癌症生物治疗。2012年10月1日；13(12): 1185–1194.
非小细胞肺癌患者谷氨酰胺依赖性分析
GLS1剪接变异体GAC对癌细胞生长至关重要
葛兰素史克；肿瘤学研究；肿瘤代谢；美国宾夕法尼亚州Collegeville
- 补充资料
其他材料。
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摘要
癌症的特征之一是新陈代谢失调。许多肿瘤表现出通过有氧糖酵解过程增加葡萄糖摄取和分解，也称为Warburg效应。谷氨酰胺（Gln）途径的重要性在癌症的发展和进展中研究得较少，它为细胞提供了多种维持细胞增殖的基本产物，如ATP和生物合成大分子。为此，在一组非小细胞肺癌细胞系（NSCLC）中评估了Gln依赖性。Gln被发现对谷氨酰胺水解率高的细胞生长至关重要，在探索Gln途径中的多个基因后，发现GLS1是与这种依赖性相关的关键酶。通过观察外源性添加谷氨酰胺水解下游代谢物对生长下降的补救作用，证实了这种依赖性。发现与正常肺组织相比，GLS1剪接变异体KGA在肿瘤中的表达降低。GLS1剪接变异体的瞬时敲除表明GAC的丢失对癌细胞的生长具有最不利的影响。总之，NSCLC细胞系在不同程度上依赖Gln进行谷氨酸分解，其中GLS1剪接变异体GAC起着重要作用，是癌症代谢导向治疗的潜在靶点。
关键词：非小细胞肺癌、谷氨酰胺、谷氨酰胺酶、BPTES、癌症、谷氨酰胺水解
介绍
在肿瘤的发生和发展过程中，会发生各种各样的细胞外和细胞内变化。癌症的一个标志是能量平衡的改变。为了使癌细胞持续扩张，以ATP形式存在的能量以及诸如核苷酸和脂质等大分子都需要以更快的速度产生。1
人们普遍认为，癌细胞依赖葡萄糖（Glc）和氨基酸谷氨酰胺（Gln）维持生存和生长。因此，为了适应这种依赖性，他们可以增加对这两者的吸收。2-4通过糖酵解过程，Glc可以代谢为乳酸并在线粒体中分泌或进入三氯酸（TCA）循环。柠檬酸外流用于脱蛋氨酸脂肪酸合成将在循环中留下空白，可以通过谷氨酰胺醇解过程加以补充。在谷氨酰胺水解过程中，谷氨酰胺进入细胞，然后被谷氨酰胺酶（GLS）转化为谷氨酸，随后α-酮戊二酸，后者进入TCA循环。它可以通过苹果酸酶以苹果酸的形式退出循环，并被加工成乳酸。谷氨酰胺还为增殖细胞的生物合成提供了必要的氮源。5最后，谷氨酸可以转化为谷胱甘肽，这是一种众所周知的抗氧化剂，有助于保护癌细胞免受氧化应激，并导致化疗耐药性。6,7
GLS是谷氨酰胺水解途径中的初始酶，催化谷氨酰胺水解脱酰胺生成谷氨酸和氨。GLS在人类细胞中可以表达为两种亚型：GLS1，也称为肾谷氨酰胺酶（KGA），和GLS2，也称为肝谷氨酰胺酶（LGA）。GLS1可以通过选择性剪接以多种剪接变体的形式存在，KGA被认为是全长GLS1。KGA来源于外显子1-14和16-19，而第二个GLS1剪接变异体GAC有另一个羧基末端（仅来自外显子15），导致分子量较低的蛋白质。8这两种变体都有完整的GLS酶域，只有KGA在其独特的羧基末端含有锚蛋白重复序列。定位到线粒体后，两个GLS1变异体的N末端都可以被裂解，产生最终的活性酶。9
