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单元格。作者手稿；PMC 2012年10月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2012年4月27日；149(3): 656–670.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2012.01.058
预防性维修识别码：项目经理3472002
美国国立卫生研究院：尼姆斯404373
PMID：22541435

癌基因Kras通过调节合成代谢葡萄糖代谢维持胰腺癌

郝强英,1,2,15 亚历克·金默尔曼,三，15,* 科斯塔斯·利西奥提斯,4,8,15 苏俊华,1,2 杰拉尔德·朱棣文,1,2,9 艾略特·弗莱彻-萨纳尼科内,1,2 Jason W.Locasale先生,4,8 Jaekyoung儿子,三 张海雷（Hailei Zhang）,1 乔纳森·科尔夫,5 海燕燕,1,2 王伟（音译）,1,2,10 陈淑娟,1 安德烈亚·维亚尔,1,2 郑洪武,1,2 白志业（Ji-hye Paik）,1,2 凯罗尔·利姆,1,2 亚历山大·吉马拉斯,12 埃里克·S·马丁,1,2 杰弗里·张,1,2 阿拉姆·F·赫泽尔,1,2 塞缪尔·佩里,1,2 胡健,1,2 博伊甘,1,2 肖永红,1 约翰·M·阿萨拉,6,8 斯莱德,4,12 Y.Alan Wang（王亚伦）,1,2 琳达·琴,1,2,11,13 刘易斯·坎特利,4,8和罗纳德·德皮尼奥1,2,7,14,*
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补充材料

总结

肿瘤维持依赖于驱动致癌基因的持续活性，尽管它们的速率限制作用高度依赖于环境。致癌的喀斯特突变是胰腺导管腺癌（PDAC）的特征性事件，在肿瘤发生中起着关键作用。这里，一个诱导物喀斯特G12D系列-驱动PDAC鼠标模型表明，高级PDAC仍然严格依赖于KrasG12D系列表达式。转录组和代谢组分析表明KrasG12D系列通过刺激葡萄糖摄取和引导葡萄糖中间产物进入己糖生物合成和磷酸戊糖途径（PPP），在控制肿瘤代谢中起着至关重要的作用。这些研究还表明，致癌Kras促进了核糖的生物生成。与规范模型不同，我们证明KrasG12D系列将糖酵解中间体转化为非氧化性PPP，从而使核糖生物生成与NADP/NADPH介导的氧化还原控制脱钩。总之，这项工作提供了体内机制方面的见解，以了解致癌Kras如何促进天然肿瘤中的代谢重编程，并阐明可用于PDAC治疗的潜在代谢靶点。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症之一，5年生存率约为5%(伊达尔戈，2010). 从胰腺上皮内瘤变（PanINs）到侵袭性和转移性疾病的恶性进展伴随着早期获得激活突变KRAS公司在90%以上的病例中发生癌基因，以及随后的肿瘤抑制因子丢失，包括INK4A/ARF公司,TP53型、和座椅模块组件4(Hezel等人，2006年). 基因工程小鼠模型（GEMM）为致癌Kras（KrasG12D系列)作为PDAC启动的主要驱动因素，上述抑癌基因限制进展(Aguirre等人，2003年;Guerra等人，2003年;Hingorani等人，2003年). 尽管Kras表达的shRNA消亡及其效应物的药理学抑制可能会损害人类PDAC细胞系的生长，但针对RAS-MAPK通路关键成分的药物的临床试验显示出微弱的反应(Rinehart等人，2004年;Singh和Settleman，2009年). 临床进展的缺乏可能与许多因素有关，包括致癌Kras缺乏肿瘤维持作用、下游信号代用品冗余、药物进入肿瘤的次优渗透性和/或由于大量基因组改变和肿瘤内异质性导致的肿瘤可塑性(伊达尔戈，2010).

构成克拉G12D系列信号传导通过激活其下游信号通路，如MAPK和PI3K-mTOR通路，驱动癌细胞不受控制的增殖并提高其生存率(Gysin等人，2011年). 为了满足增强增殖的合成代谢需求，癌细胞需要足够的能量和生物合成前体作为细胞生长的燃料。在癌细胞中，代谢途径被重新连接，以便将葡萄糖和谷氨酰胺等营养物质转移到合成代谢途径中，以满足对细胞构建块的需求(Vander Heiden等人，2009年). 越来越多的证据表明，肿瘤代谢的重新编程受到各种致癌信号的控制(Levine和Puzio-Kuter，2010年). 特别是Ras癌基因被证明可以促进糖酵解(Racker等人，1985年;Yun等人，2009年). 然而，致癌Kras协调代谢转变以维持肿瘤生长的机制，特别是在肿瘤微环境中，以及特定代谢途径是否对Kras介导的肿瘤维持至关重要，仍然是积极研究的领域。在这里，我们建立了PDAC的可诱导致癌Kras模型，并确定该基因对体内肿瘤维持至关重要。综合转录组学、生物化学和代谢组学分析揭示了Kras癌基因通过选择性激活生物合成途径来维持肿瘤生长，从而在重新编程肿瘤代谢中的基本作用。

结果

喀斯特G12D系列对PDAC维护至关重要

控制克拉斯G12D系列以时间和组织特异性的方式表达，我们生成了一个条件喀斯特G12D系列在启动子和启动子起始密码子之间插入lox-stop-lox（LSL）盒的tet-operator控制下转基因喀斯特G12D系列开放式阅读框(tetO_Lox-Stop-Lox-KrasG12D系列，已指定四联件_LKrasG12D系列) (图S1A在线提供）。这些老鼠被杂交到ROSA26-LSL-rtTA-IRES-GFP公司(ROSA_rtTA公司) (Belteki等人，2005年)和p48芯(Kawaguchi等人，2002年)小鼠使胰腺特异性和多西环素（doxy）诱导的喀斯特G12D系列(图S1B). 这种三重转基因菌株在下文中被指定为iKras公司.强效治疗有效诱发致癌喀斯特表达和活动(图S1C和S1D)，但并未大幅增加总额喀斯特mRNA或蛋白质水平的表达(图S1C和S1E). 灭绝喀斯特G12D系列脱毒后24小时内发生转基因(图S1C和S1D).

