国家生物技术。作者手稿；PMC 2013年2月1日提供。
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多能干细胞衍生的人血脑屏障内皮细胞
,1,* ,1,* ,1 ,2 ,1 ,1 ,1和1
伊桑·S·利普曼
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
萨米拉·阿扎林
1威斯康星大学麦迪逊分校化学与生物工程系，美国威斯康星州麦迪逊53706
詹妮弗·凯
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
兰迪·纳斯勒
2美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学中央显微镜研究中心，IA 52242
汉娜·威尔逊
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
亚伯拉罕·艾哈迈德
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
肖恩·帕莱切克
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
埃里克·V·舒斯塔
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
1美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学化学与生物工程系，邮编：53706
2美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学中央显微镜研究中心，IA 52242
收件人：Eric V.Shusta，威斯康星大学麦迪逊分校化学与生物工程系，威斯康辛大学麦迪森工程大道1415号，邮编：53706，ude.csiw.rgne@atsuhs，电话：（608）265-5103，传真：（609）262-5434；肖恩·帕莱切克（Sean P.Palecek），威斯康星大学麦迪逊分校化学与生物工程系，威斯康星州麦迪逊工程大道1415号，邮编53706，ude.csiw.rgne@kecelap，电话：（608）262-8931，传真：（609）262-5434 *这些作者对这项工作贡献均等。
- 补充资料
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GUID:1B2F373C-D319-466D-A120-24B7A6B1757A
摘要
血脑屏障（BBB）在大脑健康中起着重要作用，并且在疾病中经常受损。此外，由于其显著的屏障特性，这种内皮界面限制了神经治疗的吸收。因此，一种可再生的人血脑屏障内皮细胞来源可能被证明有助于大脑研究和药物开发。在此，我们证明，从人类多能干细胞（hPSCs）生成的内皮细胞可以被指定具有许多BBB属性，包括组织良好的紧密连接、营养转运蛋白的表达和极化流出转运蛋白活性。重要的是，hPSC衍生的BBB内皮细胞对星形细胞信号作出反应，通过内皮电阻（1450±140Ωxcm）测量，产生令人印象深刻的屏障特性2)分子渗透率与体内大脑摄取。此外，hPSC衍生的血脑屏障内皮细胞的特异性与通过Wnt/β-catenin信号传导的神经细胞共分化同时发生，这与先前的转基因研究一致。这项研究是第一例从hPSCs中分化出器官特异性内皮细胞。
简介
血脑屏障（BBB）由专门的脑微血管内皮细胞（BMEC）组成，帮助调节物质进出大脑。复杂的细胞间紧密连接限制了分子向大脑的被动扩散，导致血管表现出极高的跨内皮电阻（TEER）体内1此外，外排转运蛋白（如p-糖蛋白）通过将能够扩散到BMEC的小亲脂性分子返回到血液中来促进屏障特性。因此，BMEC被赋予了一个必要的特定运输系统网络，以将必需的营养素和代谢物输送到BBB。此外，由于其实质性屏障特性，BBB通过阻止大多数小分子药物和基本上所有生物制剂的摄入，严重阻碍了神经药理学的发展2相反，血脑屏障的破坏和功能障碍与多种神经疾病有关，包括阿尔茨海默病、中风、多发性硬化症和脑肿瘤三这些问题共同导致研究人员开发了各种BBB模型，以进行详细的机理研究和药物筛选在体外。
大多数在体外利用从牛、猪、大鼠和小鼠等主要动物来源分离的脑微血管建立了BBB模型4然而，由于不可避免的物种差异5,6，一个健壮的在体外人类起源的BBB模型在进行脑穿透分子的高通量筛选或研究人类BBB的发育、调节和疾病途径方面具有很高的实用性。以前，人类血脑屏障模型是通过培养从尸检组织中分离出来的原始人类BMEC建立的，或者更常见的是，培养来自肿瘤或癫痫患者的新鲜切除脑标本。因此，涉及BMEC可用性和保真度的问题限制了这些人体BBB模型的普遍使用7另一个被提议的人类BBB模型的途径是细胞永生8然而，永生化BMEC的屏障性能较差，包括低基线TEER8-10和不连续紧密连接蛋白表达8因此，为了创建一个健壮、可伸缩的人类BBB模型，我们试图利用在体外人类多能干细胞（hPSCs）的发育潜力。hPSCs，包括人类胚胎干细胞（hESCs）11和诱导多能干细胞（iPSCs）12,13显示出几乎无限的自我更新能力和从所有三个胚胎胚层分化为体细胞类型的能力。而人类内皮细胞（EC）是通过多种方法从hPSC中生成的，包括胚胎体分化14-18与OP9基质细胞共培养19,20已知内皮细胞在器官发生过程中根据微环境线索形成不同的基因和蛋白质表达谱21以及具有特定组织特性的hPSC衍生内皮细胞尚未报告。在这里，我们报道了一种简便的hPSC分化方法，能够重复生成具有BBB特性的纯内皮细胞群。
结果
hPSCs向BBB内皮细胞分化的策略
体内BBB规范始于形成神经周血管丛的内皮细胞侵入由神经上皮细胞、放射状胶质细胞、成神经细胞和神经元组成的胚胎脑微环境，尤其是这种早期BBB诱导大多发生在缺乏星形胶质细胞的情况下22-25发育中的胚胎大脑的细胞提供相关的血脑屏障诱导线索，如Wnt7a和Wnt7b，通过经典的Wnt/β-catenin途径发出信号，帮助促进内皮细胞的血脑屏障规范26,27因此，我们假设同时将hPSC分化为神经和内皮血统的策略可能导致hPSC衍生的内皮细胞具有BBB属性。最近的研究表明，神经细胞和内皮细胞都可以通过贴壁培养中的定向分化从多能干细胞中生成28-30因此，我们开发了一种定制的二维hPSC分化策略，促进神经和内皮共同分化，本质上提供了一个胚胎脑样微环境在体外该策略最初使用IMR90-4 iPSC线路实施13随后用多个iPSC和hESC细胞系验证了协议的稳健性(). 简言之，IMR90-4 iPSC在规定的mTeSR1培养基中在Matrigel涂层板上扩增2-3天(). 为了启动神经和内皮的共分化，将集落置于无条件培养基（UM）中3-4天，此时大量表达巢蛋白的细胞([panel i]，绿色），一种在未成熟神经祖细胞和βIII微管蛋白中表达的标记([panel i]，red）是一种神经元标记物。在IMR90-4 iPSC分化过程中，86%的细胞群体可被归类为潜在的神经祖细胞（23%巢蛋白+/βIII微管蛋白−)，未成熟神经元（58%巢蛋白+/βIII微管蛋白+)或神经元（5%巢蛋白−/βIII微管蛋白+)代表了一个大致类似胚胎脑的微环境(). 在H9 hESC分化过程中观察到类似的分布(补充图1a). 在这个庞大的未成熟神经群体中，很小的细胞簇开始形成内皮形态和PECAM-1表达，但缺乏典型的BBB紧密连接([面板i]和).