最近，GLS1和谷氨酰胺分解在癌症中的调节已被证明处于致癌控制之下。癌基因水平的c-Myc可通过抑制miR-23a/b并随后增加GLS1表达和谷氨酰胺代谢，促进癌细胞的谷氨酰胺成瘾。10,11谷氨酰胺代谢对于K-ras介导的凤尾鱼非依赖性生长也很重要，因为谷氨酰胺的耗竭或GLS1的短暂敲除会抑制K-ras突变细胞中观察到的集落形成。12GLS1的抑制抑制了成纤维细胞中Rho-GTPase的致癌转化，也抑制了乳腺癌和淋巴瘤癌细胞的生长。13最后，在表达突变IDH1的胶质瘤细胞中，GLS的抑制抑制细胞生长。14除了癌基因介导的谷氨酰胺成瘾外，其他研究表明，在Ehrlich腹水细胞中GLS1表达的稳定缺失会降低生长、致瘤性以及抗氧化能力。15,16
在所有肿瘤类型中，肺癌是最常见的死亡原因，仅在美国每年就有159390人死亡。17肺癌的两个主要分类是小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌有三种主要亚型：鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。SCLC患者对初始化疗和放疗的反应一般较好，而NSCLC患者的反应较差。因此，我们选择研究谷氨酰胺途径在非小细胞肺癌中的潜在重要性。
虽然糖酵解在肿瘤发展中的重要性已被广泛研究，但对谷氨酰胺依赖性和谷氨酰胺水解的了解较少。在这项研究中，研究了谷氨酰胺水解作用，特别是GLS1在非小细胞肺癌细胞系中的癌细胞生长中的作用。
结果
非小细胞肺癌细胞株表现出一系列谷氨酰胺依赖性
谷氨酰胺水解在癌细胞生长中的作用尚不清楚。因此，我们试图研究非小细胞肺癌（NSCLC）对谷氨酰胺的相对依赖性。一组39个细胞系，其中38个非小细胞肺癌细胞系和1个非癌肺细胞系在Glc或Gln存在或不存在的情况下生长72小时。通过测量总ATP水平来分析代谢物依赖性对细胞生长的影响。非小细胞肺癌株表现出对谷氨酰胺的一系列依赖性，正如ATP水平降低所证明的那样(;表S1)。39个品系中总共有15个表现出Gln依赖性，因为这些品系在无Gln培养基中的生长减少了70%或更多。15个品系表现出30-70%的生长降低，被认为表现出中等的谷氨酰胺依赖性。最后，39个品系中有9个表现出对谷氨酰胺消耗相对不敏感，细胞生长减少30%或更少。非癌系NHLF对谷氨酰胺缺乏表现出相对不敏感。
图1。非小细胞肺癌细胞系的Gln依赖性。细胞在有或无Gln的情况下生长，然后评估细胞生长。Gln依赖性被任意评级：白色条代表Gln依赖线，在缺少Gln的情况下生长等于或小于对照的30%；灰色条表示中间线（增长在30%到70%之间），黑色条表示与Gln无关的线（增长等于或大于70%）。
谷氨酰胺依赖细胞株消耗更多的谷氨酰胺
接下来，我们试图了解在被测细胞系中观察到的谷氨酰胺依赖性的原因是由于它们吸收外源性谷氨酰胺的能力，还是细胞内谷氨酰胺加工机制存在差异。由于谷氨酸及其直接代谢物谷氨酸是氨基酸，因此在含有谷氨酸和谷氨酸的培养基中培养了一组依赖谷氨酸和非依赖谷氨酸的细胞系，随后测量了氨基酸水平，作为消耗或生产的指标()。在四个依赖谷氨酰胺的细胞系（NCI-H1703、NCI-H647、NCI-H157和NCI-H1437）中，有三个细胞系表现出较高的谷氨酰胺摄取率（92–97%），在正常生长条件下，伴随着较高的谷氨酸分泌（随时间0增加5.9–8.5倍），NCI-H17003细胞表现出72%的谷氨酸摄取和3.8倍的谷氨酸释放。相比之下，四个非Gln依赖品系NCI-838、NCI-H2085、NCI-H226和NCI-H1395的Gln摄取量分别为61、52、82和36%，谷氨酸分泌量分别为3.1、1.2、0.05和1.6倍。定性地说，与非谷氨酰胺依赖细胞系相比，谷氨酰胺依赖性细胞系通常表现出较高的谷氨酰胺基础消耗。为了证实这些谷氨酰胺消耗仅与Gln依赖性相关，而与一般营养依赖性无关，这些细胞系在正常培养基或缺乏Glc或Gln的培养基中生长，随后评估细胞生长()。该分析结果表明，谷氨酸分解率（从)与细胞系Glc依赖性相比，未观察到与Gln依赖性。
