ACS化学生物。作者手稿；PMC 2013年10月19日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院394756
Tau相关蛋白质组分析表明Hsp70与Hsp90的交换参与了Tau降解
,1中，4 ,2 ,1 ,1,4 ,1 ,2 ,5,* ,6,*和1,三，4,*
安德里亚·D·汤普森
1密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48103
4密歇根大学生命科学研究所，密歇根州安阿伯48103
K.马修·斯卡利翁
2密歇根大学神经病学系，密歇根州安阿伯48103
约翰·普伦斯纳
1密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48103
安妮·吉利斯
1密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48103
4密歇根大学生命科学研究所，密歇根州安阿伯48103
阿鲁尔·钦奈扬
1密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48103
亨利·保尔森
2密歇根大学神经病学系，密歇根州安阿伯48103
乌梅什·K·金瓦尔
5佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学药学系，邮编：33613
查德·迪基
6佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学分子医学系，邮编：33613
杰森·盖斯特威基（Jason E.Gestwicki）
1密歇根大学病理学系，密歇根州安娜堡48103
三密歇根大学生物化学系，密歇根州安阿伯48103
4密歇根大学生命科学研究所，密歇根州安阿伯48103
1密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48103
2密歇根大学神经病学系，密歇根州安阿伯48103
三密歇根大学生物化学系，密歇根州安阿伯48103
4密歇根大学生命科学研究所，密歇根州安阿伯48103
5佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学药学系，邮编：33613
6佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学分子医学系，邮编：33613
*通信地址：Jason E.Gestwicki，密歇根大学生命科学研究所，地址：210 Washtenaw Ave，Ann Arbor，MI 48109-2216，在kciwtseg的高度Umesh Jinwal，南佛罗里达大学药物科学系，4001 E.Fletcher Ave，Byrd Alzheimer's Institute，Tampa FL 33613，ude.fsu.htlaeh@lawnijuChad A.Dickey，南佛罗里达大学分子医学系，4001 E.Fletcher Ave，Byrd Alzheimer's Institute，Tampa，FL 33613，ude.fsu.htlaeh@yekcidc - 补充资料
1_si_001。
GUID:3B3A1E58-597D-46C6-A734-564E9E143C99
摘要
微管相关蛋白tau（MAPT/tau）在15种神经退行性疾病中异常积聚，称为tau病。治疗τ蛋白病的一种方法可能是加速τ蛋白的清除，但调节τ蛋白稳定性的分子机制尚不清楚。我们最近发现，化学探针可以显著加速细胞和动物模型中τ的清除。在目前的研究中，我们使用其中一种探针结合免疫沉淀和质谱法来鉴定48种与tau相关的蛋白，这些蛋白在治疗后的前10分钟内发生了变化。这些蛋白质包括已知的τ蛋白毒性修饰物，如ILF-2（NFAT）、ILF-3和ataxin-2。数据集的一个引人注目的观察结果是，tau与热休克蛋白70（Hsp70）的结合减少，而与Hsp90的结合显著增加。这两种伴侣都与τ内稳态有关，但其机制尚未建立。使用肽阵列和结合分析，我们发现Hsp70和Hsp90似乎在竞争与tau上的共享位点的结合。此外，Hsp90结合复合物被证明在启动细胞内tau清除中起重要作用。这些结果表明，Hsp70和Hsp90的相对水平可能有助于确定tau是否被保留或降解。与此模型一致，对阿尔茨海默病患者和年龄匹配的对照组的微阵列表达数据的分析表明，患病海马中Hsp90的水平降低。这些研究表明，Hsp70和Hsp90共同协调τ体内平衡。