hPSCs与BMEC的分化（a） BMEC分化方案示意图。将hPSC接种在mTeSR1培养基中的Matrigel上2-3天，以便粘附和细胞扩张，然后在无条件培养基中培养5-7天，直到观察到具有特征性内皮细胞（EC）形态的大菌落。在继代培养到胶原蛋白/纤维连接蛋白基质上之前，添加规定的EC培养基2-6天有助于EC扩增，以便进一步扩增和纯化。列出了本研究中使用的iPSC和hPSC线及其描述。UM=无条件培养基，EC=内皮细胞培养基。（b） IMR90-4 iPSCs在UM中分化4天（第一组）和6天（第二组）后，检测βIII微管蛋白（红色）和巢蛋白（绿色）的表达。比例尺指示50μm。（c） IMR90-4衍生βIII微管蛋白的流式细胞术分布+和nestin+UM处理第4天和第6天的细胞。红点表示βIII微管蛋白+/巢穴+细胞，蓝色圆点表示βIII微管蛋白+/巢穴−细胞，绿色圆点表示βIII微管蛋白−/巢穴+细胞和黑点表示βIII微管蛋白−/巢穴−细胞。这些数据代表了两个生物复制。（d） IMR90-4 iPSC在UM中3天后的相位对比图像（图i）和在UM中6天后在EC培养基中额外3天后的相位对比图像（图ii）。图i中的圆圈表示一个具有平坦鹅卵石EC形态的小区域，是用图1e中的抗体探测的区域类型。这种形态在第二组中广泛存在，与图1f和图1f中免疫标记识别的区域相对应补充图3.比例尺指示200μm。（e） IMR90-4 iPSCs培养4天UM产生PECAM-1+不表达紧密连接蛋白claudin-5的细胞（第一组）（第二组）。比例尺指示50μm。（f） UM处理5-7天后，IMR90-4衍生的EC现在共表达PECAM-1（图i，红色）和claudin-5（图ii，绿色，同一区域）。在这些EC菌落中，还观察到特征性BBB标记物闭塞素（第三组）、p-糖蛋白（第四组）和GLUT-1（第五组）的表达。所有比例尺指示50μm。（g） 流式细胞仪点图显示PECAM-1的时间演变+/GLUT-1型+分化IMR90-4 iPSCs或H9 hESCs内的人群。绿点表示PECAM-1−/GLUT-1型−细胞，蓝色圆点表示PECAM-1+/GLUT-1型−单元格和红点表示PECAM-1+/GLUT-1型+细胞。完整的定量结果见。
在UM治疗的第6天，IMR90-4衍生的巢蛋白显著增加−/βIII微管蛋白+神经元存在（26%），而巢蛋白+/βIII微管蛋白+人口减少到29%([第二组]和). 相比之下，只有小簇细胞表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP；星形胶质细胞标记物）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；潜在周细胞/平滑肌标记物），约为每10个细胞中30-50个细胞6可以通过免疫细胞化学鉴定(补充图2)表明这些细胞不太可能在BBB规范中发挥主要作用。在UM治疗5-7天时，与成熟的神经人群相一致，内皮区变得更大、更普遍，并且BBB葡萄糖转运蛋白GLUT-1、紧密连接蛋白cloudin和claudin-5以及p-糖蛋白在内皮人群中共同表达(). 虽然已知外周内皮细胞表达一个或多个这些标记物，但这组复合标记物对脑内皮细胞的限制性很强31因此，表达紧密连接蛋白、p-糖蛋白和高水平GLUT-1的内皮细胞将被称为hPSC衍生的脑微血管内皮细胞（hPSC派生的BMEC），进一步的血管和BBB验证将在和。
胶原/纤维粘连蛋白基质上iPSC-derived BMEC的纯化（a） RT-PCR产物的凝胶电泳用于编码PECAM-1、VE-cadherin和von Willebrand Factor（vWF）的转录物，以区分IMR90-4 iPSCs，这些转录物在UM中分化3天（第1道），在UM内分化6天，在EC培养基中分化2天（第2道），或在胶原蛋白/纤维连接蛋白基质上继代培养2天后（第3道）。（b） 胶原/纤维连接蛋白基质上IMR90-4衍生BMEC的相位对比图。比例尺显示100μm。（c） IMR90-4衍生的BMEC能够摄取荧光乙酰化LDL（比例尺表示50μm）。（d） 流式细胞术显示继代培养后IMR90-4衍生的BMEC的纯度。在流式细胞术直方图中，将ZO-1和PECAM-1的表达与适当的兔IgG对照进行比较，并将闭塞素、克劳丁-5和p-糖蛋白的表达与相应的小鼠IgG控制进行比较。（e） 特征EC和BBB标记通过纯化的IMR90-4-衍生BMEC表达。IMR90-4衍生的BMEC表达PECAM-1（面板i；红色）、克劳丁-5（面板i：绿色）、vWF（面板ii：红色）、闭塞素（面板ii；绿色）、GLUT-1（面板iii）、p-糖蛋白（面板iv）、ZO-1（面板v）和VE-cadherin（面板vi）。DAPI核染色（蓝色）覆盖在面板i和面板ii中。比例尺指示50μm。（f） 在40 ng/mL VEGF的存在下，将纯化的IMR90-4-衍生BMEC接种到Matrigel上，可形成血管管（比例尺显示100μm）。在缺乏VEGF的情况下，细胞不会形成管。（g） 完全分化前的继代培养导致BBB表型缺陷。仅在UM治疗4天后，在胶原/纤维连接蛋白基质上纯化的分化IMR90-4培养物不会生长到汇合处，并且很容易观察到克劳丁-5表达异常或不连续的区域（绿色）。显示了带DAPI的Co-label（蓝色）。箭头突出显示连续的子句-5表达式，而箭头表示有缺陷的子句-5。比例尺指示50μm。