图2。非小细胞肺癌株的氨基酸分析。（A） 条件培养基中的相对游离谷氨酰胺和谷氨酸水平。（B） 这些细胞系的Gln或Glc缺失对细胞生长的影响。从三份样品中计算值。
GLS 1是谷氨酰胺依赖性NCI-H1703细胞中谷氨酰胺水解的速率限制酶
我们的结果表明，与独立品系相比，谷氨酰胺依赖型非小细胞肺癌品系更倾向于谷氨酰胺的基础消耗。因此，我们研究了谷氨酰胺水解途径中的哪种酶是谷氨酰胺消耗的速率限制酶。为此，用SMARTpool siRNA瞬时转染Gln-依赖株NCI-H1703和非Gln-独立株NCI-H226，该siRNA针对在谷氨酰胺分解中起关键作用的酶，并且不属于必需的Krebs循环的一部分。这些亚型包括GLS1、GLS2、将谷氨酸转化为α-酮戊二酸的谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）亚型和负责苹果酸转化为丙酮酸的苹果酸酶（ME）亚型，丙酮酸在转化为乳酸后随后从细胞中释放出来。siRNA转染后，将细胞在含有Glc或耗尽的培养基中再培养72小时，并对细胞生长进行评估。敲除GLS 1（GLS1）表明NCI-H1703细胞的细胞生长减少（在含葡萄糖的培养基中减少61%，在无葡萄糖的情况下减少63%；)。相反，GLS1敲除对非依赖Gln的NCI-H226细胞的生长没有负面影响()。敲除其他酶对细胞生长没有影响。这些结果表明，GLS1是NCI-H1703细胞中谷氨酸分解的一种必需酶，而其他细胞则依赖于其他机制进行谷氨酸加工。
图3。谷氨酰胺依赖性和独立细胞系中谷氨酰胺分解靶点的敲除。用siRNA瞬时转染NCI-H1703（A）和NCI-H226细胞（B）中与谷氨酰胺分解有关的多种酶，然后在含有或不含Glc的培养基中培养4天，然后检测细胞生长。所示数据点代表三份样品的平均值±SD。
谷氨酰胺耗竭和GLS1抑制对细胞活力的影响相似
由于Gln依赖性品系NCI-H1703中GLS1的瞬时敲低降低了细胞生长，而在Gln非依赖性品系NCI-H226中没有观察到这一点，因此外源性Gln的退出或GLS1功能的丧失可能会通过减少的谷氨酰胺解解作用影响生长。然而，除GLS1处理Gln外，其他多种酶以及外源Gln的提取可能通过这些替代途径影响生长。20为了研究GLS1在观察到的谷氨酰胺撤除对细胞生长的影响中的重要性，将一组细胞系，包括谷氨酰胺依赖性和非依赖性细胞系，与GLS1特异性抑制剂bis-2[5-苯乙酰胺-1,2,4-噻二唑-2-基]乙基硫醚（BPTES）孵育。21或者，在存在或不存在Gln的情况下培养细胞，然后评估细胞生长。Gln依赖株系在Gln耗竭和BPTES处理下表现出相似的生长下降，在第6天Gln耗损时下降86-91%，在BPTES治疗时下降55-79%(，左侧面板）。相反，在任何一种条件下，在Gln不依赖的品系中都观察到很少的下降（不含Gln的2–33%，含BPTES的11–14%）(，右侧面板）。这些结果表明，GLS1的作用，而不是其他利用Gln的酶，是Gln提取观察到的效果的原因。由于谷氨酸是由GLS1形成的，我们接下来研究了谷氨酸或谷氨酸水解的下游产物α-酮戊二酸（aKG）是否可以挽救Gln耗竭或GLS1抑制()。