷雾电离(nanoESI)相结合时,此类系统可以提供足够稳定的离子产率,同时还可以满足小样本需求、提高灵敏度和高样本吞吐量,例如每个样本<5分钟。迄今为止,SIRM检测脂质的连续离子FTICR-MS方法(车道等。, 2009),氨基酸(平吉托雷等。, 2007),糖核苷酸(莫斯利等。, 2011)除其他外,已经开发。然而,在粗生物提取物中进行全局核苷酸分析的类似方法并不成功,至少部分原因是高盐的离子抑制效应(Annesley,2003年)和/或粗提取物中的复合基质(Annesley,2003年;甘格尔等。, 2001;马图塞夫斯基等。, 2003;教育与工业应用数学组织等。, 2003). 此外,很难在未经处理的原油提取物中建立稳定的纳米ESI喷雾(东、罗基维茨未出版)。
为了解决这些问题,我们探索了Coulier等人开发的用于核苷酸和其他磷酸化代谢物的LC-MS分析的离子配对方法(库利耶等。, 2006). 我们的方法包括将粗极性提取物中的核苷酸与己胺进行离子配对,然后再吸附到嵌入的C上18–在10μL移液管尖端中改良硅胶床,然后用甲醇洗脱。这些提示通常用于蛋白质组学分析中的样品清理和脱盐(Desiderio和Beranova-Gorgianni,2000年;普卢斯卡尔,2000;Shukla和Majors,2005年). 这一简单的净化步骤充分消除了盐和基质干扰,以便通过nanoESI FTICR-MS进行后续的连续离子分析。
在这里,我们使用22个核苷酸标准的混合物演示了该方法,并报告了该方法在分析均匀生长的人类腺癌A549细胞的粗极性提取物中的应用13C-标记葡萄糖([U-13C] 葡萄糖)与或不与甲基亚硒酸(MSA,一种抗癌硒化合物)混合。我们不仅显示了完全解析许多核苷酸及其13C同位素差异小于0.02 m/z,但也容易获得分数变化13C在癌细胞中富集后者以应对抗癌治疗。
材料和方法
下列所有核苷酸、核苷酸糖和其他磷酸化标准以及冰醋酸、氨、醋酸铵(NH4Ac)和己胺(HA)购自Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯)。甲醇从Burdick&Jackson(新泽西州莫里斯敦)获得。使用超纯水系统(IA,Dubuque,Barnstead)获得18 MΩ水。C类18tips(“ZipTips”)是从Millipore(马萨诸塞州Billerica)购买的。
表1
用C处理前后2.5μM核苷酸混合物中检测到的代谢物峰的相对强度18提示。将强度归一化为ATP峰的强度。数据从3条记录道中取平均值
| | 未处理 | C类18处理 |
---|
代谢物 | 理论的 米/秒 | 质量 精确 误差(ppm) | 相对强度 (ATP百分比) | 质量 精度误差 (ppm) | 相对强度 (ATP百分比) |
---|
列车自动防护系统 | 505.988478 | 0.5±0.04 | 100±0 | 0.56±0.03 | 100±0 |
ADP公司 | 426.022145 | 0.3±0.06 | 117.23±0.88 | 0.42±0.04 | 100.64±1.38 |
放大器 | 346.055812 | 0.5±0.03 | 35.29±0.44 | 0.73±0.04 | 13.42±0.44 |
cAMP公司 | 328.045247 | 0.55±0.04 | 25.54±0.21 | 0.7±0.04 | 19.17±0.37 |
CTP公司 | 481.977245 | 0.74±0.06 | 67.53±0.11 | 0.85±0.03 | 67.69±0.63 |
CDP公司 | 402.010912 | 0.76±0.05 | 17.8±0.17 | 0.95±0.04 | 10.22±0.2 |
化学机械抛光 | 322.044579 | 0.51±0.05 | 13.19±0.34 | 0.64±0.04 | 2.29±0.1 |
全球技术伙伴 | 521.983393 | 0.61±0.08 | 48.28±0.09 | 0.75±0.05 | 54.32±0.28 |
药品GMP | 362.050727 | 0.66±0.03 | 21.55±0.34 | 0.88±0.03 | 5.16±0.18 |