简介
Tau主要在神经元中表达，在稳定轴突内的微管中起核心作用(1–三). Tau体内平衡受其表达、磷酸化和周转调节(4). 在一系列tau病中，包括阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTLD）、进行性核上性麻痹（PSP）和皮质基底变性（CBD），tau稳态被破坏，导致过度磷酸化和细胞内聚集物积聚(5–7). tau基因缺失可恢复几种小鼠模型的认知缺陷(8–12)这表明降低tau水平可能是重新平衡体内平衡的有效方法。事实上，最近的研究使用通过增加蛋白质体和/或自噬清除来降低τ水平的化合物(13)已经表明，这种策略能够部分恢复细胞和小鼠模型中的认知缺陷(14,15). 总之，这些发现将注意力集中在了解哪些细胞途径保护tau以及哪些蛋白质对其降解很重要。
τ稳态的重要调节因子包括分子伴侣、热休克蛋白70（Hsp70）和Hsp90。Hsp70及其组成表达亚型Hsc70从微管释放后直接与微管结合域附近区域的tau结合(16). 通过这些相互作用，Hsp70促进了tau与微管的重新结合，并且它们还参与阻止tau聚集并促进其降解(17–19). 类似地，Hsp90和许多其他协同伴侣也参与调节tau磷酸化、聚集和降解(16,17,20–22). 因此，Hsp70和Hsp90似乎在建立τ内稳态的多个过程中发挥作用。然而，这些研究尚未揭示相关的分子机制，也不清楚这些伴侣如何最终控制τ的稳定性。
在这里，我们使用了一个小分子来剧烈破坏τ平衡，从而促进降解。这种方法的一个关键特征是，这种小分子迅速降低了tau水平（在HeLa细胞中约15分钟内），从而可以识别在最初几分钟内与tau结合发生变化的蛋白质。利用质谱和定量光谱分析，我们发现在转化为降解过程中，只有48个τ相关蛋白被释放或富集在τ上。有趣的是，Hsp70在tau降解的早期阶段被释放，并被Hsp90取代。敲除分析表明，Hsp90是降解所必需的，这表明转换到Hsp90在降解过程中是重要的一步。此外，我们发现Hsp70与Hsp90竞争与tau的结合，这表明在某些情况下，Hsp70和Hsp90的水平可能决定tau的稳定性，这一结果得到了AD患者和年龄匹配的对照组的表达数据分析的支持。这些研究为针对τ的清除治疗药物的开发提供了可能的新策略。
结果和讨论
τ稳态相关蛋白质的鉴定
Tau是一种内在紊乱的蛋白质(23)这被认为参与了控制其定位、活性和稳定性的蛋白质-蛋白质相互作用。因此，我们推断，细胞内可能存在稳定tau的tau相关蛋白，而其他复合物可能对其清除至关重要。我们还推断，更好地了解这些τ结合因子可能会揭示潜在的新药靶点，并提供对伴侣介导τ分型机制的见解。为了实现这些目标，一个重要的进展是最近发现了严重破坏τ平衡并有利于快速改变τ稳定性的分子。其中一种分子亚甲基蓝（MB）已被证明可降低多种τ蛋白病细胞和动物模型中的τ蛋白水平(13–15)降低聚谷氨酰胺扩张障碍患者的polyQ水平(24). 为了测试该化合物是否可用于探索tau相关蛋白质组的变化，我们首先证实MB可将稳定表达V5-4RON tau的HeLa（C3）细胞中总tau水平降低约80%(补充图1A). 该模型中τ的损失很快，在约10至20分钟内达到新的平衡(补充图1B). 这种转换的速度很重要，因为它可以洞察τ相关蛋白复合物中发生的急性变化，同时避免因全球细胞对MB的反应而引起的并发症。
为了确定在复合物激活转变为降解过程中与τ结合发生变化的蛋白质，我们用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理4小时，然后应用MB（50μM）或载体对照。硼替佐米用于捕获蛋白酶体的复合物，便于随后通过质谱鉴定(补充图1C). 在MB或载体治疗10分钟后，用V5抗体进行免疫沉淀，并用LC-MS/MS分析沉淀物质，以鉴定tau相关蛋白质组(). 这些实验在两个独立的生物复制品中进行，每个复制品用质谱分析三份。在每个样本中免疫沉淀出类似水平的tau（MAPT）(补充图2)共鉴定出504个共免疫沉淀蛋白，包括微管蛋白、TDP-43、Hsp70和Hsp90(补充表1).