Gln依赖性细胞系NCI-H647和NCI-H1703在退出Gln和BPTES治疗2 d后的生长均表现出类似的下降（NCI-H677细胞的生长分别下降86%和79%，NCI-H17003细胞的生长下降65%和64%）。在无谷氨酰胺培养基中添加谷氨酸和aKG可以使细胞在两种细胞系中生长至正常生长潜能的约70%。与之相反，两种产品都能拯救细胞生长，而在BPTES治疗中，只有aKG而非谷氨酸能够拯救细胞生长。综上所述，谷氨酰胺缺乏对细胞生长的影响主要是由于谷氨酰胺分解减少所致，因为GLS1抑制对生长有类似的负面影响，下游代谢物能够部分挽救生长。
图4。GLS1功能在Gln依赖和非依赖品系中的重要性。所示数据点代表三份样品的平均值±SD。（A） 细胞在没有或存在Gln的情况下生长指定时间，或用10uM BPTES处理，然后评估细胞生长。（B） 用2 mM或5mM DM-aKG或DM-Glu共同处理在无Gln的情况下生长的细胞或用BPTES处理的细胞2 d，以挽救生长。细胞生长数为CTG测定的ATP值。
GAC是非小细胞肺癌中主要的GLS1亚型
在确定谷氨酰胺水解，特别是GLS1功能对NSCLC细胞株亚群的生长至关重要之后，对GLS1的表达进行了更详细的研究。据描述，该表达不仅限于全长GLS1，也称为KGA（669个氨基酸的长度），还可以表达一个名为GAC的短剪接变体（598个氨基酸的长）。8GAC来源于一个在3′端带有替代外显子的转录本，取代了KGA转录本中的最后四个外显子，导致KGA C末端缺乏锚蛋白重复序列。这两种GSL1剪接变异体的表达尚不清楚，但有人认为GAC在肿瘤中过度表达。22我们分析了Affometrics U133plus2基因阵列探针序列，发现每个GLS1剪接变体在芯片上都有一个特定探针()。通过分析这些针对GAC或KGA的特异性探针，估计NSCLC株的表达(表S1)。为了确认这些mRNA比率，并研究GAC和KGA蛋白的表达，基于mRNA水平，采用针对这两种变体共同区域的抗体，通过western blot分析具有特定GAC:KGA比率的细胞系GLS1蛋白表达()。观察到的两条带是翻译后N末端断裂后GAC和KGA的预测蛋白大小（分别为58和66kDa），观察到的比率反映了每个细胞系的更多定量mRNA比率。这表明两种剪接变异体都可以在蛋白质水平上检测到，并且蛋白质和转录物比率相似。为了进一步研究非小细胞肺癌细胞株中GLS1剪接变异体的表达，设计并在癌细胞株NCI-H226和HCC2998中引入针对GAC或KGA或两者的特异性siRNA寡聚体，并通过western blot分析分析随后的敲除()。GLS1 SMARTpool siRNA处理导致两条带的表达降低，而GAC siRNA处理仅针对较低的GLS带，相反，KGA siRNA处理针对较高的带。由于现在可以在mRNA和蛋白质水平上分析GLS1剪接变异体的表达，我们接下来评估了原发性非小细胞肺癌肿瘤中两个GLS1剪切变异体与匹配的正常肺组织的相对转录表达()。与匹配的正常肺组织相比，肺肿瘤中的GAC:KGA比率显著增加，导致GAC成为肿瘤中主要的GLS剪接变体（p值=2E-7）。原发性非小细胞肺癌中GAC:KGA比率的增加是由于KGA表达显著降低所致，从正常肺的中值416降至肿瘤的164（p值=0.043；图S1A)。然而，GAC在肿瘤组织和正常组织中的表达没有显著差异（p值=0.67；图S1B)。在NSCLC细胞系中也观察到GAC比KGA具有同样的优势(表S1).