与Kras的角色一致G12D系列作为PDAC启动的驱动程序(Hezel等人，2006年)，多西诱导在2周内引发腺泡-导管化生和PanIN损伤(图S1F). 类似于LSL-Kras公司G12D系列引入模型喀斯特G12D系列转基因导致长潜伏期（35-70周）后侵袭性PDAC罕见发生(图S1F)，表明其具有可比的生物活性喀斯特G12D系列等位基因和肿瘤进展对额外遗传事件的需要。实现恶性进展并评估Kras的肿瘤维持作用G12D系列在晚期恶性肿瘤中，我们iKras公司和有条件第53页淘汰赛(第53页L（左）)等位基因(Marino等人，2000年). 在3周龄时接受doxy治疗后iKras p53基因L（左）/+小鼠在11至25周龄时死于PDAC（中位生存期为15周），而多西治疗组iKras p53基因升/升小鼠死于PDAC的速度更快，平均存活7.9周(图1A). 这个iKras p53基因突变型肿瘤表现出人类PDAC常见的特征，包括腺瘤结构、旺盛的基质、对周围结构（如十二指肠）的局部侵袭以及向肝和肺的远处转移(图1B). 组织学分析证实8月8日有侵袭性PDACiKras p53基因L（左）/+诱导后8周的小鼠(图S1G). 因此，我们评估了克拉斯的影响G12D系列诱导9周后肿瘤生物学消退和维持。如所示图1C，克拉斯G12D系列消亡导致肿瘤快速消退，肿瘤细胞形态恶化，基质细胞迅速退化，从48小时开始，在多西停药后72小时达到峰值。在多西停药1周后，MRI显示肿瘤重量减轻约50%，而PET/CT显示氟脱氧葡萄糖（FDG）摄取完全丧失(图1D和1E). 在组织病理学水平上，几乎肿瘤的所有恶性成分都退化了，剩下的胰腺显示胶原沉积在少数残留的导管结构周围(图1C). 相应地，肿瘤消退伴随着肿瘤细胞增殖减少（BrdU掺入）和凋亡增加（Caspase-3激活(图2A和S2A公司; 数据未显示）。此外，克拉斯G12D系列胰腺星状细胞减少（以SMA染色为标志）表明，消亡影响了肿瘤基质的显著变化(图2A)是PDAC中经典基质反应的重要组成部分。这表明致癌Kras对基质室具有显著的非细胞自主效应。上皮室平行细胞培养试验的增殖减少和细胞凋亡增加的体内发现，如原代肿瘤细胞克隆生长的丧失(图S2B)与细胞自主机制对肿瘤退化的作用一致。这些发现共同证明了KrasG12D系列在这种原位模型中，PDAC维持需要表达，支持肿瘤细胞及其相关基质的增殖和生存。

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喀斯特G12D系列失活导致肿瘤快速消退

（A） 指定基因型小鼠的Kaplan-Meier总体生存分析。指出了每个基因型的队列大小。箭头：开始戒毒治疗的时间点。关于：小鼠从3周龄开始喂食含多糖的水。关闭：小鼠被保持为不含doxy。

（B） PDAC的组织病理学特征iKras p53基因L（左）/+小鼠表现为（i）典型的导管腺癌，腺癌细胞分化良好，间质反应强烈；（ii）肿瘤细胞局部侵入十二指肠壁（虚线右侧）；（iii）肝转移（箭头）；（iv）肺转移（箭头）。

（C） H&E染色显示脱毒后指定时间点PDAC的组织学变化。比例尺代表100μm。

（D） MRI扫描显示肿瘤（虚线内的区域）在戒断强力霉素7天后收缩。

（E）18doxy停药后第0天和第7天荷瘤小鼠的FDG-PET/CT扫描。*，肿瘤；Kd，肾脏；Bd，膀胱穹隆。

另请参见图S1.

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Kras肿瘤消退的组织病理学特征G12D系列停用

（A） iKras p53基因L（左）/+从3周龄开始，用含多糖的水喂养小鼠9周。在指定的日期将小鼠从doxy治疗中拉出，并注射BrdU。胰腺肿瘤用BrdU抗体（第i、iv、vii、x组）、裂解caspase3抗体（第ii、v、viii、xi组）和SMA抗体（第iii、vi、ix、xii组）染色。

（B） 对来自（A）的胰腺肿瘤进行了磷酸化标记抗体染色（第i、iii、v、vii组）和磷酸化-S6（第ii、iv、vi、viii组）。比例尺表示100 mm。

另请参见图S2.

这些生物变化与原型Kras信号成分的变化一致，包括在戒断doxy后24小时通过磷酸化Erk测定的MAPK信号减少(图2B)在肿瘤形态发生任何明显变化之前。磷酸化-Erk降低后，mTOR信号减弱，肿瘤细胞中磷酸化-S6降低证明了这一点，尽管在一些基质细胞中信号仍然很高(图2B). 这些体内信号模式与培养肿瘤细胞中的信号模式相匹配(图S2C). 正如预期，LSL克拉斯G12D系列第53页L（左）/+原代肿瘤细胞培养没有显示出依赖于氧的信号改变(图S2D).