亚甲基蓝（MB）处理引起的急性降解过程中与tau相关的蛋白质组学分析（A） 识别改变τ稳定性的τ相关蛋白的实验策略示意图。（B） 使用光谱计数，456种共免疫沉淀蛋白在对MB处理的反应中与tau的结合没有改变。然而，20个蛋白质减少了它们与tau的结合，28个优先结合。（C） 新免疫沉淀样品上的蛋白质印迹证实，MB导致Hsp70从tau中释放，而Hsp90结合增加。
接下来，利用定量光谱计数检测与τ结合在MB反应中发生变化的蛋白质。为了被认为与tau存在差异，我们鉴定了丰度变化大于两倍的蛋白质和大于10的Bayes因子。尽管包括微管蛋白在内的绝大多数相互作用蛋白在MB处理后并没有改变它们与tau的结合，但该标准确定了48个差异相关蛋白，其中20个减少了它们与tau2的结合，28个增加了它们的结合(,补充表1). 有趣的是，该列表包括一些先前被确定为τ毒性修饰物的因子，如ataxin-2、IL-2和IL-3(25,26)这表明，其中一些因素可能通过影响τ蛋白的周转来部分改变τ蛋白毒性。该列表还包括一些参与基因调控的蛋白质，如SWI-SNF成分SMARCE1（BAF57）和SMARCA4（BRG1），以及核糖体相关蛋白质，如RPS4X。
Hsp90是τ降解的重要因素
tau相互作用组分析中最引人注目的观察结果之一是，与应激诱导的热休克蛋白70（HSPA1B）的相关性显著降低，而与热休克蛋白90（HSP90AB1）的结合增加(). 为了证实这一发现，在新处理的HeLa（C3）细胞上重复V5免疫沉淀，并进行Hsp70和Hsp90的蛋白质印迹。与质谱结果一致，MB治疗后，Hsp70下降，而Hsp90增加其与tau的相关性(). 在没有蛋白酶体抑制剂的情况下也会发生这种转换(). 这些结果表明，Hsp70和Hsp90之间的相互作用可能与靶向tau清除有关。与这一观点一致，此前已有研究表明，Hsp70的过度表达增强了MB-介导的tau清除(13).
为了更好地了解Hsp90在该系统中的具体作用，我们研究了Hsp90水平的变化如何影响MB-引发的tau降解。Hsp90最为人所知的是它能够稳定许多底物，例如核激素受体和激酶，保护它们不被降解(27,28). 然而，Hsp90也促进其他底物的降解，如von Hippal-Lindau因子和高密度脂蛋白(29,30). 为了探讨Hsp90在tau系统中的作用，我们对Hsp90进行了siRNA敲除。与以前的报告一致(17,20,31,32)Hsp90的部分敲除（约80%）并没有显著改变总tau的水平。然而，它确实抑制了MB清除tau的能力(). 该结果支持一个模型，其中Hsp90参与靶向tau进行降解，至少是对MB的响应。这一结果与之前使用Hsp90抑制剂的研究一致，该研究表明Hsp90在靶向tau降解中发挥了积极作用(20).