图5。GLS1剪接变异体表达/比率分析。（A） GLS1剪接变异体转录本的示意图，以及变异体特异探针的位置。（B） 分析NSCLC细胞裂解液中GLS1的表达。转录表达水平描述为Affymetrics MAS5值。（C） 用用于GAC或KGA的siRNA寡核苷酸瞬时转染具有不同GAC:KGA比率的细胞系，之后通过蛋白质印迹分析分析GLS1剪接变异体的表达。（D） 对NSCLC肿瘤和匹配的正常肺组织进行GAC:KGA比率分析。
GAC丢失对NSCLC细胞生长的影响大于KGA丢失
由于单个GLS1剪接变异体（GAC和/或KGA）的特异性短暂下调可以通过针对其独特的3′端转录序列的siRNA寡核苷酸实现，我们接下来想解决每个单个GLS1-剪接变种对细胞生长的需求。为此，用靶向GAC或KGA的两个siRNA寡核苷酸中的一个瞬时转染具有不同GAC:KGA比率的细胞系，计算活细胞数，或测量总蛋白水平()。GAC敲除导致NCI-H1703细胞和NCI-H1395细胞的细胞生长分别减少75-80%和38-47%，而KGA敲除仅使细胞生长分别降低27-34%和24-27%。总蛋白水平作为生长读数也观察到类似的趋势。重要的是，这些观察是在GAC主要表达的Gln-依赖性NCI-H1703细胞和KGA为主要剪接变异体的非Gln-独立NCI-H1395细胞中进行的。从中可以观察到，当分析来自生长测定的均衡细胞裂解物的蛋白质表达时，实现了单个GLS1剪接变异体的敲除。这些数据表明GAC是这些癌细胞中更重要的GLS1剪接变体。
图6。瞬态GLS1拼接变体敲除。通过测量GLS1剪接变异体被针对GAC或KGA的特异siRNA寡核苷酸瞬时敲除的细胞系中的活细胞计数（A）或总蛋白水平（B；BCA分析）来评估细胞生长。对实验样品（来自A）的均衡蛋白裂解液进行GLS1剪接变异体和肌动蛋白表达（C）分析。
讨论
NSCLC细胞系对代谢物，尤其是谷氨酰胺的依赖性进行了分析。对谷氨酰胺消耗敏感的品系的谷氨酰胺基础消耗量相对较高，抑制剂和敲除研究表明，GLS1是谷氨酰胺利用的关键成分。由于GLS1可以表达为两个剪接变异体，即GAC和KGA，因此对这些变异体的表达进行了研究。与正常组织相比，肿瘤中的GAC:KGA比率较高，GAC的瞬时敲除对生长的影响大于KGA的敲除。
我们表明，与独立品系相比，谷氨酰胺依赖品系具有更高的谷氨酰胺水解率。需要进一步研究来确定这种相对Gln依赖性的原因。速率限制酶GLS1的表达水平，特别是GAC水平，可能在建立谷氨酰胺剥夺敏感性方面起决定性作用。然而，GLS1的绝对表达水平和GLS1剪接变异体比率均与敏感性无关(表S1)。此外，谷氨酰胺合成酶的表达水平（谷氨酸到谷氨酰胺的反向反应）与谷氨酰胺依赖性没有负相关（数据未显示）。某些癌基因与细胞系对谷氨酰胺依赖性增加有关。例如，Myc调节GLS1表达，发现Gln对K-ras、IDH1突变和Rho-GTPase诱导的癌细胞生长至关重要。10-14然而，未观察到Gln依赖性与所选癌基因状态之间的相关性(表S1)。很可能，多种因素的组合决定了非小细胞肺癌细胞对谷氨酰胺的敏感性。
