美国国家科学院院刊。2001年6月19日；98(13): 7475–7480.
胰岛素抵抗状态下循环胰岛细胞生长因子的证据
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学部Joslin糖尿病中心研究部，邮编02215
*S.N.F.和R.N.K.为这项工作做出了同等贡献。
C.罗纳德·卡恩供稿
摘要
胰岛素抵抗是许多常见疾病的特征，包括肥胖和2型糖尿病。在这些疾病中，β细胞通过分泌能力增加、β细胞质量增加或两者兼而有之，长期补偿胰岛素抵抗。为了确定β细胞反应是否与循环生长因子有关，我们将正常胰岛移植到具有两种不同胰岛素抵抗模型的正常血糖胰岛素抵抗小鼠的肾包膜下：胰岛素受体和胰岛素受体底物-1（DH）双杂合缺失的瘦鼠或者肥胖、高血糖对象/对象老鼠。在移植到两个宿主的移植物中，β细胞有丝分裂活性和胰岛质量显著增加，与在内源性胰腺中观察到的相当。相比之下，移植到正常小鼠体内的DH小鼠胰岛的有丝分裂指数降低。这些数据表明，胰岛素抵抗与循环胰岛细胞生长因子有关，该因子与葡萄糖和肥胖无关。
许多常见疾病，包括肥胖、2型（非胰岛素依赖性）糖尿病、各种内分泌疾病、高血压和高脂血症都与胰岛素抵抗有关(1–4). 在2型糖尿病患者中，β细胞最终无法满足胰岛素抵抗导致高血糖的需求；然而，在大多数这些疾病中，β细胞通过增加分泌能力、增加β细胞质量或两者兼而有之来补偿胰岛素抵抗(5–7). 糖尿病啮齿动物模型，如对象/对象和数据库/数据库老鼠和Zucker富含脂肪的患有肥胖症和/或2型糖尿病的大鼠和高胰岛素血症患者在不同的疾病时期表现出轻微到明显的胰岛增生(8–12). 同样，一些胰岛素抵抗小鼠模型，例如通过胰岛素受体底物-1（IRS-1）基因失活或胰岛素受体和IRS-1的双杂合（DH）敲除而建立的模型，也表现出明显的胰岛增生(7,13,14).
胰岛素抵抗状态下导致β细胞增生的因素尚不清楚(15–17). 已知葡萄糖本身可以刺激β细胞复制（参考文献。17); 然而，DH和IRS-1淘汰赛和对象/对象和数据库/数据库在出现可检测到的高血糖之前，小鼠都表现出胰岛增生(7,14,18–20). 此外，在大多数情况下，增生反应与高血糖水平无关，这表明独立于葡萄糖的因素可能有助于胰岛生长。
本研究的目的是验证胰岛素抵抗通过一种循环有丝分裂因子诱导胰岛β细胞生长的假说，该因子与葡萄糖和肥胖无关。为了验证这一假设，我们采用了一种移植策略，将野生型（WT）胰岛移植到肾包膜下，移植到血糖正常的瘦DH小鼠和肥胖、高血糖的DH小鼠体内对象/对象具有相应对照的小鼠。
方法
动物。
为了减少胰岛排斥反应，胰岛素受体/胰岛素受体底物-1 DH小鼠(7)在塔科尼农场以C57BL为背景进行回交，纯度>98%，并在实验前与窝友WT对照一起运至约斯林动物设施。对象/对象小鼠和相应的C57BL/6J对照品购自杰克逊实验室。所有小鼠均保持正常的光/暗循环，并按照Joslin糖尿病中心动物护理和使用委员会的协议进行处理。小鼠被随意喂食正常的食物，移植后被单独饲养。为了避免高血糖的混淆效应，我们选择了血糖正常的DH雄性小鼠。
胰岛分离和移植。
采用导管内胶原酶技术分离雄性小鼠的胰岛(14). 从8周龄小鼠中分离出100个大小匹配的胰岛（≈80–100μm）后，使用解剖显微镜（GZ7立体缩放；莱卡，迪尔菲尔德，伊利诺伊州）手工采集，浓缩在颗粒中，并在冰上保存，直到移植。手术在麻醉下进行，使用2,2,2-三溴乙醇和第三种-戊醇，用PBS（pH 7.4）按1:50稀释。小鼠以15μl/g体重的剂量经腹腔注射该混合物。采用腹膜后入路，切开一只肾脏的包膜，并在10周龄雄性小鼠的上极附近植入胰岛。将胶囊烧灼后，让小鼠在加热垫上恢复。
葡萄糖、胰岛素和瘦素水平。
使用Elite血糖仪（Bayer、Elkhart、IN）至少在两个不同的场合测量血糖水平。早上（0800至1000之间）在喂食状态下从尾静脉采集血液，收集在冷冻的肝素试管中，立即离心以获取血浆，血浆储存在−20°C下，用于随后的胰岛素和瘦素ELISA（伊利诺伊州芝加哥Crystal Chem）。
胰腺和胰岛移植物的采集和切片。