北美 | 662.101853 | 0.95±0.04 | 50.33±3.09 | 1.51±0.05 | 16.83±0.54 |
NADH公司 | 664.117503 | 1.24±0.1 | 9.78±1.02 | 1.58±0.08 | 10.54±0.68 |
NADP公司+ | 742.068186 | 0.76±0.07 | 74.91±3.74 | 0.76±0.02 | 92.18±2.73 |
NADPH公司 | 744.083836 | 1.37±0.09 | 17.38±0.82 | 1.5±0.05 | 27.41±0.72 |
大学转学分课程 | 482.961261 | 0.72±0.08 | 69.62±0.9 | 0.87±0.04 | 66.3±0.9 |
UDP协议 | 402.994928 | 0.5±0.05 | 58.32±1.34 | 0.76±0.04 | 31.47±0.67 |
UMP公司 | 323.028595 | 0.51±0.03 | 13.49±0.06 | 0.66±0.04 | 3.24±0.1 |
UDP-Glc公司一 | 565.047751 | 0.46±0.05 | 98.54±0.45 | 1.19±0.05 | 27.24±0.23 |
UDP GNAc协议一 | 606.074302 | 0.34±0.05 | 140.07±2.12 | 1.22±0.07 | 40.44±0.39 |
GDP-手动一 | 604.069883 | 0.79±0.08 | 62.28±1.49 | 1.35±0.07 | 23.93±0.21 |
Ac-CoA公司一 | 808.118503 | 1.55±0.1 | 13.41±0.4 | 1.89±0.09 | 5.63±0.12 |
六角螺纹接头一 | 338.988778 | 0.59±0.07 | 7.86±0.22 | 0.75±0.02 | 4.33±0.1 |
洗脱液试剂的制备
根据Coulier等人的程序制备洗脱剂(库利耶等。, 2006). 简言之,A期包括H中5 mM HA2O,用乙酸将pH调节至6.3。B相由90%甲醇和10%10mM NH组成4用氨水将Ac调节至pH 8.5。
标准混合物的制备
2.5μM的核苷酸标准品由1mM的H储备溶液制备2O,用甲醇稀释。10μL混合物用于C18根据下面描述的程序进行尖端处理。
A549提取物的制备
人肺腺癌A549细胞在含有10%胎牛血清、100 U青霉素、100μg/ml链霉素、0.2%未标记或[U-13C] 标记葡萄糖,不含或含有5μM MSA。培养物在5%CO中培养2如前所述,在37°C下24小时(风扇等。, 2005). 接下来的细胞在冷PBS中清洗三次,然后用1ml冰镇乙腈(ACN)(改编自(风扇等。,2011年a). 将18 MΩ水(0.75 ml)添加到裂解的细胞中,用细胞刮刀收集细胞,然后转移到15 ml聚丙烯锥形离心管(Sarstedt)中。这个过程重复了一次。将氯仿(1 ml,HPLC级,Fisher Scientific)和直径3 mm的玻璃珠添加到细胞裂解液中,将其剧烈摇晃,以在沉淀蛋白质的同时将脂质提取到氯仿层中。最终ACN:H2O: 氯仿比例为2:1.5:1。将提取物混合物在3500×g下在4°C下离心20 min,以分别在顶层和底层产生极性和非极性提取物,蛋白质沉淀在界面中。然后将极性提取物冻干(Fan,2010年)并溶解在100%的A相中。10μL(约占总提取物的5%,对应于<3×105细胞)然后用于C18尖端处理。
通过C进行样品处理18提示
C类18首先通过在甲醇中洗涤五次,然后在100%A相中洗涤5次对针头进行调节。然后通过一系列八次抽吸将10μL等分试样加载到针头上,然后在10μL 100%A相(4次抽吸)中洗涤。在洗脱步骤中,将尖端吸至10μL 70%的A相和30%的B相中8至12次。用另一个10μL相同洗脱液重复该过程,以确保核苷酸完全洗脱。70%的A相和30%的B相组合可以提供最佳的洗脱条件和纳米ESI喷雾稳定性。相B的较高分数允许在不使用洗脱液进行额外冲洗的情况下进行完全洗脱,但较高的溶液pH值导致形成若干钠加合物,导致光谱复杂性增加。此外,洗脱液缓冲液中较高的B相导致FTICR-MS光谱中出现峰值,其准确质量与NAD相对应+负烟酰胺(假定指定为cyclic-ADPribose–[C15H(H)21N个5O(运行)13P(P)2]-H) 这表明烟酰胺环的丢失和环化,可能是通过pH诱导的分解。