我们证明，在原发性肺肿瘤中，GAC与KGA的比率增加，并且显示了GAC在肿瘤细胞生长中的重要作用，即使存在葡萄糖。以前在癌症中已经证明谷氨酰胺分解和GLS1表达增加。23GAC:KGA比率的增加与之前的研究结果一致。8,24在组织培养环境中，GAC:KGA比例不影响谷氨酰胺依赖性。然而，还需要更多的工作来探讨改变原发性非小细胞肺癌代谢微环境中这一比率的后果。通过增加GAC表达或减少KGA表达来增加GAC:KGA的原因是什么？一种机制与另一种机制的一种解释可能是肿瘤之间的净Gln内流的差异。研究表明，致癌Myc可增加Gln转运体的表达，如ASCT2和SN2。11Myc还可以增加GLS1的表达。10在非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤中，未观察到这种Gln转运体表达增加，或观察到的程度较低，需要细胞下调KGA而非上调GAC。
似乎GAC:KGA比率不仅通过下调KGA转录而改变，还通过增加GAC蛋白表达而改变。据推测，GAC 3′-非翻译区（3′-UTR）中的pH-反应元件可以在酸性条件下稳定该转录物，这可能发生在肿瘤中，从而导致蛋白表达增加。25尽管这是一个很有吸引力的解释，但迄今为止还没有实验证据被描述，在不同pH条件下生长的癌细胞的初步内部数据显示，对GAC蛋白的绝对表达没有影响（数据未显示）。需要进一步研究来阐明这是否是调节蛋白质表达的机制。从结构上看，GAC和KGA都具有相同的GLS结构域，而它们之间只有羧基末端不同。动力学研究和GAC的X射线晶体结构表明，GAC是更好的适应GLS变体，以在其活化剂磷酸盐水平增加时发挥其功能。26
由于肿瘤显示出GAC:KGA比率的改变，并且这些细胞是快速增殖的细胞，对核苷酸的需求增加，因此可以假设这些细胞中改变的比率将使Gln池部分转向核苷酸合成。与这一观点相一致的是，KGA可以定位在细胞液中，而GAC是线粒体。26此外，观察到下游代谢产物谷氨酸和α酮戊二酸不能完全挽救GLS1抑制或Gln耗竭的生长，这表明谷氨酰胺可以用于其他目的，如核苷酸合成。在这方面，可以通过使用PKM公司该基因在癌症中表现出从PKM1到PKM2剪接变体的转变，导致从葡萄糖进入TCA循环转变为葡萄糖提供核苷酸、氨基酸和磷脂的生物合成。27
以前的研究都是通过短暂或稳定的GLS1敲除进行的。10,12,15,16这些研究与我们观察到的GLS1对肿瘤细胞生长的重要性相一致，但没有涉及单个剪接变异体GAC和KGA的具体贡献。在动物模型中，小分子，如谷氨酰胺类似物6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸（DON），与改良饮食相结合，可以降低肿瘤生长。28在细胞系统中，DON通过破坏线粒体功能和过早衰老来抑制细胞增殖。29,30然而，作为一种Gln模拟物，DON可以抑制多种Gln利用酶，而不仅仅是GLS。20BPTES是GLS1的变构特异性抑制剂，可能同时影响KGA和GAC。21作为一种工具化合物，它已被用于研究突变型IDH1抑制癌细胞生长。14最近，在Rho GTPase转化细胞的抑制性筛选中发现了一种新的GLS抑制剂。13确定的靶点是GAC，尽管KGA靶点尚未测试。总之，与正常组织相比，肿瘤中观察到的GAC:KGA比率增加，靶向GAC可以最大限度地提高抗肿瘤效果，同时最小化对正常组织的影响。
材料和方法
细胞系
细胞系，无支原体，在含有10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI（Gibco 72400）中生长，使用TrypLE（Gibco-）进行胰蛋白酶化，并在Vi-Cell XR计数器（Beckman Coulter）上计数。
代谢筛查