移植后8周，给动物注射BrdUrd（100 mg/kg体重，无菌PBS中浓度为10 mg/ml，Sigma），并在6小时后通过服用过量的戊巴比妥钠杀死动物。快速解剖宿主动物胰腺和胰岛移植物，将其固定在Bouin溶液中，并用石蜡包埋。
马萨诸塞州。
胰腺免疫过氧化物酶染色切片上的β细胞质量通过点计数形态计量法进行评估(21,22). 从每个胰腺获得多个切片（每个切片之间间隔100μm），并使用覆盖每只小鼠至少150个区域的网格系统进行系统分析。如前所述，通过使用BX60显微镜（奥林巴斯，纽约纽海德公园）获取单独的图像(23). 计算β细胞、非β细胞和外分泌组织的相对体积。记录污染组织（胰腺导管、淋巴结、脂肪、肠道和胰腺外分泌）以校正胰腺重量。β细胞质量的计算公式如下：胰岛β细胞质量=相对β细胞体积×校正胰腺重量。
免疫组织化学和移植物分析。
胰腺和胰岛移植物切片与小鼠初级抗BrdUrd抗体（细胞增殖试剂盒，Amersham Pharmacia）和抗非β细胞抗体（抗胰高血糖素、抗生长抑素和抗胰多肽抗体的混合物）的混合物孵育，如其他地方所述(14,23)在4°C下过夜。切片在室温下与二级抗体（过氧化物酶联抗鼠IgG，ICN）孵育30分钟，用DAB进行可视化，并用苏木精进行复染。每个胰岛移植物的标记细胞核中至少有1200个β细胞被计数。的表面积就地胰岛移植物使用解剖显微镜（GZ7立体缩放，Fisher）进行测量，该显微镜配备有带有校准千分尺圆盘的目镜。使用Image Pro Plus（4.0，Media Cybernetics，Silver Spring，MD）测量胰岛移植横截面的厚度，并使用配备U-PMTVC视频适配器（Olympus）和HV-C20电视摄像机（Hitachi，Tokyo）的BX60显微镜（奥林巴斯）拍摄移植截面的图像。每季度对每个移植物进行三次测量，然后取平均值以获得厚度。以这种方式评估每个移植物的三个切片，并平均得出一个数据点。通过将接枝表面积乘以相应的平均接枝厚度来计算相对接枝体积。细胞凋亡通过就地用化学标记的核苷酸对DNA断裂和染色质浓缩进行染色。使用ApopTag试剂盒（Intergen，纽约）进行染色。使用Image Pro Plus（4.0）分别评估胰岛移植物中BrdUrd阳性细胞和凋亡细胞。每个胰岛移植物中至少有1000个细胞，并如上所述拍摄移植物横截面图像。
统计分析。
数据由配对和非配对学生的t吨使用Sigma Plot（SPSS，芝加哥）进行测试。A类P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。除非另有说明，否则所有数据均以平均值±SEM表示。
结果
体重。
移植前，IR/IRS-1双杂合子小鼠比之前观察到的对照小鼠稍小(7)而瘦素缺乏对象/对象小鼠肥胖，明显重于对照组（表). 在移植后的8周内，所有动物的体重都显著增加。移植期间各组的体重增加与假手术对照组相当，并且与小鼠的正常生长曲线一致（数据未显示）。
表1
| 胰岛捐赠者 | Tx收件人 | 血糖，mg/dl
| 血浆胰岛素，ng/ml
| 体重，g
|
|---|
| 发送前 | 后Tx | 预Tx | 后Tx | 预Tx | 后Tx |
|---|
| 重量 | 重量 | 112.9 ± 3.9 | 118.6 ± 3.9 | 1.67 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 27.5 ± 0.35 | 29.66 ± 0.37‡ |
| 重量 | DH公司 | 119.5 ± 3.1 | 118.1 ± 4.0 | 4.55 ± 0.6* | 8.0 ± 1.6*‡ | 26.4 ± 0.4* | 27.82 ± 0.34*‡ |
| 重量 | 对象/对象 | 181.1 ± 19.5* | 145.6 ± 5.3* | 42.5 ± 5.7* | 42.3 ± 4.9* | 58.1 ± 1.09* | 68.2 ± 1.35*‡ |
| DH公司 | 重量 | 128.3 ± 9.9 | 134.2 ± 7.5 | 2.1 ± 0.46 | 2.6 ± 0.5 | 28.82 ± 0.42 | 30.27 ± 0.28‡ |