最后用100%甲醇清洗尖端,洗脱任何剩余代谢物。这一步并不重要,因为在该部分中常规检测不到核苷酸峰(未显示光谱)。然后用100%甲醇将核苷酸部分稀释三倍,以确保稳定的喷雾条件用于分析。有趣的是,如果使用100%MeOH(通常是一种优秀的纳米ESI喷雾溶剂)而不是70%的A相进行洗脱,喷雾电流会大幅波动,最终失败,这使得很难获得超过2分钟的光谱。使用所述的优化方法,喷雾稳定时间可达到15分钟以上,并且易于使用96 well PCR板和多通道或机器人移液器进行多样品处理。使用微量滴定板的另一个优点是样品处理/储存的双重目的以及与自动样品交付分析的兼容性。
FTICR-MS分析
所有样本均通过连续注入7特斯拉混合动力LTQ进行分析®离子阱–FTICR质谱仪(LTQ–FT,Thermo Finnigan,Bremen,Germany),配备Triversa Nanomate纳米ESI离子源(Advion Biosciences,Ithaca,NY)。数据是在负离子模式下获得的。根据制造商协议校准仪器,并使用[ATP–H]进行调整−峰值(理论m/z=505.988478 Da)。使用“A”芯片(5.5μm喷嘴)在1.5 kV和0.5 psi的压头压力下操作Trirevoke Nanomate,这产生了最稳定的喷雾条件。为了监测喷雾和离子输送的稳定性,在FTICR-MS扫描之前先进行30秒的低分辨率离子阱(LTQ)扫描。FTICR-MS记录道的质量范围为250 Da至800 Da,目标质量分辨率设置为400 m/z时的400000,有效地实现了目标分辨率。使用默认AGC目标,将自动增益控制(AGC)的最大离子时间设置为1000ms(通常使用<10ms)。将五个瞬态相加,以产生每个转换质谱,从而使每个存储光谱的循环时间约为10 s(每个瞬态2 s)。标准混合物在5分钟内完成样品运行,A549细胞提取物在15分钟内完成,以获得低丰度同位素峰的足够离子计数。这相当于总共保存了30或90个光谱,然后共同添加以生成最终光谱。光谱峰半高处的有效宽度约为1.5 10−3Da(mDa),表示质量差异大于此限值的峰值(例如。13C、,15N、 以及2H) 可以在这些条件下解决(参见。).
13A549细胞极性提取物中ATP、UTP和CTP的C-等极性分布
A549细胞在[U-13C] -如方法所述,在FTICR-MS分析之前,提取葡萄糖和代谢物并用C18尖端进行预处理。显示了UTP、CTP和ATP的FTICR-MS光谱区域。
A.UTP和CTP(未标记),插入显示分辨率15N、,13C、 和2天然丰度下UTP的H同位素。B类;UTP和CTP(13C标记);C.嘧啶生物合成途径。核糖部分来自戊糖磷酸途径(PPP),嘧啶碱是在天冬氨酸和一氧化碳的不同途径中合成的2图中C为尿嘧啶环13C标记在C4和C5位置,其来源于13C类2-3,4-天冬氨酸产生于13C类6-柠檬酸循环(CAC)第一圈后的葡萄糖。由于通过CAC进行代谢紊乱13还产生了C-6-尿嘧啶同位素,其来源于13C类2-1,2-Asp(未显示)(风扇等。2010年a). D.ATP(未标记),插入显示分辨率15N、,13C、 和2天然丰度下ATP的H同位素;E.三磷酸腺苷(13C标记);F.嘌呤生物合成途径。嘌呤碱通过一氧化碳直接建立在核糖部分上2、甘氨酸、谷氨酰胺和N10-四氢叶酸甲酰酯(THF)。嘌呤和嘧啶碱中的原子与其合成前体进行了彩色编码,例如尿嘧啶环中的C来自天冬氨酸。CPS II:氨甲酰磷酸合成酶II;AST:天冬氨酸转氨酶;PDH:丙酮酸脱氢酶;HK:己糖激酶;AIRC:磷酸核糖基氨基咪唑羧化酶;SHMT:丝氨酸羟甲基转移酶;实心箭头:单步反应;虚线箭头:多步骤反应。
使用Xcalibur软件(Thermo Electron,版本2 SP2 FT)可视化高分辨率光谱剖面数据,并将在质心模式下获得的精确m/z值和峰值强度导出为电子表格文件。使用内部软件PREMISE(PRecaculated Exact Mass Isopologue Search Engine)指定代谢物种类(车道等。, 2009)通过将实验m/z值与理论m/z值列表进行匹配。m/z窗为0.0022 m/z或更小的匹配标准足以确定核苷酸的大多数单同位素峰。使用Moseley制定的方案进行自然丰度剥离(莫斯利,2010年)使用方程式:
其中NA是自然丰度(1.07%13C) ,k是碳的总数,n是13C原子。
该迭代程序对包括脂类和糖核苷酸在内的多种物种都能提供良好的结果(车道等。, 2009;莫斯利等。, 2011). 与剥离相关的剩余误差取决于信噪比,但通常会将NA贡献降低一个数量级或更高,如未标记核苷酸的测试所示,其中m0+1个峰值从10%降至0.00%。
结果和讨论
标准分析
样品处理方法首先使用22种标准的混合物进行评估,其中包括普通核糖核苷酸、核苷酸糖、糖磷酸盐和乙酰辅酶a。这些代谢物在许多细胞功能中都很重要,如果不事先分离,很难通过电喷雾质谱在粗提取物中检测到。标准混合物用C处理18用FTICR-MS分析tip和洗脱液及未处理标准品。将处理前后在2.5μM标准混合物上采集的FTICR-MS痕量与C进行比较18提示。峰值分配总结如下,其中峰值强度归一化为[ATP-H]−(m/z=505.988478)。很明显,所有标准都是从C18尖端处理,但原始峰值比率没有完全保留(图S1). 例如,C之后UDP-GlcNAc峰的强度18尖端处理大约是未处理的三分之一。
核苷酸标准物的FTICR-MS光谱
在由21种标准组成的2.5μM混合物上采集痕量,这些标准包括:ATP、ADP、AMP、cAMP、CTP、CDP、CMP、GTP、GDP、GMP、NAD+、NADP+方法中描述的NADH、NADPH、UTP、UDP、UMP、UDPG、UDPGNAc、GDP-甘露糖、Ac-CoA(乙酰辅酶A)、1,6-二磷酸果糖(Hex-PP)。面板A和B分别表示使用C进行处理之前和之后18提示。
尽管并非所有标准都在C中完全恢复18尖端洗脱液,如图S1这表明,通过添加内部标准可以实现单个核苷酸的绝对定量。然而,同位素分布的定量分析与样本矩阵的恢复不足或干扰无关,因为每个同位素强度都是根据所有同位素的强度总和进行归一化的,以获得分数分布。因此,不需要内部标准来获得核苷酸同位素的分数分布,这可能是SIRM研究中最重要的数据参数(风扇等。, 2009;车道等。, 2008;车道等。, 2011;莫斯利等。, 2011). 由于无法获得每种可能的代谢物同位素的真实标准,这一优势非常方便。
A549细胞无标记极性提取物中核苷酸的分析
我们最初尝试使用纳米ESI FTICR-MS分析未标记A549细胞的极性提取物,而不通过C18提示。注入后,纳米ESI电流立即衰减,未获得可用的采集。当使用C处理相同的粗提取物时18提示,纳米ESI电流在>5分钟内保持稳定,这使核苷酸和许多其他代谢物(例如谷胱甘肽、乙酰辅酶A、糖磷酸盐,参见。)易于观察的峰值。显示了A549提取物在C18尖端处理。提取物中清楚地检测到主要核苷酸和核苷酸糖,以及低丰度核苷酸,如NADH、NADP+、UMP和GMP。
A549极性提取物经C处理后的典型负离子模式光谱18提示。
使用“PREMISE”进行峰值分配(车道等。, 2009)并进行手动审查。显示的所有常见核苷酸、核苷酸糖和其他磷酸化代谢产物代表去质子化物种。
核苷酸和13标记A549提取物中的C同位素分布
如上所述,SIRM实验对于准确跟踪代谢网络和通量的变化是必要的。我们用生长在[U-13C] -葡萄糖24小时,与在未标记葡萄糖中生长的细胞进行比较。显示了从标记与未标记A549细胞的极性提取物中获得的光谱痕迹的CTP/UTP(面板A、B)和ATP(面板D、E)区域。同样显示为扩展区域的是15N个1,13C类1、和2H(H)1天然丰度下UTP(图A)和ATP(图D)的等位异构体,分别相差6和3.1mDa。这些峰半高处的宽度约为1.5 mDa,足以解析两个核苷酸的三个同位素峰。
嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的标记光谱痕迹(B,E)与未标记痕迹(a,D)具有显著不同的外观。全部13根据精确的质量值,使用PREMISE对C同位素峰进行了赋值,该质量值与各单同位素物种的增量中子(而非质子)质量值不同。因此,广泛13所有可观察到的核苷酸都有明显的C标记(和未显示的数据),最多8个13UTP和ATP中存在C原子。它还值得注意大多数单同位素峰被耗尽,而所有情况下最强烈的同位素峰是13C类5物种(m0+5). 预期的来源13嘌呤和嘧啶同位素中的C原子在其各自的生物合成途径中进行了描述.
