慢性乙醇喂养增强大鼠肝脏再生过程中miR-21的诱导，同时抑制增殖

免疫组织化学。

肝脏组织在4%中性缓冲福尔马林中固定过夜，然后用70%乙醇固定，石蜡包埋并切片。根据制造商的说明，使用Vector Laboratories（加利福尼亚州伯林盖姆）的Vectastain ABC试剂盒，使用二氨基联苯胺（DAB）（ImmPact DAB过氧化物酶底物，Vector Laboratories）作为检测试剂，对切片进行BrdU免疫染色。第一抗体是大鼠抗BrdU（Accurate Chemical and Scientific，目录号OBT0030），第二抗体是绵羊抗大鼠（AbD Serotech，目录号AAR10B）。用Harris苏木精对载玻片进行复染。对于每个样本，选择三个随机字段，量化总肝细胞和BrdU阳性肝细胞，并计算每个样本标记细胞核的平均百分比。PHx后24小时，比较含乙醇饮食（EtOH）和碳水化合物对照饮食（CHO）大鼠的标记细胞核百分比，并通过Student’s吨-测试。

RNA分离。

按照制造商的建议，用TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA）从冷冻肝脏（50–100 mg）中分离出总RNA。RNA浓度通过ND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE）测定。对每个样本的相同总RNA分离物进行miRNA和mRNA表达分析。

miR-21表达分析。

根据制造商的建议，通过TaqMan RT-qPCR miRNA分析（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）测量miR-21的表达。简单地说，10 ng总RNA用于逆转录。对于定量聚合酶链反应（qPCR），每个反应使用1μl RT产物，并使用TaqMan通用PCR Master Mix，No AmpErase UNG（Applied Biosystems）。所有分析均在ABI Prism 7000序列检测系统（Applied Biosystems）上进行，一式三份。每个时间点使用四个生物复制品，miR-21表达归一化为大鼠小核仁RNA（snoRNA）表达。用ΔΔCt法测定相对表达，其中LLM中归一化miR-21表达(吨从同一只大鼠残体（PHx）组织中的正常miR-21表达中减去=0）。

基因表达分析。

在Thomas Jefferson核酸核心设施中使用Affymetrix基因芯片大鼠基因1.0 ST阵列（Affymetix，Santa Clara，CA）测定基因表达。简单地说，如上所述，使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒（Qiangen，Germantown，MD）进一步纯化6小时和24小时时间点的总RNA样品及其生物控制LLM样品（用于EtOH和CHO日粮），然后进行乙醇沉淀。RNA样品用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，加州圣克拉拉）进行分析，以确保标签和杂交前的质量。数据通过Affymetrix Expression Console（Affymotrix）进行RMA标准化。如果基因具有对数，则认为其表达高于背景₂至少一个样本中的归一化信号大于等于5。符合MIAME（微阵列实验的最低信息）的微阵列数据保存在GEO数据库中。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE33785”，“term_id”：“33785“，“extlink”：“1”}}GSE33785标准。

目标预测。

为TargetScan计算PHx（Δs）后条件和时间点之间的基因表达差异(25)（v5.1）-根据基因表达数据预测miR-21靶点，如结果. Δ₁，比较EtOH和CHO肝再生期间的变化：[（24 h PHx−24 h LLM）−（6 h PHx–6 h LLM。Δ₂，比较EtOH和CHO再生期间的变化：{[（EtOH24 h PHx−EtOH24h LLM）−（EtOH 6h PHx–EtOH6h LLM。miR-21的“潜在靶点”在EtOH肝脏中的表达显著降低（Δ₁)小于-0.2 log₂比率和Δ_{1（乙醇）}< Δ_1（CHO）小于-0.2 log₂比例。如果Δ_1（CHO）显著且小于-0.2 log₂比率。

基因集富集分析。

基因集富集分析（GSEA）(37)用于确定预测的miR-21靶点在所有基因排列列表中的分布，如附录AElmen等人的基因表达数据集(7)NCBI GEO中提供({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE13948”，“term_id”：“13948”，”extlink“：“1”}}GSE13948标准)用于验证GSEA(附录A和表A1). 错误发现率问报告了GSEA估算的值。A类问<0.05的值被认为是显著的。

功能注释。

miR-21潜在目标的功能注释术语来自DAVID（注释、可视化和集成发现数据库）功能注释工具(16,17). 潜在靶点按通用基因本体（GO）术语分组。为了进行比较，GO术语同样适用于我们分析中未被视为“潜在”目标的预测目标。