| DH公司 | DH公司 | 146.4 ± 10.5 | 133.4 ± 9.3 | 7.9 ± 1.4* | 11.6 ± 1.6* | 26.77 ± 0.4* | 28.55 ± 0.39*‡ |
受体小鼠的血糖、血浆胰岛素和瘦素水平。
移植前阶段WT和DH受体小鼠的血糖水平具有可比性，而对象/对象该组出现中度高血糖，血糖水平高于正常值1.6倍（表). 正如预期的那样，由于用于移植的胰岛数量相对较少，在8周的移植期内，接受正常WT胰岛移植的小鼠的血糖水平没有出现统计上显著的变化。DH和对象/对象受体小鼠的血糖水平有轻微的下降趋势，尽管不明显。这可能反映了胰岛素敏感性的暂时改变。在移植后8周内，接受DH胰岛的WT或DH小鼠的血糖水平没有显著差异（表).
在移植前和移植后状态下，胰岛素抵抗DH和对象/对象小鼠的水平明显高于对照组（表). 尽管移植后WT和对象/对象接受WT胰岛的DH小鼠移植后胰岛素水平高于移植前约2倍，与接受DH胰岛DH小鼠的趋势相似。循环胰岛素的增加与在双杂合基因敲除小鼠中观察到的胰岛素抵抗的年龄依赖性增加相一致(7). 与WT对照组相比，DH小鼠的循环瘦素水平显著降低，这是因为双杂合子的脂肪质量减少[7.2±1.1（WT）vs.4.4±0.8（DH）ng/ml，P（P）< 0.05,n个= 7–9].
胰岛移植生长。
在受体体内8周后，胰岛移植物看起来完好无损且血管化良好（图。一和一). 在配有带有校准千分尺圆盘的目镜的解剖显微镜下，观察DH和DH中WT胰岛移植物的平均表面积对象/对象在对照组WT受体中，受体约为110，比移植物大81%（图。b条). 同样，DH受体的DH胰岛移植物的表面积比WT受体的类似移植物表面积大约170%（图。b条). DH和DH中WT胰岛移植物的厚度对象/对象在WT受体中，受体分别是WT胰岛移植物的1.9倍和1.8倍（图。c（c）)DH受体中DH胰岛移植物的平均厚度是对照受体中同类胰岛的2.9倍（图。c（c）). 因此，DH和对象/对象受者是WT受者移植物的4.9倍和4.3倍（图。d日)与WT受体相比，DH受体中放置DH胰岛时移植物体积增大≈8倍（图。d日).
DH和DH胰岛移植物的表面积、厚度和相对体积增加对象/对象收件人。(一)描述移植到WT的完整WT胰岛移植物的代表性图像(顶部)、DH(中部)、和对象/对象(底部)显示了小鼠（放大20倍）。白色的移植组织可以与周围的肾组织区分开来（深红色），浸润移植组织的血管（箭头所示）表明有血管形成。(b条)相对表面积：*，P（P）<0.0001，WT vs.DH，n个= 17–19; *,P（P）<0.0001，重量vs。对象/对象,n个= 6–19. (c（c）)厚度（以任意单位表示）：*，P（P）<0.0001，WT vs.DH，n个= 17–18; *,P（P）<0.01，重量vs。对象/对象,n个= 6–18. (d日)相对移植物体积：*，P（P）<0.0001，WT vs.DH，n个= 16–18; *,P（P）<0.0001，重量vs。对象/对象,n个= 5–18. 所有值均为平均值±SEM。
DH受体胰岛移植物的表面积、厚度和相对体积增加，WT受体减少。(一)完整DH胰岛移植物移植到DH的代表性图像(上部)和WT(下部)显示小鼠（放大25倍）。白色的移植组织可以与周围的肾组织区分开来（深红色），浸润移植组织的血管表明有血管形成。(b条)相对表面积：*，P（P）<0.01，WT vs.DH，n个= 5–6. (c（c）)厚度（以任意单位表示）：*，P（P）<0.01，WT vs.DH，n个= 4–5. (d日)相对移植物体积：*，P（P）<0.001，WT vs.DH，n个= 4–5. 所有值均为平均值±SEM。
移植期结束时，还通过定量形态计量学评估受体小鼠内源性胰腺中的β细胞质量。这表明DH和对象/对象小鼠与野生型对照组相比（2.67±0.4（WT）vs.6.67±1.7（DH）和9.58±1.4(对象/对象)毫克；P（P）<0.05 WT vs.DH或对象/对象,n个= 3–4).