亚甲基蓝（MB）引发的τ降解依赖于Hsp90Hsp90 siRNA在未经处理的细胞中不会引起总τ水平的显著变化，但它会减弱τ清除率以应对MB。使用图像J对两个独立实验的带强度进行量化（*学生的双尾非配对t检验，p值<0.05）。
Hsp90与Hsp70竞争结合tau
基于这些结果，我们假设Hsp70与τ上的Hsp90的交换可能通过共享结合位点的竞争发生。在tau上至少发现了两个Hsp70结合位点(33)，但尚未描述Hsp90的结合位点。为了研究这个问题，我们开发了由15个肽组成的肽微阵列，这些肽覆盖tau的最长亚型，tau在外周神经系统中表达（4R2N）。这些τ肽由4个氨基酸重叠组成，共有194个点，每个点在玻片上一式三份。使用荧光抗-His抗体测量Hsp70-His和Hsp90-His与这些肽阵列的结合，阴性对照为单独抗体和不结合底物的Hsp70的核苷酸结合域（NBD）。正如预期的那样，阴性对照仅与少数肽非特异性结合，这些肽被排除在后续分析之外(,补充表2). 相反，Hsp70和Hsp90与许多τ衍生肽结合(). 将我们对潜在结合位点的分析局限于中枢神经系统最长tau亚型（4R0N）中的结合位点，我们确定了四个Hsp70结合位点和两个Hsp90结合位点(). 引人注目的是，这两个Hsp90结合位点都被Hsp70所共享。先前的工作已经确定，缺失残基Ile219、Ile220和Ile250，Val251会减少Hsp70与tau的结合(33). 与此结果一致，这些残基存在于肽微阵列测量的第三和第四个Hsp70结合位点。使用软件程序进一步验证了这些Hsp70结合位点(34)用于预测原核Hsp70，DnaK的结合位点。使用这种方法，站点2、3和4得到了肯定的识别。
通过肽微阵列测量，Hsp70和Hsp90结合tau上离散和部分重叠的位点（A） 显示了使用Hsp70核苷酸结合域（NBD）、Hsp90和Hsp70（均为10μM）的代表性阵列结果。此外，在背景减除后，显示了每个阵列点在532 nm波长处的荧光强度，一式三份。强度高于总数据集平均值3个标准平均误差（SEM）的肽用红色表示。仅结合Hsp70 NBD或抗体的肽用灰色表示。为了清楚起见，去除了一个假阳性点（阵列ID:161）。（B） Hsp70和Hsp90结合位点映射到4R0N tau上的示意图，突出了四个微管结合重复序列（R1-4）。
肽微阵列研究结果表明，Hsp90结合位点与Hsp70共享，并表明这些伴侣可能会竞争与tau的结合。为了测试这个模型，我们首先合成了与微阵列预测的结合位点相对应的肽（约7到15个氨基酸）。然而，这些肽表现出弱（>100μM）结合，这很难准确测量。因此，我们的目的是通过在类似ELISA的平台上研究4RON tau背景下Hsp70和Hsp90的结合来验证该模型。固定化的Hsp70结合tau的亲和力为2.9±0.2μM，结合Hsp90的亲和力稍弱7.0±1.0μM(). 正如阵列结果所预测的那样，Hsp70与Hsp90竞争结合（IC50~4微米）(). 相反，Hsp90在与Hsp70竞争（IC50>50μM），可能是因为两个独特的Hsp70结合位点(). 在主要应激诱导型（Hsp70，Hsp90α）和组成表达型（Hsc70，Hps90β）亚型中观察到了这些相同的关系(). 基于这些结果，我们得出结论，质谱法观察到的MB-引发的Hsp90结合增加可能是由于Hsp70在τ内共享结合位点上与Hsp90交换的结果。
Hsp70与Hsp90竞争结合tau（A） 固定化的Hsp70和Hsp90与4RONτ结合。（B） 可溶性Hsp70可以通过IC抑制tau与固定化Hsp90的结合50值为4μM。作为对照，游离Hsp90也与这种相互作用竞争。（C） 可溶性Hsp90仅与固定化Hsp70弱竞争，以与IC结合到τ50值大于50μM。作为对照，游离Hsp70抑制与IC的结合508μM。使用不同的Hsp70和Hsp90亚型可以看到类似的值（参见). 所有实验均一式三份。结果显示为平均值的平均值和标准误差。
表1
| Hsp70 tau结合 | Hsp90α-tau结合 |
|---|
|
|---|
| 蛋白质 | 集成电路50微米 | 扫描电镜 | 集成电路50微米 | 扫描电镜 |