喀斯特G12D系列在转录水平调节多种代谢途径

为了进一步了解克拉斯G12D系列-介导的肿瘤维持，转录组学分析使用原位iKras p53基因由五个独立的原发肿瘤细胞系产生的零肿瘤。重要的是，这些原位肿瘤忠实地再现了原发肿瘤的组织学和分子特征(图S3A). 审计与Kras相关的近端分子变化G12D系列灭活，在多西停药后24小时收获肿瘤。此时间点显示Ras活动的记录损失(图3A)但没有形态变化或增殖显著减少(图S2A). 基因集富集分析（GSEA）(Subramanian等人，2005年)体内和体外KrasG12D系列使用KEGG基因集的转录组显示了代谢过程的显著代表性，包括类固醇生物合成、嘧啶代谢、O-聚糖生物合成和聚糖结构生物合成途径的下调(图3B和3C和表S1). 此外，异种移植瘤和培养的亲本系在差异表达基因的表达水平上表现出显著的相关性(图S3B)这表明培养的肿瘤细胞系可能对体内肿瘤研究起到补充作用。

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Kras诱导的转录变化G12D系列停用

（A） 原位异种移植瘤由五个独立的原发肿瘤生成iKras p53基因我/+PDAC细胞系。将动物置于doxy上2周，直到肿瘤完全形成。将一半的动物从doxy上取下24小时，然后制备肿瘤裂解物。Ras活性用Raf-RBD下拉法测定。

（B） 富含指定代谢途径的基因的热图说明了脱毒后基因表达的变化。显示的表达式级别代表日志2来自异种移植瘤或培养的亲代细胞系的每个复制的值。红色信号表示相对于组内平均表达水平较高的表达，绿色信号表示相对于平均表达水平较低的表达。

（C） 基于反义与反义基因表达谱的类固醇生物合成（顶部）、嘧啶代谢（中部）和O-聚糖生物合成（底部）途径的GSEA图。NES表示标准化富集分数。

另请参见图S3.

喀斯特G12D系列提高糖酵解通量

审问克拉斯的角色G12D系列在肿瘤代谢的调节中，进行了靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）代谢组学研究，以全面表征Kras后立即发生的代谢变化G12D系列撤回(Yuan等人，2012年). 分析表明，克拉斯G12D系列灭绝影响了涉及多个途径的重大代谢变化，其中最重要的是葡萄糖代谢的中间产物(图4A和4B). 与Kras的功能一致G12D系列在糖酵解的调节中(Racker等人，1985年)，克拉斯G12D系列消亡伴随着葡萄糖-6-磷酸盐（G6P）、果糖-6-磷酸（F6P）和果糖-1,6-二磷酸（FBP）的显著下降，糖酵解中的其余成分变化最小(图4E). 此外，克拉斯G12D系列绝食导致葡萄糖摄取和乳酸生成减少(图4C和4D)证明致癌KrasG12D系列增强PDAC中的糖酵解通量。这些代谢变化与转录谱中的基因表达变化高度一致，这表明葡萄糖转运蛋白下调(谷氨酸/Slc2a1)和其他几种速率限制性糖酵解酶香港1号,香港2号、和Pfkl公司，以及利达，丙酮酸转化为乳酸的酶(图4A和S4A系列). 这些数据表明克拉斯G12D系列在该模型中，通过调节多个速率限制步骤（包括控制葡萄糖摄取和随后代谢的步骤）对葡萄糖利用至关重要。有趣的是，我们还观察到KrasG12D系列失活并不伴随TCA循环中间产物的显著变化(图S4B). 这一发现符合一个模型，即增殖细胞将葡萄糖代谢物转移到合成代谢过程中（例如核苷酸和脂质生物合成），而替代碳源被用来为TCA循环提供燃料(Vander Heiden等人，2009年). 事实上，与之前的报告一致(Gao等人，2009年;怀斯等人，2008年)，谷氨酰胺是克拉斯地区TCA循环的主要碳源G12D系列-驱动PDAC电池，如统一标记（U-13C类6)-葡萄糖和U-13C类5-谷氨酰胺示踪(图S4C).

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喀斯特G12D系列绝灭导致葡萄糖摄取和糖酵解减少

（A） Kras糖酵解变化总结G12D系列灭活。戒毒后减少的代谢物用绿色箭头表示。条形图显示了差异表达的糖酵解酶的相对表达水平，这些酶在缺乏多西的情况下显著降低；这些酶的基因名称发生了显著变化，这幅蓝色的漫画也突出了这些酶的名称。糖化酶的表达变化不显著，用灰色表示。

（B） 这两种代谢物在戒毒后显著且持续变化的热图iKras p53基因L（左）/+通过使用SRM的靶向LC-MS/MS确定的品系。将细胞在多西存在或不存在下维持24小时，此时从每种处理条件的三份中测量代谢物水平。不同调节代谢物的反义与反义水平的平均比率在热图中表示。星号表示与糖代谢有关的代谢物在戒除强迫症后减少。

（C和D）iKras p53基因L（左）/+细胞在有或无多西的条件下保存24小时。测量培养基中葡萄糖（C）或乳酸（D）水平的相对变化，并将其归一化为细胞数。

（E） 脱糖24小时后糖酵解中间产物的折叠变化。*p<0.05**p<0.01。误差条表示平均值的SD。B（1,3）PG，1,3-二磷酸甘油酯；B（2，3）PG，2，3-二磷酸甘油酯；磷酸二羟基丙酮；FBP，1,6-二磷酸果糖；F6P，6-磷酸果糖；G6P，6-磷酸葡萄糖；G3P，3-磷酸甘油醛；磷酸烯醇丙酮酸；3PG，3-磷酸甘油酯。

另请参见图S4.