β细胞有丝分裂和凋亡。
胰腺中的胰岛质量是通过β细胞增殖、β细胞凋亡和胰岛从胰腺导管组织新生之间的平衡来维持的(15–17). 通过溴脱氧尿苷（BrdUrd）标记评估移植胰岛的有丝分裂活性。移植到DH和DH的WT胰岛中BrdUrd-标记细胞核的百分比对象/对象与对照组相比，受试者分别增加了4.4倍和7.4倍（图。 一和b条). 胰岛素抵抗受体移植胰岛中有丝分裂指数的增加与宿主动物内源性胰岛中的增加相似（图。c（c）). 移植到DH受体的DH胰岛中的BrdUrd掺入量也增加，而移植到WT对照组的DH岛中的有丝分裂指数降低（图。).
移植到DH和DH的WT胰岛移植物中β细胞核BrdUrd标记增加对象/对象胰岛素抵抗小鼠的内源性胰腺。(一)WT胰岛移植物的横截面(左侧)、DH(右上)、和对象/对象(右下)按照以下描述对受体进行BrdUrd和混合抗体染色方法.BrdUrd阳性细胞核呈黑色（箭头所示），非β细胞呈棕黑色。显示了具有代表性的部分。(b条)胰岛移植物中β细胞的有丝分裂指数：*，P（P）<0.0001，WT vs.DH，n个= 12–13; *,P（P）<0.0001，WT与。对象/对象,n个= 6–13. 所有值均为平均值±SEM(c（c）)内源性胰腺β细胞有丝分裂指数：*，P（P）<0.05 WT vs.DH或对象/对象,n个= 3–4. 所有值均为平均值±SEM。
移植到WT小鼠的DH胰岛移植物中β细胞核的BrdUrd标记减少。(一)从DH分离的DH胰岛移植物的横截面(上部)和WT(下部)按照以下说明对宿主进行BrdUrd和混合抗体染色方法。显示了具有代表性的部分。(b条)胰岛移植物中β细胞的有丝分裂指数：*，P（P）<0.0001，WT vs.DH，n个= 5–6. 所有值均为平均值±SEM。
为了评估胰岛质量是否受到细胞死亡改变的影响，使用ApopTag试剂盒测量胰岛移植物中的细胞凋亡。与有丝分裂相比，WT或DH胰岛移植到WT和DH小鼠后显示出相似数量的凋亡细胞（WT胰岛17±2对20±3阳性细胞，DH胰岛27±3对23±3阳性；两者均为P（P）=无显著性，n个= 4). 这些数据表明，胰岛生长效应在很大程度上由β细胞有丝分裂的增加而不是β细胞死亡的改变介导。
讨论
胰岛素抵抗与代偿性高胰岛素反应有关。在大多数自然发生和基因工程的2型糖尿病啮齿类动物模型中，高胰岛素血症和胰岛增生之间存在着强烈的相关性。在本研究中，我们发现这种胰岛增生很可能是由于胰岛循环中存在促有丝分裂生长因子所致。因此，当将正常WT小鼠的胰岛移植到胰岛素抵抗DH或对象/对象与WT受体相比，小鼠的有丝分裂活性增加。因此，嫁接厚度和嫁接表面积显著增加，导致嫁接体积整体增加。这与胰岛素抵抗患者内源性胰岛中β细胞质量的增加平行。
尽管胰腺导管细胞可能是胰岛细胞的前体(16,17,24,25)，该因子似乎直接作用于β细胞，因为移植的胰岛中没有导管细胞。尽管成纤维细胞生长因子(26)和胰腺同源域转录因子PDX-1(27)它们与β细胞生长有关，可能参与β细胞的终末分化和成熟。然而，它们可能与胰岛素抵抗诱导的胰岛生长因子协同作用。该因子还通过增加β细胞有丝分裂而不是降低β细胞凋亡率来刺激生长。移植于肾包膜下的胰岛在胰岛素抵抗状态下增生，排除了神经信号的可能性。