分数13根据各自的峰值强度计算了四种选定嘌呤和嘧啶核苷酸在各种同位素中的C富集,并总结为这些富集值是通过剥离天然丰度获得的13使用Moseley开发的方案,单个同位素对多标记物种的碳贡献(莫斯利,2010年). 我们之前已经证明,在高信噪比条件下,脂质的同位素比率精确度为1%或更高(车道等。, 2009). 测定天然丰度下核苷酸同位素相对分布的准确性和精确度如所示表S1(补充材料). m的同位素比率精度0+1同位素含量为0.2%至2.4%,与之前的研究结果相当。
分数的13[U中ATP、CTP、GTP和UTP的C同位素富集-13C] -葡萄糖标记A549极性提取物
A549细胞在[U-13C] -葡萄糖,提取、加工和分析,如质量同位素如方法中所述进行分配,并使用Moseley所述的程序剥离自然丰度贡献(莫斯利,2010年). 通过将单个同位素强度除以所有同位素强度之和,计算出分数富集条形图和下表中列出的值。误差条表示标准误差(n=4)。
标记24小时后,仅≤m的12%0峰值(全部-12尽管总核苷酸浓度在这段时间内没有显著变化(从1H NMR数据,未显示)。因此,现有的核苷酸库被新合成的核苷酸所取代,使用外部供应的核苷酸13C类6-葡萄糖。主要部分是m0+5或13C类5同位素(>69%),在所选的四种核苷酸中具有可比性。这种同位素可归因于13C类5每个核苷酸的核糖亚结构(),碱基中没有标签。这与核磁共振、FTICR-MS和计算模型的广泛交叉验证一致(Fan and Lane,2011年;莫斯利等。, 2011).
成立13C类5-核糖从[U转化为核苷酸-13C] -葡萄糖与己糖激酶和磷酸戊糖途径(PPP)的活性有关。其他重要同位素,m0+6米0+7和m0+8代表葡萄糖碳同时并入核糖和核糖亚基。这里嘌呤和嘧啶的行为不同,反映了它们不同的代谢途径(风扇等。, 2008;默里等。, 2009). 嘧啶碱由天冬氨酸和一氧化碳合成2(未标记的源)(). 天冬氨酸可以从13C-葡萄糖通过糖酵解序列和克雷布斯循环,从而形成单到三倍的混合物13C-标记的天冬氨酸(风扇等。,2011年a; 风扇等。2010年b)。标记的天冬氨酸又可并入嘧啶碱中,从而产生m0+6 (13C类6)至m0+8 (13C类8)碱基连接到a的嘧啶核苷酸的同位素13C类5标记的核糖亚基。相反,嘌呤的合成利用甘氨酸、一氧化碳中的碳2和N个10-甲酰四氢叶酸盐(N个10-甲酰-THF)。甘氨酸可以通过3-磷酸甘油酸/丝氨酸途径由葡萄糖合成,这也会导致N个10-甲酰四氢呋喃(). 因此,[U-13C] -葡萄糖转化为核糖、甘氨酸和N个10-甲酰四氢呋喃有望生产13C类6到13C类8嘌呤核苷酸的同位素。较高的分数13与嘧啶核苷酸相比,嘌呤核苷酸同位素中的C富集表明从头开始A549细胞中嘌呤环比嘧啶环的合成。据我们所知,这种行为之前是未知的。这可能反映出嘌呤的周转需求(例如ADP核糖基化)高于嘧啶核苷酸。我们之前也表明,在其他体系中,嘧啶和嘌呤核苷酸核糖部分的合成速度不同(风扇等。, 2008). 这些例子说明了如何通过核苷酸的SIRM分析重建交叉代谢途径(莫斯利等。, 2011)使用本文描述的方法。
MSA改变A549细胞核苷酸合成