目标验证。

HEK293细胞在DMEM/F12培养基中生长，并在聚乙烯中镀膜-我-转染前一天，赖氨酸涂层24孔板。使用双报告子miTarget microRNA 3′非翻译区（3′UTR）表达克隆（pEZX-MT02，Genecopoeia，Rockville，MD），其萤火虫荧光素酶报告子基因与含有假定miR-21靶点的大鼠Crebl2 3′UTR-相连。质粒还含有雷尼利亚荧光素酶基因在单独的启动子控制下进行正常化转染效率。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen），在24孔板中用150 ng质粒和10 pmol pre-miR-21或pre-miR对照（Ambion，Foster City，CA）进行共转染。转染后18小时，将细胞分为三份重新放置在96个平板中，24小时后使用Luc-Pair荧光素酶检测试剂盒（Genecopoeia）在Synergy HT微孔板阅读器（Bio-Tek Instruments，Winooski，VT）上测定发光。萤火虫荧光素酶报告荧光标准化为雷尼利亚荧光素酶发光。实验分三次进行。

miR-21全球目标富集分析。

miRNA对基因表达的转录后调节可能有助于肝脏再生过程中基因表达变化的程序。虽然miRNAs可以通过翻译抑制来调节基因表达，但之前已经证明miRNA调节的作用可以在基因表达微阵列数据中发现(27). 我们利用我们小组汇编的基因组规模的基因表达数据来研究乙醇喂养和配对喂养对照动物肝脏再生过程中的基因表达变化（R.Vadigepalli，未发表的数据，GEO no。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE33785”，“term_id”：“33785“，“extlink”：“1”}}GSE33785标准). 在这两项研究中使用了相同的动物对和RNA制剂。为了评估miR-21增加对CHO和EtOH大鼠肝再生过程中基因表达变化的影响，我们通过对预测的miR-21靶向基因表达进行全局分析，采取了一种无偏见的方法。

我们的实验设计提供了比较两个Δs（miR-21水平不同的两种条件之间的基因表达差异）的优势，以确定具有与miR-21依赖性调节一致的表达谱的预测靶点。Δ₁是PHx后6到24小时miR-21表达的时间差异；Δ₂来源于EtOH肝脏与CHO对照肝脏miR-21反应之间的差异。对于Δ₁miR-21的表达变化与肝再生过程中miR-21靶点的表达呈负相关。因此，我们预计在PHx后6到24小时，miR-21靶基因的差异表达会减少。对于Δ₂在PHx后6至24小时的时间范围内，预计EtOH肝脏中miR-21靶蛋白表达的下降幅度大于CHO对照肝脏，这反映了在EtOH-肝脏的反应期内miR-21的增加更为明显。

为了确定miR-21的表达是否与肝再生过程中基因表达的改变相关，我们使用GSEA(37). GSEA计算在两种条件或表型之间排序的基因序列的底部或顶部的基因集的富集度。如果miR-21表达增加影响肝再生过程中的基因表达，我们预计在PHx后6小时差异表达高于PHx后24小时差异表达的基因中，miR-21靶点的富集，即PHx后6~24小时表达减少的基因将富集为miR-21预测靶点。为了验证GSEA研究miRNA对基因表达的影响，我们使用Elmen等人的体内miR-122抑制的基因表达数据集(7)（请参见附录A). 有趣的是，在这个控制数据集中测试的目标预测算法中，只有TargetScan预测给出了预期的浓缩结果（参见附录A).

TargetScan用于生成预测的miR-21靶基因列表。根据24小时PHx（PHx/LLM）与6小时PHx的差异表达比率（PHx-LLM）对肝脏中表达的所有基因的基因表达数据集进行排序，并在排序数据集上绘制miR-21预测靶基因列表。值得注意的是，在此时间范围内，CHO肝脏中没有miR-21预测靶点的富集，表明CHO动物肝再生过程中miR-21的适度增加不足以引起靶基因表达的减少，而靶基因表达在该时间段的基因表达变化背景下显著增加(图3A类).

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图3。

miR-21的基因集富集分析（GSEA）预测PHx后的靶点。在CHO中PHx后6至24小时，对差异表达的TargetScan靶向miR-21靶点进行GSEA(A类)和EtOH(B类).C类：三重日志₂EtOH与CHO在6至24小时差异表达的比率（Δ2）表明，在该时间段内，EtOH-肝脏中的预测靶点比CHO肝脏中的靶点减少更多。GSEA估算FDR问报告值；问<0.05被认为是显著的。D–F型：预测miR-21靶点的差异表达与非靶点差异表达的相应累积分布图。P（P）数值通过Kolmogorov-Smirnov试验确定。P（P）<0.05被认为是显著的。