纯化iPSC衍生BMEC的功能屏障特性和BBB特性（a） 两室血脑屏障模型示意图。将iPSC衍生的BMEC接种到涂有胶原蛋白/纤维连接蛋白的Transwell过滤器上，并与大鼠星形胶质细胞共同培养，以检测BBB特性的诱导。顶端（血液侧）和基底外侧（大脑侧）室是关于转运测定来表示的。（b） iPSC衍生的BMEC对星形胶质细胞的可溶性线索作出反应。IMR90-4-衍生的BMEC单独培养（单培养）或与大鼠星形胶质细胞或人类胚胎肾（HEK）细胞共培养96小时，并监测跨上皮电阻（TEER）。误差条表示三重过滤器的标准偏差。与HEK共培养相比，星形胶质细胞共培养在10个以上的生物复制中观察到了优先的TEER反应。请参见根据优化培养基和播种密度的试验得出的TEER值。（c） 与大鼠星形胶质细胞共培养24小时后，对IMR90-4衍生的BMEC进行冷冻断裂电镜观察。“P”表示原生质面（P-face），“E”表示胞外质面（E-face）。红色箭头表示E面凹槽中基本上没有紧密连接颗粒，蓝色箭头突出显示E面中罕见的紧密连接颗粒；黄色箭头表示与P面相关的紧密连接粒子的复杂网络。比例尺指示0.2μm。（d） RT-PCR检测与大鼠星形胶质细胞共同培养的IMR90-4-衍生BMEC中代表性血脑屏障转录表达。LDLR、LRP1、INSR、LEPR、BCAM、TFRC、AGER、STRA6、SLC7A5、SLC1A1、SLC38A5、SLC16A1、SLC2A1、ABCB1、ABCG2、ABCC1、ABCC2、ABCC和ABCC5.PLVAP公司和SLC21A14型未检测到转录本。单培养IMR90-4-衍生的BMEC具有类似的转录谱，除了轻轨P1和ABCC5公司不存在，需要与HEK293细胞或星形胶质细胞共同培养才能诱导。（e） IMR90-4导出的BMEC渗透系数之间的相关性（Pe（电子），x轴）和啮齿动物体内传递系数（K在里面，y轴）。P（P）e（电子）值（cm/min）是使用材料和方法一节中描述的三重过滤器从通量实验中计算得出的。所示为在至少三次此类实验中测得的每种化合物的平均±S.D.值。为了积累这些数据，我们组装了五个单独的共培养模型（独立于未分化的iPSC），并一次测量了3-6种化合物。蔗糖Pe（电子）从外排转运体抑制试验对照中也获得了数值。因此，该图准确地描述了Pe（电子）在完全独立的实验中进行测量。秋水仙碱是唯一一种在生物复制中具有较大变异性的化合物（参见补充表1对于数值）。K（K）在里面值（μL s−1克−1)从绘图中提取就地佩里埃报告的啮齿动物脑灌注数据等49（f）IMR90-4-衍生BMEC中外排转运体的功能表达。罗丹明123或[14C] 在存在和不存在环孢菌素A、Ko143或MK 571的情况下，对单培养IMR90-4-衍生BMEC中的-阿霉素进行测量（面板i）。在存在和不存在环孢菌素A、Ko143或MK 571的两室星形胶质细胞共培养模型中，测量罗丹明123或阿霉素从顶腔到基底外侧腔的转运（第二组）。对于所有地块，车道1=控制，车道2=环孢菌素A添加，车道3=Ko143添加，车道4=MK 571添加。误差条表示根据一式三份的井或过滤器计算的标准偏差。数据代表每个抑制试验的两个生物复制品。通过Student的非配对t检验计算统计显著性；***，p<0.01；**，p<0.05；*，p<0.1。
用流式细胞术定量hPSC衍生的BMEC的数量。在本分析中，BMEC被定义为具有PECAM-1表达和GLUT-1表达升高的细胞，而在分化的前四天，细胞表现出低基础GLUT-1的表达（GLUT-1+/PECAM-1型+，有关浇口的详细信息，请参见材料和方法）。对于IMR90-4衍生的BMEC，在UM治疗的第6天，该人群约占培养物的30%(和). 因此，在UM治疗的第6天，神经和内皮细胞总数约占总分化培养的95%。hPSC衍生的BMEC群体在定制的EC培养基中进一步扩增2天，该培养基包括已知的促进初级BMEC生长的因素，具有一定的选择性（碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血小板缺乏血浆衍生的血清32)和GLUT-1的百分比+/PECAM1公司+分化IMR90-4培养物中的细胞增加到66%([第二组]，6D UM 2D EC，以及). BMEC分化过程平均产生11.6 PECAM-1+/GLUT-1型+在UM培养基中培养6天后和在EC培养基中2天后，每个输入hPSC的细胞数，表明EC祖细胞和/或EC在分化过程中增殖。