循环因子的确切性质尚不清楚，但似乎在瘦肉型、遗传性胰岛素抵抗的DH小鼠和肥胖型胰岛素抵抗小鼠中都存在对象/对象鼠标。此外，尽管葡萄糖已被证明能刺激β细胞有丝分裂在体外和体内（参考文献中审查）。17,28、和29)在胰岛素抵抗状态下，葡萄糖似乎不是主要的有丝分裂原，因为在血糖正常的模型中，内源性和移植性胰岛的胰岛质量都会增加；即使在高血糖模型中，在出现可检测到的高血糖之前也观察到胰岛增生(7–10,13). 内源性胰岛和移植胰岛的有丝分裂活性在对象然而，与DH小鼠相比，这表明葡萄糖或肥胖可能提供额外的刺激作用，而不仅仅是由于胰岛素抵抗。
在循环生长因子中，GH和IGF-1受体都已在β细胞上被证明(30,31)已知IGF-1可促进DNA合成并防止β细胞凋亡（参考文献。17). 然而，血浆GH和IGF-1水平在IRS-1基因敲除组和对象/对象老鼠(32,33)均表现为胰岛增生。IGF-1的地方专制角色(34)不能排除在这些模型中。催乳素和胎盘催乳素可刺激β细胞增殖，并与妊娠期胰岛素抵抗有关(17)但它们似乎不太可能出现在目前的研究中，这些研究只在雄性小鼠身上进行。瘦素也被认为可以促进β细胞生长(35); 然而，这不可能是对象/对象小鼠，具有遗传性瘦素缺乏症(36)或在循环瘦素水平显著降低的DH小鼠中。
另一个有待回答的问题是，哪些组织是胰岛素抵抗相关β细胞生长因子的来源。在我们通过有条件地灭活胰岛素受体而产生肝脏特异性或肌肉特异性胰岛素抵抗的小鼠（LIRKO和MIRKO小鼠）中，我们发现肝胰岛素抵抗引起显著的胰岛增生，但对孤立的肌肉胰岛素抵抗无胰岛反应(23,37)提示胰岛生长因子可能来源于肝脏。另一种可能性是，β细胞生长因子本身就是胰岛素，因为胰岛素水平在大多数胰岛素抵抗状态下升高，包括LIRKO小鼠，但在MIRKO鼠中没有升高。最近的研究表明，胰岛素信号通路的所有成分都存在于β细胞中，并可能在胰岛生长和功能中发挥重要作用(38–41). 尽管IRS-1阴性小鼠出现胰岛增生(14)，IRS-2阴性小鼠在早期β细胞发育中存在缺陷(41). 仅β细胞胰岛素受体缺乏的小鼠（βIRKO）出生时胰岛大小正常，但在衰老小鼠中观察到的β细胞质量没有正常增加(39). 在初步实验中，与LIRKO小鼠杂交的βIRKO小鼠也未能证明对胰岛素抵抗的胰岛增生反应。‡还需要进一步研究以确定特定的β细胞生长因子以及胰岛素在介导或修改这一重要生物反馈机制中的潜在作用。该因子的鉴定可能在逆转1型糖尿病患者的β细胞丢失或刺激胰岛生长以移植到糖尿病患者体内方面具有巨大的治疗潜力。
致谢
我们感谢Ed Boschetti对最初移植实验的帮助，感谢Myra Lipes博士和Susan Bonner-Weir博士对移植分析的帮助，以及Shannon E.Curtis对动物群体维护的帮助。这项研究得到了哈佛医学院青少年糖尿病基金会胰岛移植中心（60-086-9293-2）、美国国立卫生研究院拨款DK-55545（给C.R.K）、乔斯林糖尿病内分泌学研究护理拨款P30 DK-36836（给C.R.K）和乔斯林高级显微镜核心的支持。R.N.K.获得了国家卫生研究院国家研究服务奖DK-09825-02的支持。
缩写
| IRS-1型 | 胰岛素受体底物-1 |
| DH公司 | 胰岛素受体/胰岛素受体底物-1双杂合 |
| 重量 | 野生型 |
脚注
‡Kulkarni，R.N.，Michael，M.D.，Curtis，S.E.，Magnuson，M.A.&Kahn，C.R.，内分泌学会，第82届年会，2000年6月21日至24日，加拿大多伦多。
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