喀斯特G12D系列激活己糖胺生物合成途径和蛋白质糖基化

因为克拉斯G12D系列-调节的葡萄糖代谢产物，包括G6P和F6P，是其他葡萄糖利用途径的前体，即己糖生物合成途径（HBP）和磷酸戊糖途径（PPP），我们在KrasG12D系列灭活。稳态代谢物分析显示，葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN-6P）显著降低，这是控制进入HBP的承诺步骤的产物(图5A和5B). 相应地，降低速率限制酶的调节，Gfpt1型，在转录和蛋白质水平上被证明(图5C和5D). 此外，GSEA还下调了O-糖基化和聚糖结构生物合成途径(图3B和5安)doxy细胞的western blotting显示总O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）翻译后修饰水平降低(图5E)，HBP为哦-和N个-连接糖基化。这种糖基化降低的情况与葡萄糖饥饿时观察到的情况相当(图5E)并强烈表明致癌KrasG12D系列对于维持既定肿瘤中的蛋白糖基化至关重要。

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喀斯特G12D系列失活导致己糖胺生物合成途径和蛋白质O-糖基化受到抑制

（A） Kras后HBP变化总结G12D系列灭活。戒毒后减少的代谢物用绿色箭头表示。脱毒后不同表达的基因以蓝色突出显示。

（B） 多西停药24小时后HBP中代谢物的倍数变化。

（C和D）Gfpt1的相对mRNA（C）和蛋白质水平（D）在有或无doxy的情况下持续24小时。

（E） Western blot分析在存在或不存在多西的情况下维持24小时的细胞中O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）水平。对于对照样品，MEF在存在或没有葡萄糖的情况下培养24小时。

（F） Western blot分析感染抗GFP或Gfpt1 shRNA的细胞中O-GlcNAc和Gfpt1水平。

（G和H）克隆形成试验（G）和软黄集落形成试验（H）iKras p53基因L（左）/+或LSL-Kras p53基因L（左）/+PDAC细胞感染抗GFP或Gfpt1的shRNA。

（I） iKras p53基因L（左）/+用抗GFP或Gfpt1的shRNA感染细胞株，并皮下注射到裸鼠体内。测量了肿瘤体积，显示的数据代表了三个独立细胞系的结果*p<0.05**p<0.01。

误差条表示平均值的SD。GlcNAc-1P，N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸；GlcNAc-6P，N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸；GlcN6P，6-磷酸葡萄糖胺；UDP-GlcNAc，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。另请参见图S5.

进一步证实Kras的重要性G12D系列-我们评估了Gfpt1 shRNA敲除的影响。Gfpt1基因敲除在提供蛋白质糖基化底物方面起着关键作用，它将总的O-连接糖基化降低到与Kras的肿瘤细胞相似的水平G12D系列熄灭(图5F). Gfpt1敲除也抑制了来自两种来源的肿瘤细胞的克隆形成和软琼脂生长iKras p53基因L（左）/+以及LSL-Kras公司G12D系列第53页L（左）/+肿瘤细胞(图5G和5H)并抑制异种移植瘤在体内的生长(图5I). 值得注意的是，Gfpt1敲除组中出现的肿瘤显示Gfpt1表达恢复(图S5B). 因此，克拉斯G12D系列-介导的肿瘤维持至少部分依赖于其对HBP和相关蛋白糖基化的刺激。

喀斯特G12D系列通过PPP的非氧化臂促进核糖生物生成

PPP利用葡萄糖生成DNA/RNA的核糖环，并以NADPH的形式维持细胞还原能力(Debrardinis等人，2008b). 代谢组分析还揭示了PPP中几种代谢物的显著变化(图6A). 特别是，PPP特有的一种中间体，七磷酸sedohe-pulose-7（S7P）在Kras后显著减少G12D系列熄灭(图6C). 进一步阐明Kras的作用G12D系列通过PPP对葡萄糖分解代谢的活性，我们使用U-13C类6-葡萄糖追踪葡萄糖流入PPP的流量。与稳态数据一致，我们观察到KrasG12D系列在不影响糖酵解代谢物进入TCA循环的流量的情况下，糖酵化流量增加(图S6A和数据未显示）。此外，我们观察到U的通量急剧减少-13C类6-葡萄糖转化为5-磷酸核糖（R5P）、S7P和4-磷酸赤藓糖（E4P），这是PPP非氧化臂所特有的成分(图6B). 鉴于我们没有观察到PPP氧化臂的流量变化，这一点尤其引人注目(图6B)稳态分析也没有明显变化(图6C). 考虑到致癌Kras信号传导和PPP的非氧化臂之间的联系，我们试图比较和量化通过PPP的两个臂（氧化和非氧化）的流量。

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喀斯特G12D系列优先增强非氧化PPP以支持核糖生物生成

（A） Kras购买力平价变化汇总G12D系列灭活。戒毒后减少的代谢物用绿色箭头表示。脱毒后不同表达的基因以蓝色突出显示。

（B）iKras p53基因L（左）/+细胞在doxy存在或不存在的情况下维持24小时，此时U-13在1、3和10分钟时比较所示代谢物的C葡萄糖标记动力学。

（C） 脱毒24小时后PPP中代谢物的折叠变化。

（D） 在有或无doxy的情况下24小时PPP基因的相对mRNA水平。

（E）iKras p53基因我/+细胞在doxy存在或不存在的情况下维持24小时，然后用1-14C或6-14C葡萄糖。测定放射性并入DNA或RNA的情况，并将其归一化为DNA或RNA浓度。