此时，所有GLUT-1+/PECAM1公司+细胞共同表达必需的BBB标记(补充图3). 此外，在EC培养基中，hPSC衍生的BMEC表现出BBB属性的相应增加，GLUT-1蛋白的表达显著增加(). 相反，如果培养物在UM（8天UM）而不是EC培养基中再培养两天，IMR90-4-衍生BMEC的百分比增加的幅度较小，尽管总PECAM-1+人口增长到类似水平(和)揭示了EC培养基处理对选择性BMEC扩增和将BBB表型授予EC群体的重要性。对于额外的iPSC也观察到类似的结果33和hESC11测试的线路()，具有细胞系依赖的BMEC分化效率(补充图4-6和). 对于H9 hESC系，需要延长培养时间（7天UM，6天EC培养基）以将BMEC产量从16%提高到35%(和). 因此，一般来说，在UM中对hPSCs进行2-7天的二维分化和扩增，然后在EC培养基中进行2-6天的扩增，可以产生大量高度富集的hPSC衍生BMEC。
表1
hPSC衍生BMEC分化的定量评估
| IMR90-4细胞系 |
|---|
|
|---|
| 分化时间一 | %GLUT-1型+/PECAM-1型+ | %PECAM-1型+总体的 | 每个细胞的平均表达
GLUT-1的b条（阿拉伯联合酋长国） |
|---|
| 4D UM | 0 | 5 | 不适用 |
| 6D米 | 30 | 36 | 99 |
| 6D UM 1D电子商务 | 36 | 42 | 221 |
| 6D UM二维EC | 66 | 68 | 300 |
6D UM二维EC
（+10μM XAV-939） | 46 | 61 | 272 |
6D UM二维EC
（+DMSO控制） | 64 | 68 | 285 |
| 8D米 | 39 | 61 | 263 |
| 现金流c（c） | 100 | 100 | 553 |
|
| DF19-9-11T细胞系 |
|
| 分化时间一 | %GLUT-1型+/PECAM-1型+ | %PECAM-1型+总体的 | 每个细胞的平均表达
GLUT-1的b条（阿拉伯联合酋长国） |
|
| 6D UM二维EC | 75 | 75 | 70 |
| 现金流c（c） | 100 | 100 | 76 |
|
| H9细胞系 |
|
| 分化时间一 | %GLUT-1型+/PECAM-1型+ | %PECAM-1型+总体的 | 每个细胞的平均表达
GLUT-1的b条（阿拉伯联合酋长国） |
|
| 6D UM二维EC | 16 | 41 | 110 |
| 7D UM 6D EC系列 | 35 | 63 | 109 |
Wnt/β-catenin信号通路参与hPSC衍生的BMEC规范
老鼠体内和在体外研究表明，典型的Wnt/β-catenin信号传导对于脑血管生成的开始和BBB特性（如GLUT-1）的获得是必要的26,27和claudin-5表达34典型Wnt配体Wnt7a和Wnt7b在BBB发育中有明确的作用体内并由神经祖细胞表达26,27因此，我们分析了WNT7A型和WNT7B型在神经前体/神经元群体中的表达，并监测发育中的hPSC衍生BMEC群体中β-catenin的时间核定位。几乎所有巢穴+细胞和βIII微管蛋白+细胞（即在)表达WNT7A型和WNT7B型UM治疗第4天的成绩单(,补充图1b-j、和补充图7a). 而PECAM-1中的连接β-catenin+内皮细胞广泛分布，此时核β-连环蛋白稀疏（PECAM-1的7±4%+EC；[面板i]）。在UM处理的第6天，当大部分培养物采用BMEC表型时，大多数巢蛋白+和βIII微管蛋白+细胞保持表达WNT7A、，除了一些双能βIII微管蛋白+单元格(补充图7b-e)，而WNT7B型不再检测到转录本。PECAM-1的百分比+UM治疗5天后，表现出可检测核β-连环蛋白的内皮细胞显著增加至40±6%([面板i]）和几乎所有PECAM-1+经UM处理6天和EC处理2天后，EC（90±6%）具有核β-连环蛋白([小组iii]和补充图8对于其他hPSC线路）。值得注意的是，GLUT-1的表达升高几乎只在含有核β-连环蛋白的细胞中检测到([第二组]），这与体内内皮特异性β-catenin敲除突变体中BBB-GLUT-1缺失的报道26和GLUT-1在血管丛中的下调WNT7A/7B型双敲除突变体27。