|---|
| 热休克蛋白70（HSPA1B） | 8 | 4 | 4 | 2 |
| Hsc70（HSPA8） | 17 | 9 | 1.9 | 0.5 |
|
| 热休克蛋白90α（HSP90AA1） | >100 | 不适用 | 4 | 2 |
| 热休克蛋白90β（HSP90AB1） | 59 | 42 | 三 | 1 |
|
| 缓冲器 | >100 | 不适用 | >100 | 不适用 |
| Hsp70下一个工作日 | >100 | 不适用 | 不适用 | 不适用 |
阿尔茨海默病患者大脑中的Hsp90降低
这些结果表明，tau降解可能对Hsp70和Hsp90的相对水平敏感。更具体地说，Hsp90水平降低可能有利于τ的净保留，可能会失衡τ的体内平衡。为了探索这个想法，我们检查了GDS810数据集，该数据集收集了早期、中度和重度AD患者海马组织的微阵列表达数据，以及年龄匹配的对照组(35). 同样，我们询问了{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE5281”，“term_id”：“5281”}}GSE5281标准数据集，包括AD患者和年龄匹配的对照组解剖的、组织病理学正常的海马神经元的表达结果(36,37). 先前对这些数据集的分析已经注意到蛋白质折叠基因中与AD相关的变化，例如伴侣。然而，我们想特别询问Hsp70和Hsp90的相对水平如何随着疾病的变化而变化。因此，我们分析了这两个数据集(补充图3)观察到具有统计学意义的变化和趋势，表明AD相关的Hsp90下降(). 虽然样本量相对较小，但我们没有观察到应激诱导的Hsp70水平（HSPA1B、HSPA2、HSPA6、HSPA14）的持续变化，但在这两个数据集中，Hsc70（HSPA8）均下降(). 对于本研究而言，重要的是，AD中应激诱导的Hsp70和Hsp90的比率发生了显著变化，这表明这种伴侣比率的失衡可能有助于tau的积累。有趣的是，这些发现与AD小鼠模型中的观察结果一致，在该模型中，Hsp90蛋白水平与tau水平呈负相关(17). 综上所述，出现了一个模型，其中Hsp90水平和Hsp70:Hsp90比率有助于确定τ的稳定性。
表2
阿尔茨海默病（AD）中Hsp70和Hsp90的基因表达水平变化。
讨论
Tau稳态在神经退行性Tau病中很重要，加强Tau降解可能是一种有前景的治疗策略(10,13–16). 因此，重要的是要了解稳定τ和有利于其周转的途径。使用化学生物学方法，我们专门研究了tau相关蛋白质组在急性转变为降解过程中发生的早期变化。
在tau相关蛋白列表中，一个引人注目的观察结果是Hsp70（HSPA1B）结合缺失，同时Hsp90（HSP90AB1）结合增加。Hsp70在这个过程中扮演什么角色？先前的研究结果表明，Hsp70在稳定tau中很重要。例如，Hsc70需要在微管上回收τ，这可能会限制其在降解途径中的可用性(19). 然而，同样清楚的是，Hsp70并不仅仅用于稳定τ。例如，如果是这样的话，那么Hsp70敲除应该会降低tau水平，表现为MB治疗。相反，Hsp70敲除或过度表达时，通常只观察到tau水平的轻微变化(17). 解释这些观察结果的一种可能方法是，Hsp70可以在τ向降解途径的“传递”中发挥积极作用。在这些研究中，这一过程可能是由MB启动的，因为虽然MB肯定不是选择性Hsp70抑制剂(38,39)，Hsp70过表达增强化合物诱导的tau降解(13). 因此，MB可能导致Hsp70的结构转变，将伴侣蛋白与降解途径联系起来。这种机制可能涉及共同伴侣，例如连接Hsp70和Hsp90系统的Hop，或者，Hsp70中tau的急性释放可能会产生一种tau结构，该结构与Hsp90结合得特别好。在这个模型中，化学抑制剂所支持的Hsp70活性可能不会产生与敲除或过度表达相同的表型，从而去除整个蛋白质。相反，这种转变可能需要化学触发，例如MB或其他Hsp70抑制剂，它们可以改变Hsp70的核苷酸状态、底物亲和力和/或构象。(16,40)