（F）iKras p53基因L（左）/+细胞分别或联合感染抗Rpia和Rpe的shRNA。以抗GFP的shRNA作为对照。细胞标记为1-14C葡萄糖和放射性并入DNA和RNA的测定如（E）所示。

（G）iKras p53基因L（左）/+将细胞维持在高（11 mM）或低（1 mM）葡萄糖下，测定感染抗GFP、Rpia或Rpe shRNA的细胞的克隆形成活性。

（H） 菌落数量的量化。

（一）iKras p53基因L（左）/+用抗GFP、Rpia或Rpe的shRNA感染细胞，并皮下注射到裸鼠体内。测量了肿瘤体积，显示的数据代表了三个独立细胞系的结果。

误差条表示平均值的SD*p<0.05**p<0.01。E4P，4-磷酸红糖；GδL6P，6-磷酸葡萄糖-δ-内酯；GSH，还原型谷胱甘肽；GSSG，氧化谷胱甘肽；6PG，6-磷酸葡萄糖酸盐；R5P，5-磷酸核糖；Ru5P，5-磷酸核酮糖；SBP，1,7-二磷酸己酮糖；X5P，5-磷酸木果糖。另请参见图S6.

有人建议PPP的氧化和非氧化臂可以解耦以促进核糖生物合成，而不会影响细胞氧化还原平衡（NADP+/NADPH比率）(Boros等人，1998年). 在克拉斯的背景下探索这种可能性G12D系列-驱动PDAC，14C类1-或14C类6-用标记的葡萄糖测量一氧化碳的生成2来自氧化PPP(14C类1-CO公司2)相对于糖酵解-TCA循环路线产生的(14C类6-CO公司2). 与我们之前的数据一致，KrasG12D系列去诱导对TCA循环中间体的影响最小(图S4B)，版本没有明显变化14C类6-CO公司2在道西退出时被观察到(图S6B). 更重要的是14C类1-CO公司2检测到(图S6B)表明克拉斯G12D系列消亡与PPP氧化臂流量减少无关。此外，细胞内由NADPH调节的还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）水平未被Kras显著改变G12D系列代谢组分析和生化分析测定的失活(图6C和S6C系列). 这些结果有力地证明了克拉斯G12D系列不介导PPP的氧化臂。

为了以致癌Kras依赖的方式进一步询问非氧化性PPP代谢物的差异丰度，我们使用1,2-标记的方法追踪了单个葡萄糖碳的掺入13C-葡萄糖。如所示图S6D，克拉斯G12D系列灭绝导致1,2的显著减少-13C-标记的G3P和F6P（糖酵解和PPP代谢物）以及非氧化PPP特定代谢物S7P和1,7-二磷酸沉积庚酮糖（SBP）。与1,2-标记实验一致，我们还观察到Kras上的SBP显著降低G12D系列稳态分析中的失活(图6C). SBP最近被证明是非氧化PPP中的代谢物，其水解为S7P提供了热力学驱动力，以推动核糖的生物生成，而不涉及氧化臂(Clasquin等人，2011年). SBP对癌基因灭绝的下调意味着KrasG12D系列可能利用这种机制促进通过PPP的非氧化臂的流动，尽管负责在哺乳动物中介导这种反应的酶仍有待发现。

PPP非氧化臂的主要作用是生成核糖-5-磷酸（R5P）。因此，我们假设Kras将葡萄糖流入PPP的非氧化臂G12D系列为肿瘤细胞提供足够的R5P以进行DNA/RNA生物合成。为了探索这种可能性，我们使用了14C类1-或14C类6-标记葡萄糖以追踪氧化与非氧化PPP对DNA和RNA的贡献14C类6-无论PPP的氧化臂或非氧化臂使用标记的葡萄糖都会产生放射性DNA/RNA，14C类1-标记的葡萄糖只有在非氧化臂使用时才会产生放射性DNA/RNA（14C类1标签作为CO丢失2通过氧化臂；图S6B). 如所示图6E，克拉斯G12D系列灭绝导致两者合并的急剧下降14C类1-和14C类6-标记的葡萄糖转化为DNA/RNA，清楚地证明了优势和KrasG12D系列-PPP非氧化臂在R5P生物生成中的介导作用。这些数据揭示了克拉斯的重要作用G12D系列在PDAC肿瘤中通过PPP的非氧化臂优先维持糖酵解通量。

抑制非氧化性PPP抑制KrasG12D系列-依赖性肿瘤发生

根据PPP非氧化臂的特定调节，参与氧化臂的酶包括G6pd公司,Pgls公司、和Pgd公司以及G6pd的酶活性（氧化臂的速率限制步骤）在Kras作用下没有改变G12D系列灭绝(图6D和S6E系列). 相反印尼盾和卢比，PPP非氧化臂中调节碳交换反应的酶显著减少(图6D). 与它们在非氧化性PPP中的作用一致，Rpia或Rpe或其组合的敲除显著降低了14C类1-将葡萄糖标记为DNA/RNA(图6F和S6F系列)表明致癌Kras对非氧化性PPP流量的选择性调节至少部分通过Rpia和Rpe介导。更重要的是，尽管Rpia或Rpe敲除适度抑制了iKras p53基因L（左）/+肿瘤细胞在高糖（11 mM）中，当细胞转换到低糖介质（1 mM）时，抑制作用显著增强(图6G和6H)这可能反映出Kras后葡萄糖摄取和糖酵解通量下降G12D系列灭绝。Rpia或Rpe基因敲除后异种移植瘤生长减少证实了这些发现(图6I)进一步支持Kras期间非氧化PPP的功能重要性G12D系列-调解PDAC维护。