hPSCs的BBB规范中Wnt/β-catenin信号的参与（a） 组合荧光就地UM处理第4天IMR90-4培养物的杂交/免疫细胞化学显示巢蛋白+（红色；面板i和v）和βIII微管蛋白+（红色；面板iii和vii）细胞表达WNT7A型（绿色；面板ii和iv）和WNT7B型（绿色；面板vi和viii）。WNT7A型/7亿用DAPI核染色（蓝色）覆盖。面板一和面板二、面板三和面板四、面板五和面板六、面板七和面板八是同一个字段。比例尺指示50μm。（b） 细胞核β-连环蛋白的定位随着分化时间的延长而增加。核β-连环蛋白（绿色）在IMR90-4-衍生PECAM-1中很少观察到+UM处理4天后（红色）EC簇（第i组）。箭头表示核β-catenin。UM治疗5天后，核β-连环蛋白定位（绿色）增加（第二组），GLUT-1升高（红色）仅在同样含有核β-连蛋白的细胞中观察到。经过6天UM和2天EC培养基处理（第三组）后，核β-连环蛋白（绿色）与大多数PECAM-1共存+单元格（红色）。面板i和面板ii中的比例尺表示50μm，面板iii中的比例尺表示100μm。（c） 定量RT-PCR比较IMR90-4多能干细胞分化过程中折叠差异基因的表达，表明Wnt-活化基因的表达与观察到的BBB分化时间进程存在时间相关性。暗条比较了用UM处理3天和7天的IMR90-4细胞。正的倍数差异表示UM治疗7天时基因上调。白色条表示用含SFRP2的UM处理IMR90-4细胞7天。负倍差异表示与仅用UM处理的细胞相比，用含有SFRP2的UM处理过的细胞中的基因转录下调。灰色条表示从UM处理第2天到第7天用XAV-939处理的IMR90-4细胞与用DMSO载体对照处理的细胞相比较。FZD4、FZD7、和APCDD1公司在抑制剂存在的情况下未检测其表达。误差条表示根据三份样品计算的标准偏差。数据代表两个生物复制品。使用Student的非配对t检验进行统计分析；*，p<0.05；**，p<0.005。（d） 在UM治疗的第2天开始添加XAV-939或DMSO载体对照物后，在UM和EC培养基治疗的第6天和第2天对IMR90-4细胞进行流式细胞术分析。用二甲基亚砜处理的细胞显示出与未处理细胞相似的分布（64%PECAM-1+/GLUT-1型+和68%PECAM-1+整体；). 用XAV-939处理的细胞显示总体PECAM-1略有减少+标记（总数61%）和PECAM-1数量显著减少+/GLUT-1型+细胞（总数46%）(). 红点表示PECAM-1+/GLUT-1型+细胞，蓝色圆点表示PECAM-1+/GLUT-1型−单元格和绿点表示PECAM-1−/GLUT-1型−细胞。结果代表了三个生物复制。
鉴于所有受试细胞系在BMEC分化过程中均显示出核β-连环蛋白定位，通过评估IMR90-4分化过程中Wnt受体和靶基因的转录表达，也可以评估与Wnt介导过程的联系(). 含有约30%PECAM-1的后期（7D UM）培养物中的基因表达水平+/GLUT-1型+对BMEC和缺乏这些细胞的早期（3D-UM）培养物进行比较。正如预期的那样，表明BMEC分化的转录本，澳大利亚广播公司1（p-糖蛋白）和SLC2A1型（GLUT-1），在此期间上调(). Wnt受体Frizzled 4(FZD4型)和Frizzled6(FZD6型)与视网膜血管生成有关35-37和大脑内皮细胞26，使用FZD6型与肺和肝内皮细胞相比，成人脑内皮细胞中的转录物高表达26.Frizzled4和Frizzed6的转录本随着IMR90-4衍生的GLUT-1的出现而上调+/PECAM1公司+不同文化中的BMEC，而FZD7型编码Wnt受体Frizzled7的基因，该受体与脑内皮分化没有已知联系26,27在同一时间段内被下调。β-连环蛋白相关转录因子的基因产物LEF1级和Wnt-下游基因FST公司（卵泡抑素编码）在此期间也上调。此外STRA6系列编码BBB驻留维生素a转运体的基因38已被确定为Wnt靶基因39与肺和肝内皮细胞相比，成人脑内皮细胞中富含26在BBB分化过程中上调。APCDD1公司已发现，与肺和肝EC相比，成人脑EC中高浓度26最近被证明是Wnt信号的拮抗剂40，在分析过程中保持不变，可能表明APCDD1公司通过Wnt通路调节而非BBB发育在成人BBB维持中的作用。Wnt信号抑制剂分泌的卷曲受体蛋白2（SFRP2）或XAV-939治疗导致LEF1、FST、STRA6、FZD6、SLC2A1、和澳大利亚广播公司1()，进一步支持Wnt信号在调控这些转录物中的参与。此外，用XAV-939处理的分化IMR90-4培养物显示GLUT-1降低+细胞从64%到46%(和). XAV-939治疗也导致PECAM-1的总百分比略有下降+细胞（68%至61%），从而使PECAM-1的总百分比净减少19%+成为PECAM-1的EC+/GLUT-1型+BMEC。有趣的是，即使在GLUT-1中，XAV-939的存在也不会改变克劳丁-5或闭塞蛋白的定位−EC和western印迹显示，无论XAV-939处理如何，在分化培养物中都有等量的claudin-5和occludin（数据未显示）。这些数据与内皮特异性β-catenin敲除小鼠突变体的观察结果相比较，后者的脑血管畸形缺乏GLUT-1表达，但仍具有紧密连接26因此，虽然BMEC规范的某些方面似乎受到Wnt-β-catenin途径的影响（例如，GLUT-1表达升高），但该途径可能并不完全负责BMEC规范41-43。
hPSC衍生BMEC的纯化