NSCLC株系在含有Glc和谷氨酸的RPMI中以96-well板的形式播种，并以生长速率依赖的密度补充10%的FBS。24小时后，仔细取出培养基，将细胞置于含有Glc和Gln（Gibco 11875）、不含Gln（Gibco 21700）或不含Glc（Gibco-11879）的100ul RPMI中，并补充10%的FBS。立即对细胞生长进行分析，或在分析前培养72或144小时。72小时后刷新细胞培养基。
敲除试验
根据制造商的方案（Invitrogen），使用脂质体RNAiMAX反向转染方案，以6或96 well格式瞬时转染细胞。将细胞导入10nM非特异性打乱或GLS1或其他靶向SMARTpool siRNA的谷氨酰胺水解靶点（Dharmacon）。为了击倒GAC或KGA，使用了特定的siRNA寡核苷酸（GAC:GGAAGUGGGAGAGAAAUU、CUAUGAAAGUCCACACAAUU、CCUUGGACCAUGGACUU、AAAAGACAGUAGGAAUU；KGA:CCCAAGAGGGAAUAUU、CUGGAGCCUGCAAAUU、GGACUUAGAAUU、GACACACCUCAAGAUU）。24小时后，用含有Gln（含或不含Glc）并补充有10%FBS的RPMI代替培养基，并将细胞再孵育72小时，除非另有说明，然后对其进行测定。
抑制剂/救援研究
细胞以96周的平板形式接种在含有Glc和谷氨酸的RPMI中，并以生长速率依赖的密度补充10%的FBS。24小时后，仔细取出培养基，将细胞置于100µl RPMI中，RPMI中补充有10%的FBS，含有或不含10µM BPTES的Gln，并且不存在二甲基-α-酮戊二酸（DM-aKG）和二甲基-谷氨酸（DM-Glu）（Sigma）。随后在指定的时间段内培养细胞，然后对其进行分析。
细胞生长测定
根据制造商的方案，通过使用CellTiterGlo（Promega）测量总ATP水平来评估细胞生长。
氨基酸分析
细胞以6孔板的形式以生长速率依赖的密度接种。24h后，用含有Glc和Gln的RPMI替换培养基，并补充10%的FBS。3d后，在日立High-Technologies L-8900型专用氨基酸分析仪（AminoAcids.com）上收集条件培养基并进行分析。氨基酸水平被归一化为总介质氨基酸水平减去谷氨酸和谷氨酸，然后计算出相对于0小时的氨基酸水平。
蛋白质印迹分析
蛋白质样品在RIPA缓冲液（Sigma）中通过细胞裂解制备，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂。通过BCA分析（Pierce）测量蛋白质含量，然后使样品的蛋白质浓度相等。通常，对10–20µg蛋白质进行western blot，然后用Li-Cor进行分析。GLS1抗体从Abcam（ab93434）获得，肌动蛋白抗体从Sigma获得。
鸣谢
作者想感谢葛兰素史克公司癌症代谢发现绩效部门的成员进行了有益的讨论。
词汇表
缩写：
| 非小细胞肺癌 | 非小细胞肺癌 |
| Glc公司 | 葡萄糖 |
| 格林 | 谷氨酰胺 |
| 谷氨酸 | 谷氨酸盐 |
| aKG（千克） | α-总谷氨酸盐 |
| GLS公司 | 谷氨酰胺酶 |
| GAC公司 | 谷氨酰胺酶C |
| KGA公司 | 肾谷氨酰胺酶 |
| GPT公司 | 谷氨酸丙酮酸转氨酶 |
| 我 | 苹果酸酶 |
| BPTES公司 | 双-2[5-苯基乙酰胺-1,2,4-噻二唑-2-基]乙基硫醚 |
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