Hsp90在这个过程中扮演什么角色？我们的观察结果表明，Hsp90在τ的降解中发挥了作用（参见). Hsp90最为人所知的是其稳定约200个“客户”蛋白的能力，例如糖皮质激素受体（GR）(28). 在这些系统中，Hsp90通常存在于保护活性蛋白折叠的最终高亲和力复合物中(27,41–43). 因此，Hsp90抑制剂通常通过涉及Hsp70的过程减轻保护作用并有利于客户降解。因此，Hsp90通常被认为是一种保护性伴侣，而Hsp70被认为是一种分型伴侣。然而，在文献中有一些明确的客户不遵循这种范式。例如，Hsp90促进von Hippel-Lindau抑癌蛋白和高密度脂蛋白的降解(29,30)在这些系统中，Hsp70似乎在折叠中起上游作用。我们的结果表明，tau可能属于后一类，Hsp90承担了促进人员流动的任务。然而，陶似乎在一些重要方面有所不同。例如，Hsp90抑制剂阻止Von Hippel-Lindau抑癌蛋白和高密度脂蛋白的降解，而这些化合物减少依赖CHIP的途径中的突变和磷酸化tau，但不减少HSF-1或Hsp70(20). 这些发现指向一个模型，其中Hsp90稳定某些形式的τ，保护它们免受清除(20,31,44)当Hsp90或Hsp70被抑制时，也参与tau的清除。显然，Hsp90在τ体内平衡中所起的作用是复杂的。
将这些观察合理化的一个引人注目的方法是调用不同的Hsp90“池”。Hsp90参与与许多不同共伴侣的蛋白质-蛋白质相互作用，最近的研究已经很好地表明，不同的Hsp90复合物存在于胞质溶胶中(45). 我们可以推测，其中一些Hsp90配合物可能参与稳定τ，而其他配合物，例如MB处理明显偏爱的配合物，可能以其为降解目标。事实上，已知一些Hsp90共同伴侣可以促进τ的稳定，如cdc37和FKBP51，而其他的则加速降解，如FKBP52和CHIP(16). 此外，Hsp90的乙酰化状态也可能影响其是否以tau为降解目标(46,47). 不幸的是，在τ质谱研究中，共伴侣水平没有明显变化(补充表1)，但这些因素可能不够丰富，或者结合力较弱。为了更好地理解这一机制，可能需要进一步研究，可能需要使用靶向单个Hsp90复合物的小分子。
在理解tau降解过程中，一些最大的未解决问题是在tau从Hsp70切换到Hsp90期间发生了什么，以及在Hsp90-tau复合物形成后发生了什么？一个关键的观察结果可能是，Hsp70与Hsp90有效竞争结合tau，但不是相反（参见和). 因此，Hsp90介导的降解可能依赖于释放Hsp70的先前信号，而且，该信号可能诱导Hsp70构象，从而主动招募Hsp90。尽管有这些推测和开放性问题，但本文的工作提供了一个出乎意料的见解，即Hsp90是如何参与降解τ以响应MB的。此外，这些发现表明Hsp70与Hsp90的交换是该机制的一个关键方面。该模型得到了患者表达数据和小鼠模型结果的支持(17)Hsp90转录水平的降低与tau的积累和AD有关。对这一过程的进一步了解可能会加速tau病的药物发现，也许可以通过建议使用Hsp70和Hsp90抑制剂来最大限度地恢复tau体内平衡。我们认为，使用化学探针快速改变τ的命运将是实现这一目标的一个特别有价值的策略。
最后，对复合治疗敏感的τ相关蛋白列表（参见)包括许多因素，包括ILF-2（NFAT）、ILF-3和ataxin 2，这些因素以前与tau蛋白毒性有关。虽然我们的工作重点是Hsp70和Hsp90在调节tau蛋白稳态中的作用，但这一tau相关因子列表可能会在其他有助于调节tau稳态的蛋白质中得到丰富。例如，虽然不是本研究的重点，但ataxin-2（ATXN2）和ataxin-2-like蛋白质（ATXN2L）的结果尤其引人注目，降解过程中与tau的结合分别减少了约16倍和8倍。这些观察很有趣，因为ataxin-2与脊髓小脑共济失调2型（SCA2）有关，后者是一种聚谷氨酰胺扩张性神经退行性疾病(48)因此，这些疾病相关蛋白之间的直接接触可能在其病理生理学中很重要。
方法
试剂、细胞系和一般方法