喀斯特G12D系列通过MAPK和Myc途径在PDAC中重新编程代谢

进一步剖析Kras的下游机制G12D系列-通过介导代谢重编程，我们使用特定的药物抑制剂来检测效应通路对肿瘤代谢的影响。如所示图7A几个糖酵解基因的表达(葡萄糖转运蛋白1,香港1号,Eno1公司,利达)，速率控制HBP基因(Gfpt1型)以及一个非氧化PPP基因(印尼盾)MEK抑制显著降低（AZD8330），其剂量对ERK磷酸化的影响与戒断多西后观察到的相似(图S7A). 一贯地，MAPK抑制重演了KrasG12D系列糖酵解、HBP和非氧化PPP途径中失活诱导的代谢物变化(图S7B). 这些数据表明，MAPK通路是癌基因Kras介导的PDAC葡萄糖代谢重构的主要效应器，这与癌基因失活后MAPK信号的快速减少一致(图2B,S2C和S2D). 相反，尽管mTOR信号在Kras上也被抑制G12D系列灭活后，雷帕霉素治疗不会引起葡萄糖代谢的广泛变化。与癌基因沉默时Akt信号的最小变化一致(图S2C和S2D)PI3K-AKT信号（BKM120）的抑制对iKras导向的肿瘤代谢没有显著影响(图7A,S7A和S7B).

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MAPK路径对Kras至关重要G12D系列-介导的代谢重新编程

（A） iKras p53基因L（左）/+用AZD8330（50 nM）、BKM120（150 nM）或雷帕霉素（20 nM）处理细胞18小时。同时，细胞在有或无doxy的条件下培养24小时作为对照，并用QPCR测定指示代谢基因的相对mRNA水平。误差条表示平均值的SD*p<0.05**p<0.01。

（B） Kras上葡萄糖代谢变化的示意图G12D系列撤回。致癌Kras的激活通过增加葡萄糖的摄取并随后分流到糖酵解、HBP途径（促进糖基化）和PPP的非氧化臂（促进DNA/RNA的核糖生物合成）来维持PDAC肿瘤。当KrasG12D系列已停用。

深入了解克拉人G12D系列-促进代谢重编程的介导转录调控，对Kras上差异表达的基因进行启动子分析G12D系列灭活。生物信息学顺式-元素分析显示Myc结合元素高度富集(图S7C，p=5.11×10−65). 此外，Kras后Myc蛋白水平降低G12D系列灭活或MEK抑制剂治疗(图S7A和S7D). 因为已经证明Myc是Ras依赖性肿瘤维持所必需的(Soucek等人，2008年)，我们假设Myc可能是Kras的重要调解人G12D系列-代谢基因的依赖性转录调控。事实上，shRNA敲低MyciKras公司PDAC细胞显著下调糖酵解、HBP和非氧化PPP途径中代谢基因的表达(图S7E和S7F). Kras诱导代谢基因转录变化的另一个可能的候选介质是HIF1α。尽管Kras转录变化中HIF1α启动子元件有所富集，但HIF1α的敲除对代谢酶表达的影响很小（数据未显示）。总之，我们的数据表明MAPK通路和Myc定向转录控制在Kras中起着关键作用G12D系列-PDAC中介导的代谢重编程。

讨论

在本研究中，可诱导KrasG12D系列-驱动的PDAC模型提供了基因证据，证明致癌Kras在完全建立的PDAC中起着肿瘤维持作用。Kras后立即进行综合基因组、生化和代谢组学分析G12D系列灭绝揭示了多种代谢途径的显著扰动。尤其是克拉斯G12D系列通过调节葡萄糖转运体和转录水平上的几个速率限制酶来有效控制糖酵解，这些酶共同作用于将葡萄糖代谢分流到合成代谢途径，例如用于蛋白质糖基化的HBP和用于核糖生产的PPP(图7B). 值得注意的是，我们确定了致癌Kras和PPP的非氧化臂之间的意外联系，PPP的功能是为DNA和RNA生物合成提供前体。几种Kras的功能验证G12D系列-受调控的代谢酶为这一难治性疾病的特征癌基因提供了候选治疗靶点和相关生物标记物。

喀斯特G12D系列PDAC维护需要

多个GEMM的研究表明，肿瘤的维持通常依赖于启动肿瘤发展的驱动癌基因(Chin等人，1999年;费尔谢尔和毕晓普，1999年;Fisher等人，2001年;穆迪等人，2002年). 然而，最近对人类PDAC细胞系的体外研究表明，某些表达突变Kras的胰腺细胞系可能会失去对该癌基因的依赖性(Singh等人，2009年)提出了致癌Kras是否与体内晚期PDAC的肿瘤维持相关的问题。在我们的研究中，在Kras治疗后约1周观察完全建立的肿瘤的完全消退G12D系列灭绝强调了这种标志性癌基因在PDAC中的重要作用，尽管我们不能排除残留癌细胞的可能性。此外，我们的数据揭示了致癌Kras表达的肿瘤细胞与PDAC特征的显著促结缔组织增生基质之间的关键关系。Kras灭绝后，SMA阳性胰腺星状细胞迅速减少。最近的研究表明，PDAC患者基质SMA阳性与预后不良之间存在相关性(Fujita等人，2010年). 很容易推测克拉斯G12D系列可能促进前驱因子的旁分泌，如Sonic Hedgehog(Neesse等人，2011年); 然而，还需要进一步的工作来定义这种复杂的关系。