然而，正如预期的miR-21依赖性基因表达调控一样，在EtOH肝再生过程中减少的基因中，miR-21预测的靶点显著富集(图3B类). 与未预测的靶点相比，miR-21预测的靶点PHx后6至24小时差异表达的累积分布显著向左移动，这进一步表明了这一点(图3E类). 比较两种饮食在肝再生过程中的差异表达，可以丰富预测目标(图3C类)与CHO肝脏相比，EtOH肝脏中表达减少的基因。如果靶点在PHx后24小时的差异表达高于CHO中6小时的差异表达的基因中富集，也可能导致这种结果。然而，如中所示图2A类CHO肝脏中的预测靶点分布均匀。这些结果表明，与CHO对照肝相比，EtOH肝再生过程中潜在的miR-21靶点受到更大的影响。

我们使用其他几种目标预测算法（包括DIANA-microT）的预测进行了上述相同的miR-21富集分析(20)、微宇宙(11),microRNA.org网站(2)和PicTar(21) (附录A和表A2). 不同miRNA目标预测算法的报告性能差异很大，经常显示不同算法预测的目标之间几乎没有重叠(34). 因此，我们分别测试了多个算法的组合预测和重叠预测。在CHO肝再生中，没有一种算法显示预测靶点的富集与miR-21表达呈负相关。然而，与我们的GSEA验证结果一样，只有TargetScan靶向靶向物在EtOH肝脏中有显著富集。因此，TargetScan预测集可以最好地识别我们系统中可能的miR-21目标。根据这些发现，对TargetScan的预测进行了所有进一步的靶点分析。

潜在miR-21靶点的生物学注释分析。

我们的靶向分析表明，在EtOH肝脏中，miR-21对PHx后基因表达的影响大于对照肝脏。为了确定在EtOH肝脏再生过程中miR-21可能调控的基因，我们使用了上述两个miR-21表达Δs。我们将那些靶向扫描靶向mRNA确定为潜在靶点，这些靶向mRNAs在EtOH肝脏PHx后6至24小时内减少（Δ_{1（乙醇）})在此期间，EtOH肝脏的下降幅度大于CHO肝脏（Δ₂) (附录B 表A3). 也具有负Δ的潜在目标子集_1（CHO）进一步确定为对照肝脏再生过程中miR-21的可能靶点。通过该分析确定的三个miR-21预测靶点Spry1、Spry2和Timp3之前已在其他系统中确定(10,33,39) (图4,附录B 表A3). 马奎兹及其同事确定了我们分析选择的第四个潜在靶点Peli1(29)作为miR-21在小鼠肝再生中的靶点(附录B 表A3). 所有四个基因之前都被证实为真正的miR-21体外靶点(10,29,33,39).

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图4。

通过负相关基因表达分析确定的潜在miR-21靶点的基因本体（GO）分组。已鉴定的基因具有与miR-21表达负相关的表达谱，因此是miR-21在乙醇喂养动物的肝脏再生中的候选靶点。条形图表示PHx后6和24小时与LLM的差异表达。所有条形图都在−1比1的对数上₂刻度，但以下情况除外：Chd7、Dusp8、Nfib、PDCD4为-2对数₂scale、Btg2和PPARα在−3.5到3.5 log之间₂规模*miR-21对CHO肝再生的潜在调控。§以前被证明是miR-21靶点的基因。†TargetScan预测Pten不是miR-21的靶点。

为了阐明EtOH肝脏PHx后miR-21基因表达调控的功能影响，我们使用DAVID功能注释工具研究了潜在靶点集合的功能(16,17) (图4). 在再生EtOH肝脏的24个潜在靶点中，确定了4个主要功能群，包括15个。其中，转录调控是最大的功能分组，将更具体的标识符“转录因子活性”分组。其他功能分组包括RNA剪接、端粒维持和MAP激酶活性负调控。其余9个未按功能注释分组的预测靶点包括参与核质转运、基质金属蛋白酶抑制、NF-κB活化、泛素结合和氘化的基因。被确定为CHO肝再生可能靶点的基因子集分布在功能注释术语中(图4，*）和未分组基因(附录B 表A3).

我们还研究了TargetScan靶向miR-21的功能，我们的分析未将其确定为miR-21在肝再生中的潜在靶点。其中一些预测靶点之前已被证实为miR-21靶点(图4、§）等在其他情况下可能是miR-21靶点。我们将其称为“无响应目标”图4这些基因的分类与我们的标准确定的潜在miR-21靶点类似（数据未显示）。有趣的是，在非反应性靶基因集中，有几个基因被归类为细胞增殖的负调控因子，尽管这种功能注释没有被指定给任何反应性靶。根据这项分析的结果，miR-21可能会影响乙醇处理的肝脏再生过程中的许多过程，但其功能可能不会像在癌症中那样对增殖产生积极影响(22).