尽管二维共分化策略产生了大量hPSC衍生的BMEC，如紧密连接蛋白、p-糖蛋白和升高的GLUT-1的表达所定义的，但许多特征性BBB属性，包括屏障形成和转运活性，在纯化的融合单层中得到最好的评估。此外，RT-PCR分析表明，IMR90-4衍生的BMEC在表达PECAM1公司在UM治疗早期，编码血管性血友病因子（vWF）和VE-cadherin的内皮转录物缺乏表达(). 在EC培养基处理期间，检测到VE-cadherin的表达()与之前从干细胞EC分化过程中观察到的PECAM-1和VE-cadherin内皮基因的顺序表达一致44因此，为了促进进一步成熟和促进纯化，将IMR90-4-衍生的BMEC从Matrigel传代到涂有胶原蛋白/纤维连接蛋白细胞外基质的平板上，通常用于原代BMEC培养32在EC培养基中，细胞在1-2天后生长融合，接触受到抑制，呈现出特征性EC形态()并且能够摄取乙酰化低密度脂蛋白(). 通过流式细胞术和免疫细胞化学判断，纯化培养物中约100%的细胞表达PECAM-1和必要的BBB标记()，表明使用这种基于细胞外基质的选择性传代方法可以有效且方便地进行纯化。重要的是，细胞在继代培养过程中也获得了vWF和VE-cadherin的表达，表明EC成熟()血管内皮生长因子（VEGF）存在下管状结构的形成进一步证实了这些BMEC的血管特性(). 在传代到纤维连接蛋白/胶原基质上之前，在UM和EC培养基处理期间实现的BBB成熟程度对于获得这种纯融合的BMEC单层至关重要。例如，当IMR90-4-衍生的BMEC在UM处理4天后进行继代培养时，表达BBB标记的细胞仍在发育，但没有达到融合，并且在许多区域显示畸形和不连续的紧密连接(). BBB分化的缺乏与观察到的UM治疗的这个阶段可以发现最小的β-连环蛋白核定位密切相关([面板i]）和无PECAM-1+/克劳丁-5+细胞存在(). 当将DF19-9-11T衍生的BMEC传代到胶原/纤维粘连蛋白基质上时，也发现了类似的纯化结果(补充图9和)，而DF-6-9-9T衍生的BMEC(补充图10)也可以被纯化，尽管它们显示出一些不连续的连接(补充图10c). H9衍生的BMEC不能从非脑PECAM-1的大百分比中纯化出来+/GLUT-1型−通过胶原/纤连蛋白方案的内皮细胞给出了内皮细胞对胶原/纤连蛋白基质的一般亲和力。因此，IMR90-4和DF19-9-11T系用于如下所述的深度血脑屏障表型测试。
iPSC-derived BMEC的BBB表型
除了BBB标记物表达和血管表型外，iPSC-derived BMEC还应响应星形胶质细胞提示，表现出紧密屏障特性，并表达功能运输系统。BBB的一个特征是高跨内皮电阻（TEER），这是相邻BMEC之间紧密连接蛋白相互作用的结果。为了测量BMEC单层的TEER，将IMR90-4-衍生的BMEC接种到涂有胶原蛋白/纤维连接蛋白基质的Transwell过滤器上，并在EC培养基中生长汇合，以创建标准的二室BBB模型(). 对ZO-1、闭塞素和克劳丁-5的免疫荧光检测表明滤膜表面的BMEC之间保持了连续的细胞-细胞接触，类似于在纤维连接蛋白/胶原蛋白涂层的聚苯乙烯培养皿上观察到的紧密连接(补充图11). 汇合处的初始TEER测量值为150-175Ωxcm2，表明内皮单层收缩(，时间0h）。在EC培养基中与原代大鼠星形胶质细胞或非神经人类胚胎肾（HEK）293细胞共培养后，将TEER测量值与单培养IMR90-4-衍生的BMEC进行比较。24小时后，星形胶质细胞共培养中的TEER（412±38Ωxcm2)几乎是两种HEK细胞共培养中观察到的两倍（236±23Ωxcm2)和BMEC单培养（222±51Ωxcm2)并持续升高至96小时，表明BMEC对星形胶质细胞信号的特异反应(和). 如果在含有10%FBS的培养基中进行星形胶质细胞共培养，IMR90-4衍生单层的TEER达到696±8Ωxcm224小时后，HEK细胞共培养中的TEER再次显著低于364±53Ωxcm2(). 优化播种密度以生成更均匀的单层，获得IMR90-4衍生的BMEC，最大TEER为1450±140Ωxcm2星形胶质细胞共培养(). DF19-9-11T衍生BMEC的最大TEER为777±112Ωxcm2星形胶质细胞共培养期间(). iPSC-derived BMEC单层通常在共培养24-48小时之间表现出最大TEER，并在8天内保持较高的TEER水平(补充图12). 就稳健性而言，不同通道数的iPSC在700-1450Ωxcm范围内始终产生TEER2在30次单独实验过程中，平均值为860±260Ωxcm2为了进行比较，从新鲜活检获得的原发性人类BMEC的最高TEER值之一是339±107Ωxcm2（参考。45)永生化人BMEC细胞系hCMEC/D3的最大TEER为199±5Ωxcm2对氢化可的松的反应9而外周内皮细胞在2-30Ωxcm处呈现TEER2范围。
表2