致癌克拉斯G12D系列引导葡萄糖代谢进入PDAC的生物合成途径

细胞代谢的重新编程以支持持续增殖是癌症的标志(Hanahan和Weinberg，2011年). 我们对Kras的体内分析G12D系列灭绝显示，在任何可辨别的生物影响（如形态或增殖变化）之前，特定代谢酶及其途径迅速下调，这一发现与Kras对肿瘤细胞代谢的主动控制一致G12D系列事实上，已知Kras癌基因可诱导有氧糖酵解(Racker等人，1985年)PDAC细胞的代谢与有氧糖酵解升高一致(Zhou等人，2011年). 有趣的是，这种代谢转换可能依赖于细胞类型或致癌Ras亚型，因为H-Ras转化的间充质干细胞在转化过程中不依赖于增加糖酵解产生ATP(Funes等人，2007年).

代谢基因表达的显著且特异的转录改变与代谢的实际变化高度一致，这为通过变构效应对速率限制酶进行代谢调节的成熟方法增添了新的内容。我们的发现强调了基因表达作为实现肿瘤细胞代谢重编程以确定代谢通量路径和速率的机制的相关性(DeBerardinis等人，2008年a). 这种转录调控的另一个重要特征是，Kras癌基因通过对多个节点（包括速率限制酶）的高度协调控制，实现了代谢途径的重组。

我们的工作确定KrasG12D系列消光导致葡萄糖摄取受到抑制，一些糖酵解中间产物减少，包括G6P、F6P和FBP。虽然从生物能量学的角度来看，有氧糖酵解被认为是低效的，但代谢重编程到糖酵化状态被认为是一种机制，可以将糖酵分解中间产物分配到生物合成途径中(Vander Heiden等人，2009年). 事实上，我们已经证明，增强的糖酵解通量被转移到非氧化PPP中，以促进核糖的生物生成。此外，这些假设也得到了以下观察结果的支持：PHGDH公司，一种限速酶，其功能是将3-磷酸甘油酯（一种糖酵解中间体）转移到丝氨酸生物合成途径中，在某些情况下促进肿瘤生长(Locasale等人，2011年;波塞马托等人，2011年).

Kras对己糖胺生物合成和糖基化途径的激活G12D系列

在这项研究中，我们提供了证据表明，致癌Kras在葡萄糖流入HBP的过程中起着重要作用。我们的数据显示，作为HBP的第一步和速率限制步骤，Gfpt1的表达在Kras上强烈下调G12D系列灭活。HBP对于各种糖基化过程是必需的，例如蛋白质N-或O-糖基化和糖脂合成。尽管人们对其在肿瘤发生过程中的作用知之甚少，但最近的研究表明，HBP对营养吸收的协调很重要，部分是通过调节生长因子受体的糖基化和膜定位(Wellen等人，2010年). 蛋白质和脂类糖基化是一种丰富的翻译后修饰，在肿瘤细胞增殖、侵袭/转移、血管生成和免疫逃避中起着基本的调节作用(Fuster和Esko，2005年;哈特和科普兰，2010年). Ras致癌基因已被证明诱导N个-人类结直肠癌细胞中的糖基化和Kras突变与N-连接碳水化合物分支增加有关(Bolscher等人，1988年;Dennis等人，1989年;Rak等人，1991年;Wojciechowicz等人，1995年). 在这里，我们提供了额外的证据，证明致癌Kras信号也在肿瘤维持期间维持蛋白O-糖基化。

喀斯特G12D系列诱导非氧化PPP流量

PPP被认为对肿瘤发生很重要，因为它为大分子生物合成和ROS解毒提供NADPH，并为DNA/RNA合成提供核糖5-磷酸(Boros等人，1998年;Debrardinis等人，2008b). 此外，研究表明Ras癌基因通过基于GSH的ROS清除剂途径促进对氧化应激的抵抗(DeNicola等人，2011年;Recktenwald等人，2008年)，这可能部分由通过PPP的氧化臂产生NADPH介导。事实上，已经证明PPP的氧化臂被Kras癌基因介导的转化激活，以促进细胞增殖(Vizan等人，2005年;Weinberg等人，2010年). 值得注意的是，我们没有观察到氧化PPP的明显变化，而是致癌Kras信号在PPP非氧化臂的优先维持中的作用。最近研究表明，p53通过直接结合抑制G6PD活性(Jiang等人，2011年). 因此，PDAC肿瘤细胞中的氧化PPP可能在很大程度上受p53缺陷的调节，而Kras的致癌信号G12D系列通过从头合成途径维持核苷酸库。事实上，最近的证据表明，非氧化性PPP在包括胰腺癌在内的肿瘤细胞中优先上调(Boros等人，2005年;Tong等人，2009年). 我们的数据表明，这种代谢变化受到致癌Kras的严格调控，并且抑制非氧化PPP阻止致瘤活性。这些数据表明，抑制核苷酸生物合成的早期步骤，例如R5P的产生，可以为Kras提供有用的治疗策略G12D系列突变肿瘤。

克拉斯的一个有趣的观察G12D系列-介导的代谢重编程是Kras后SBP的降低G12D系列灭活。有趣的是，最近在酵母中发现了一种酶，它能使SBP脱磷酸化，从而为不依赖于氧化臂的典型F型非氧化PPP通量提供热力学驱动力(Clasquin等人，2011年). 然而，鉴定哺乳动物直系祖先的尝试却失败了。另外，据报道，SBP也在肝脏中的替代性“L型”PPP中发挥作用，最终进入非氧化臂(Williams等人，1987年). 我们的发现提供了该途径与驱动癌基因的独特联系，并可能为这些Ras-driven肿瘤提供新的诊断和治疗途径。