然后,我们应用该方法分析了5μM MSA(一种细胞毒性硒化合物)诱导A549癌细胞核苷酸生物合成的变化。A549细胞在[U-13C] -葡萄糖24小时,含或不含MSA。在C18如上所述进行叶尖清理。中并排显示的光谱轨迹图S2揭示了对照组和MSA组之间ATP(A-B组)、UTP和CTP(C-D组)标记模式的明显差异。这个13根据天然丰度剥离后的峰值强度计算了ATP和UTP各种同位素的C分数分布,并与对于ATP,相对于主要的m+5同位素(13C类5-核糖),全部12C或m0经MSA处理的细胞(约23%)的比例约为未处理细胞(约7%)的三倍(). 相反,m的分数0+6米0+7和m0+8个同位素(13C类1-3-碱基+13C类5-与未经处理的样品相比,经MSA处理的细胞的核糖含量显著降低。此外,总数13MSA处理显著降低了腺嘌呤核苷酸核糖基单元(AXP)的C丰度,1-D证明了这一点13C过滤1H HSQC核磁共振分析(图S2E). 总之,这些数据表明MSA显著抑制嘌呤核苷酸的生物合成。MSA对嘧啶标记模式的影响更为显著,如和S2C-E公司在未经处理的细胞中12UTP的C或m+0峰值占总强度的1%以下,而在MSA存在的情况下,这一比例为17%(). 此外,m的损失0+6至m0+8 (13C类6到13C类8)UTP同位素组分表明,5μM MSA几乎完全被抑制从头开始A549细胞中嘧啶环的生物合成,以及核糖合成的抑制(参见尿嘧啶核苷酸(UXP)及其糖衍生物图S2E) (风扇等。,2011年b). 这些对核苷酸生物合成的影响可能是MSA抑制癌细胞生长(Fan等。,出版中,2011).
MSA对13A549细胞极性提取物中核苷酸的C同位素
细胞生长在[U-13C] -葡萄糖(含或不含MSA),按照下面的条形图和表格描述了分数13ATP同位素(A组)和UTP同位素(B组)中的C富集。通过将单个同位素强度除以所有同位素强度之和来计算分数富集度。误差条表示标准误差(n=2)。
结论
我们通过连续输注FTICR-MS对核苷酸和其他极性磷酸化代谢物进行了快速、全面的高信息吞吐量分析18基于tip的净化,实现5-15分钟的FTICR-MS分析,将粗细胞提取物中的磷酸化代谢物降至纳米摩尔水平。由于清除过程中不同核苷酸的回收率不同,因此绝对定量可能需要使用内部标准。最重要的是,该方法非常适合于SIRM的关键参数,即13合成核苷酸的C同位素分布13C标记示踪剂。这在生长于13C类6-葡萄糖示踪剂。核苷酸的标记模式能够重建所涉及的交叉代谢途径。使用最近开发的GAIMS算法,可以进一步挖掘这些数据,用于多路流量建模(莫斯利等。, 2011). 我们还说明了检测抗癌硒剂诱导的核苷酸生物合成扰动的方法的实用性。该方法通常适用于其他细胞和组织提取物。
鸣谢
我们感谢R.Burra和T.Xu的技术援助,感谢H.Moselly的宝贵讨论,感谢J.Winnike对手稿的批判性评论。
财务支持
这项工作得到了NIH赠款编号1R01CA118434-01A2、3R01CA18434-02S1、肯塔基州肺癌研究计划(LCRP)OGMB101380(向TWMF)、1R21CA133668-01A2(向ANL)、路易斯维尔大学CTSPGP赠款编号20044(向TMF)和20061(向ANI)以及肯塔基省肺癌研究项目(向PL提供博士后奖学金)的部分支持。FTICR-MS仪器得到了NSF/EPSCoR拨款编号EPS-0447479(TWMF)的支持。
使用的缩写
AXP公司 | 腺嘌呤核苷酸类 |
FTICR-MS公司 | 傅里叶变换离子回旋加速器光谱法 |
HSQC公司 | 异核单量子相干 |
海事局 | 甲基硒酸 |
购买力平价 | 戊糖磷酸途径 |
经营场所 | 预计算精确质量同位素搜索引擎 |
SIRM公司 | 稳定同位素分解代谢组学 |
四氢呋喃 | 四氢叶酸 |
糖胺 | 糖胺 |
UXP公司 | 尿嘧啶核苷酸类 |
工具书类
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