| 共培养细胞 | 共培养基一 | 最大TEER（Ωxcm2)b条 |
|---|
| IMR90-4-衍生BMEC | | |
| 单作 | 1%PDS | 222 ± 51 |
| HEK公司 | 1%个人数据 | 236 ± 23 |
| HEK公司 | 10%FBS | 364 ± 53 |
| HEK（优化）c（c） | 10%FBS | 899±132 |
| 星形细胞 | 1%PDS | 412 ± 38 |
| 星形细胞 | 10%FBS | 696 ± 8 |
| 星形胶质细胞（优化）c（c） | 10%FBS | 1450 ± 140 |
| DF19-9-11T衍生BMEC | | |
| 星形胶质细胞（优化）c（c） | 10%FBS | 777±112 |
为了进一步验证IMR90-4-衍生的BMEC与星形胶质细胞共培养后形成的紧密连接的保真度，对这些细胞进行冷冻断裂电子显微镜检查(). 冷冻断裂揭示了紧密连接股的网络，其复杂性与高电阻BBB内皮细胞相似体内紧密连接颗粒主要与原生质断裂面（P面）有关，与低电阻形成良好对比在体外BBB模型经常经历紧密连接粒子从P面到E面的转换46。
BBB（英国广播公司）体内其特点不仅是TEER高，而且不易被被动扩散，用于营养物质和代谢物进出口的各种运输系统的表达，以及通过使用关键外排转运体（如p-糖蛋白）对疏水性小分子起到主动屏障作用的能力，乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药蛋白（MRP）家族成员。与星形胶质细胞共同培养的纯化IMR90-4-衍生BMEC表达了编码BBB中发现的各种受体/转运体的转录物()，例如低密度脂蛋白受体（低密度脂蛋白受体），轻轨P1（低密度脂蛋白受体相关蛋白1），INSR公司（胰岛素受体），LEPR公司（瘦素受体），BCAM公司（路德糖蛋白），TFRC公司（转铁蛋白受体），以及AGER公司（晚期糖基化终产物受体，RAGE）。与其他内皮细胞相比，在BBB高度富集的氨基酸和肽转运蛋白家族成员也检测到转录物，包括STRA6系列（视黄醇结合蛋白），SLC2A1型（GLUT-1），SLC7A5型（LAT1），SLC1A1型（EAAT3），SLC38A5型（SNAT5），以及SLC16A1型（MCT1）。还检测到外流转运体转录物，包括澳大利亚广播公司1（MDR1/p-糖蛋白），ABCG2公司（BCRP），ABCC1公司（MRP1），ABCC2型（MRP2），ABCC4公司（MRP4），以及ABCC5公司（MRP5）。值得注意的是，未检测到两个分析的转录本：PLVAP公司和SLC21A14.PLVAP公司（质膜囊泡相关蛋白）在发育过程中最初在BBB表达，随着屏障特性的出现而下调，而其表达在整个成年期仍在外周血管中24因此PLVAP公司在IMR90-4衍生的BMEC中，是BBB规范和成熟的进一步指标。SLC21A14型（也称为SLCO1C1型)编码Oatp14，这是一种有机阴离子转运体，其转录物和蛋白质产物在啮齿类动物中高度富集，但在人类BBB中不富集47,48总之，受体和转运体的基因表达谱是BBB的高度代表性。
接下来，使用IMR90-4衍生的BMEC/星形胶质细胞共培养模型筛选具有不同大小、亲脂性和流出转运蛋白识别性的放射性标记小分子的相对渗透率(和补充表1). 实测渗透率（Pe（电子）)值显示出良好的相关性（R2=0.98）至体内啮齿类动物的脑摄取通过就地脑灌注49重要的是，蔗糖渗透性（Pe（电子）=3.4×10−5cm/min），通常用于基准被动屏障在体外模型，与高保真动物BBB模型（10−4-10−5厘米/分钟）49,50明显低于hCMEC/D3细胞系（Pe（电子）=1.65×10−3厘米/分钟）8葡萄糖是一种小的（180 Da）亲水分子，通过GLUT-1转运体活跃地流入BBB，因此与蔗糖相比，其渗透性高7倍（Pe（电子）=2.2×10−4厘米/分钟）。菊粉是一种大的亲水多糖聚合物，对蔗糖的渗透性相似（Pe（电子）=2.9×10−5厘米/分钟）。地西泮，一种非常亲脂的小分子，表现出高BBB渗透性体内因为它不是外排转运体底物，表现出最高在体外渗透（1.1×10−3厘米/分钟）。秋水仙碱和长春新碱也是亲脂小分子，但大脑摄取有限体内由于它们是p-糖蛋白和MRP家族成员的底物，因此被发现具有较低的pe（电子）值在体外(9.2×10−5和6.2×10−5cm/min）。由BCRP流出但也被认为是由有机阳离子转运蛋白流入的哌唑嗪显示出稍高的Pe（电子）(2.9×10−4cm/min），与秋水仙碱和长春新碱相关体内排名。重要的是，P的40倍动态范围e（电子）值（地西泮/蔗糖）表明iPSC-derived BBB模型作为药物筛选工具的潜在效用，尽管未来需要对更广泛的化合物进行测试，以充分验证模型的预测能力。