实验程序

质粒构建物的制备及转基因小鼠

含有突变小鼠的片段喀斯特G12D系列cDNA(Johnson等人，2001年)用于生成tetO_Lox-Stop-Lox-KrasG12D系列通过标准克隆方法进行转基因。详细的方法和额外的等位基因在扩展实验程序中进行了描述。所有操作均根据IACUC批准协议04116进行。

异种移植研究

原位异种移植物，5×105将悬浮在10μl 50%Matrigel（BD Biosciences）/Hanks缓冲盐水溶液中的细胞胰腺注射到NCr裸鼠（Taconic）体内。动物被喂以异味水。

对于Sub-Q异种移植物，1×106将悬浮在100μl Hanks缓冲盐水溶液中的细胞皮下注射到NCr裸鼠（Taconic）的下腹部。动物被喂以异味水。从注射后第4天开始，每3天测量一次肿瘤体积，并使用体积=长度×宽度的公式计算2/2.所有异种移植实验均根据IACUC方案04114获得批准。

免疫组织化学和Western Blot分析

组织在10%福尔马林中固定过夜，并包埋在石蜡中。按照描述进行免疫组织化学分析(Aguirre等人，2003年). 用于免疫组织化学或western的主要抗体在扩展实验程序中列出。

靶向质谱法

扩展实验程序中描述了LC-MS/MS代谢物的制备和测量。

同位素标记和动力学剖面

补充有10%透析血清和1,2的无葡萄糖或无谷氨酰胺RPMI-13C类2-葡萄糖，U-13C类6-葡萄糖或U-13C类5-谷氨酰胺（剑桥同位素实验室）至11 mM（葡萄糖）或2 mM（谷氨酰胺）。细胞在有或无doxy的条件下保存24小时，此时将标记培养基添加到生物三倍体中。对于葡萄糖通量分析，细胞在有或无多西的情况下保持24小时，然后用含有U的培养基替换培养基-13C类6-葡萄糖。

1-14C/6号机组-14C葡萄糖并入核苷酸

细胞在存在或不存在doxy的情况下维持24小时，此时用1μCi 1处理生物三倍体-14C或6-14C葡萄糖。24小时后采集细胞。根据制造商的说明，使用QIAGEN试剂盒分离DNA或RNA，并使用NanoDrop仪器进行定量。将等量的DNA/RNA添加到闪烁瓶中，通过液体闪烁计数测量放射性，并将其归一化为DNA/RNA浓度。

14C葡萄糖并入CO2

细胞在有或无doxy的条件下维持24小时，此时用1μCi 1处理生物三倍体-14C或6-14C葡萄糖，并在37°C下培养指定的时间点。释放14一氧化碳2向每个孔中添加150μl 3 M高氯酸，并立即用苯乙胺饱和的Whatman纸覆盖，并在室温下培养过夜。然后通过闪烁计数对沃特曼纸进行分析。

废培养基的代谢物分析

将细胞接种在12孔板中，一式三份，培养24小时，然后在无氧培养基或含有多西的培养基中培养24小时。使用黄泉仪器（YSI）7100测量新鲜和废培养基中的葡萄糖和乳酸浓度。葡萄糖数据表示为浓度的净下降，乳酸表示为细胞数标准化后浓度的净增加。

表达谱分析与生物信息学分析

mRNA表达谱和数据分析在扩展实验程序中进行了描述。

慢病毒介导的shRNA靶向

靶向Gfpt1、Rpia、Rpe和非靶向对照构建物shGFP的慢病毒shRNA克隆从Dana-Farber/Broad研究所的RNAi联盟获得。shRNA的克隆ID列在扩展实验程序中。

统计分析

使用GraphPad Prism4分析无瘤生存率。采用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。使用未配对的学生t检验进行其他比较。对于所有带有误差条的实验，计算标准偏差（SD）以指示每个实验和数据内的变化，值表示平均值±SD。

补充材料

单击此处查看。（160万，pdf）

致谢

我们感谢克里斯托弗·赖特的p48-Cre小鼠；Shan Zhou和Shan Jiang负责小鼠群体的专家监测；Liu Yingchun、Zheng Yuxiang、Wu Ning、Alexandra Grassian、Joan Brugge、Min Yuan和Susanne Breitkopf，以获取有用的建议和技术支持。拨款支持来自NIH拨款T32 CA009382-26（H.Y.）和P01 CA117969（R.W.，L.C.，L.C.C.，R.A.D.）。U24 CA092782和P50 CA86355（R.W.）支持成像。质谱学得到了5P01CA120964-05（L.C.C.和J.A.）、5P30CA006516-46（J.A.）和BIDMC研究资本基金的支持。A.C.K.得到了国家癌症研究所拨款R01 CA157490、Kimmel学者奖和AACR-PanCAN职业发展奖的支持。C.A.L.是Damon Runyon癌症研究基金会（DRG-2056-10）的Amgen研究员。S.H.由Damon Runyon奖学金资助。A.C.K.是Forma Therapeutics的顾问。L.C.C.是Agios Pharmaceuticals公司的创始人，该公司开发药物以代谢酶为靶点进行癌症治疗。

脚注

补充信息

补充信息包括扩展实验过程、七个图和一个表，可以在doi:10.1016/j.cell.2012.01.058上在线找到这篇文章。

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