四甲基硫堇（亚甲基蓝）购自西格玛。。以20 nM转染siRNA（Qiagen）(20,21). 使用的抗体如下：V5（Sigma，V8137）、β-肌动蛋白（Anaspec，54591）、tau-WB/ELISA（Santa Cruz Biotech，sc5587）、pTau（pS396/S404，由Peter Davies Albert Einstein博士医学院提供）、Hsp70（检测设计）、Hps90（Santa Cruz Bietech，sc7947）、山羊抗兔HRP（Anasspec，28177）和山羊抗鼠HRP（Anaspec 28173）。所有细胞均按照ATCC指南进行维护。稳定转染过表达野生型4RON人tau的HeLa（C3）细胞之前是通过G418（Invitrogen）克隆选择产生的(13). 使用SpectraMax M5多模读板器（Molecular Devices）进行吸光度测量。
蛋白质印迹分析
使用10–20%Tris-Tricine凝胶（Invitrogen）在还原和变性条件下分离样品。转移到硝化纤维素膜（Whatman）后，在TBS-T（25 mM Tris–HCl，pH 7.4，140 mM NaCl，0.1%v/v Tween 20）中用5%w/v牛奶封闭膜至少3小时。除非另有说明，否则在含有2%w/v牛血清白蛋白（BSA，Sigma）的TBS-T中，将膜在4°C下与稀释至1:1000的一级抗体孵育过夜，以检测蛋白质水平。最后，用适当的HRP-结合二级抗体在TBS-T中用5%w/v BSA稀释1:10000培养膜1小时。每个步骤用TBS-T冲洗膜三次，每次5分钟。使用Supersignal West Pico化学发光试剂盒（Thermo Scientific）开发膜。免疫沉淀样品的western blot分析使用1:250 Hsp70抗体和1:500 Hsp90抗体的滴度。
V5-tau免疫沉淀
稳定转染V5-4RON tau的HeLa细胞(13)生长到90%的汇合处，然后用5μM硼替昔单抗处理4小时，然后用50μM MB或载体（DMSO）对照（1%v/v）处理10分钟。用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒的M-Per裂解缓冲液裂解细胞(19)并通过与75μl与琼脂糖珠结合的山羊抗-V5（Bethyl Laboratories，S190-119）在4°C下在黑暗中孵育过夜，使5 mg裂解物免疫沉淀。随后用100μl PBS（10mM Na2高性能操作4，2 mM千赫2人事军官4pH 7.4、137 mM NaCl和2.7 mM KCl）+0.1%v/v吐温20，然后用100μL和200μL PBS洗涤。最后用45μL 0.1 M甘氨酸（pH 2.7）洗脱相关蛋白，并通过添加5μL 1M Tris-HCl（pH 8.0）中和。在10-20%Tris-Tricine凝胶（Invitrogen）上分离25μL这些样品，用于western blot或质谱分析。利用该HeLa模型的前期工作表明，V5-4R0N tau以多种磷酸化形式存在，包括pS212/p231、pS262/S456和pS396/S404(13,21). 此外，MB降低了总tau和S396/S404处磷酸化的tau(13). 因此，V5免疫沉淀样品可能包括许多tau和磷酸-tau变体，提供了tau相关蛋白质组变化的概述。
质谱法
在两个独立的生物样品上进行免疫沉淀，并如所述使用10-20%Tris-Tricine凝胶（Invitrogen）进行分离。每个样品都用胰蛋白酶进行凝胶内消化，蛋白质通过密歇根大学蛋白质组学资源设施的液相色谱-高分辨率串联质谱（LTQ-Orbitrap XL，ThermoFisher）进行鉴定，使用前面描述的标准协议(49). 对每个样品进行三次技术性质量规格分析，为每个条件提供总共六个数据集。使用msconvert将ThermoFisher RAW文件转换为mzXML格式(50)并根据人类UniProt数据库（发布版本：2010_09）进行搜索。这个数据库fasta文件包含20286个与反向（诱饵）序列和常见污染物串联的蛋白质条目。使用X！执行搜索！与k-score插件串联(51,52). 使用Trans-Proteomic Pipeline（TPP）软件套件中的PeptidePhropet和ProteinProphet对搜索结果进行后处理(补充表1).
定量光谱分析
使用Abacus从六个数据集中的每一个数据中获得总光谱计数(55). 使用的算盘参数为：maxIniProbTH=0.97，minCombinedFilePw=0.5，所有其他参数均保持默认值。使用这些选项，蛋白质水平的假发现率（FDR）达到0.05。在此阈值下，在所有六个数据集中，504个蛋白质被鉴定为与V5-tau共免疫沉淀。通过QSpec无标签定量评估差异蛋白表达(56). 从QSpec的结果来看，如果一个蛋白质的贝叶斯因子大于10，并且表现出大于2的倍数变化，则认为该蛋白质与tau存在差异关联。根据这个定义，在504个共同免疫沉淀蛋白中，有48个在MB治疗中被发现存在差异相关(,补充表1).
蛋白质纯化
如前所述，使用His柱纯化人Hsp70（HSPA1A）、Hsc70（HSPA 8）和Hsp70 NBD（1–383）用于DnaK，包括如图所示通过TEV蛋白酶裂解His标签，并在ATP-琼脂糖柱上进行最终纯化(57,58). 如前所述纯化人Hsp90-beta（HSP90AB1）和Hsp90-alpha（Hsp90 AA1）(59). 根据先前开发的方案纯化N-末端His标记的人4RON tau(60).
Tau肽微阵列
tau肽微阵列是使用具有4个氨基酸悬链的15肽设计的，跨越PNS-tau的全序列({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P10636”，“术语id”：“334302961”}}第10636页–9). 此外，预期结合Hsp70和Hsp90的全长蛋白作为阳性对照打印，包括人和小鼠IgG和tau。空白点用作阴性对照。阵列以一式三份的形式打印在单个显微镜载玻片上（JPT肽技术）。根据制造商的方案，在结合缓冲液（25 mM HEPES pH 7.2、150 mM NaCl、20 mM KCl、5 mM MgCl）中使用10μM Hsp70-His、Hsp90-His或Hsp70核苷酸结合域（NBD）测试结合2和0.5 mM DTT）。使用1:1000滴度的Hilyte555抗-His抗体（Anaspec）在TBS-T中与1%w/v BSA（Sigma）进行结合检测，并使用GenePix 4100A微阵列扫描仪（分子器件）和标准局部背景减法以532 nM的荧光发射扫描阵列。结合被定义为荧光信号大于总数据集平均值以上3个标准误差的肽。在Hsp70 NBD或单独抗体测试中呈阳性的肽被排除为假阳性。
基于ELISA的tau绑定
伴侣与τ结合的程序改编自先前的报告(61). 简单地说，0.1 mg mL−1将固定缓冲液（50 mM MES，pH 5.5和0.5 mM DTT）中的人Hsp70或Hsp90（30μL）添加到96 well板（Thermo Fisher，透明，非无菌，平底）的每个孔中，这些板在37°C下培养6小时。然后用100μL TBS-T（3×3 min，摇晃）清洗微孔。向这些孔中加入50μL结合缓冲液（25mM HEPES，pH 7.2，150mM NaCl，20mM KCl，5mM MgCl2，和0.5 mM DTT）加1 mM ATP，在室温下孵育平板，轻轻摇晃过夜。在7.5μMτ的存在下进行竞争实验。使用兔抗金一级抗体（Santa Cruz，sc5587）（1:2000稀释，TBS-T，50μL/孔）和山羊抗兔HRP结合二级抗体（Anaspec，28177）（1:200稀释，TBS-T，50微升/孔）研制板。TMB底物试剂盒（细胞信号技术）用于检测结合。在每个实验中，4RON与空白对照孔的非特异性结合信号被用作阴性对照，但该信号最小。在适用于Windows的GraphPad Prism 5.0版（GraphPad-Software）中，使用具有非零截距的双曲线拟合拟合结合曲线。
致谢
作者感谢W.Pratt、A.Lieberman和Y.Osawa的有益讨论。我们还要感谢D.Southworth在净化Hsp90方面的帮助。密歇根大学病理蛋白质组学核心系进行了质谱研究。A.Thompson得到了国家卫生研究所（F30AG035464）的博士前研究金的支持。这项工作还得到了NIH R01NS059690和密歇根州阿尔茨海默病研究中心（MADC）的匿名礼物的支持。NIH R01NS073899、CurePSP和老年痴呆症协会向C.Dickey提供了额外支持。
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