虽然上述亲脂小分子如秋水仙碱、长春新碱和哌唑嗪的相对排除意味着相关BBB外排转运体的功能性和，我们还使用选择性抑制剂（在补充表2). 首先，使用细胞可渗透的荧光p-糖蛋白底物罗丹明123检测单培养IMR90-4-衍生BMEC中的p-糖蛋白质功能。在环孢菌素a（一种已知的p-糖蛋白抑制剂）存在的情况下，罗丹明123的细胞积累量增加了1.4倍（流出量减少），但在分别使用BCRP抑制剂和MRP家族抑制剂Ko143或MK 571的情况下没有增加，这表明在IMR90-4衍生的BMEC中存在功能性p-糖苷([面板i]）。当多柔比星（p-糖蛋白、BCRP和MRP的底物）被添加到单一培养的IMR90-4-衍生的BMEC中时，在环孢菌素a、Ko143或MK 571的存在下，其积累增加，表明每类转运体的功能外排活性([面板i]）。接下来，使用IMR90-4衍生的BMEC/星形胶质细胞共培养模型进行定向转运分析，以证明脑-血方向（基底外侧到顶端）的优先外排功能。对于p-糖蛋白，在环孢菌素A（而不是Ko143或MK 571）存在的情况下，罗丹明123从心尖到基底外侧室的转运高2.3倍，这是由于抑制了从基底外侧到心尖方向的流出([第二组]）。相反，经环孢菌素A治疗后，罗丹明123在基底外侧向心尖方向的转运略有减少，这是因为罗丹明123p糖蛋白在心尖界面的挤出被阻断了(补充图13). 环孢素A、Ko143和MK 571分别使阿霉素从心尖腔向基底外侧腔的转运增加1.3倍、1.3倍和1.2倍，表明p-糖蛋白、BCRP和MRP家族外排转运蛋白的净功能极化([第二组]）。总之，这些数据证明了外排转运体的功能和极化。重要的是，在抑制剂存在的情况下，通过增加通量测量的极化程度与原代培养的极化程度一致在体外啮齿动物BBB系统49总的来说，BBB基因和蛋白表达的复合物、紧密连接保真度、小分子的相关通透性和极化外排转运体活性使iPSC-derived BMEC具有显著的BBB特征。
讨论
由于其复杂性，少数实验室采用了原代动物和人类BMEC培养的传统方法。此外，初级BMEC培养受到产量限制的阻碍。永生细胞系可以缓解产量问题，但受其BBB表型减少的限制。相比之下，鉴于内皮分化效率（>60%）和基于细胞外基质的简单纯化能力，本文描述的生成hPSC衍生的BMEC的方法能够形成健壮的BBB模型，并且易于扩展。相比之下，其他利用类胚体、OP9共培养和与内皮因子的2D分化的hPSC分化策略的EC分化效率较低（1-43%），必须结合抗体辅助纯化方法才能获得纯EC群体14-20,29,30此外，这里报道的分化过程导致11.6 PECAM-1的高产+/GLUT-1型+分化8天后每个输入hPSC的BMEC，而最近使用OP9共培养和类胚体/定向分化方法的出版物报告的产量分别为0.6和7.4 EC15,19因此，该模型的干细胞基础提供了高度可扩展的人类BMEC来源，例如，可以容易地对其进行缩放，以产生足够的细胞用于数千个用于药物筛选的过滤器。此外，上述方法均未报告EC群体具有器官特异性。在这项研究中，BBB规范发生在共分化神经细胞存在的情况下，这可能提供了胚胎脑微环境通常提供的许多必要线索体内24,26,27,34,41-43共分化策略也可能通过在发育过程中提供特定于器官的微环境线索来指定其他谱系的内皮细胞在体外。
鉴于BMEC人群是通过不同的重编程策略从hESC和iPSC系中获得的，这种hPSC衍生的BMEC模型可以很容易地被更广泛的研究团体用于大脑发育、疾病机制和药物传递的研究。这个在体外BBB规范过程似乎涉及Wnt/β-catenin信号，这与体内小鼠脑发育机制的研究26,27,34因此，该模型可以解释导致人类BBB分化的其他分子机制，这是一项在人类中难以解决的研究。关于人类血脑屏障发育的信息可能与促进中风后血脑屏障修复或抑制脑肿瘤血管募集有关。已经证明hPSC衍生的BMEC具有良好的屏障特性，具有适当的分子排斥和功能运输系统，预计该细胞平台也将用于药物渗透性筛选，以开发可到达大脑的药物，或限制大脑对可能具有神经毒性副作用的药物的摄取。
材料和方法
hPSC培养与分化
人类胚胎干细胞（H9）11和诱导多能干细胞（iPS（IMR90）-4（参考。13)，iPS-DF19-9-11T33和iPS-DF6-9-9T33)在标准无条件培养基中保存在照射过的小鼠胚胎成纤维细胞上：Dulbecco改良Eagle's培养基/火腿F12，含有20%敲除血清替代物（Invitrogen）、1×MEM非必需氨基酸（Invitro）、1 mM L-谷氨酰胺（Sigma）、0.1 mMβ-巯基乙醇（Sigma-）、，和人类碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，人胚胎干细胞为4 ng/mL，多能干细胞为100 ng/mL；威斯康星大学韦斯曼临床生物制造设施）。分化前，细胞在mTeSR1培养基（STEMCELL Technologies）中传到Matrigel（BD Biosciences）上。在mTeSR1中放置2-3天后（参考。51)，将培养基切换到缺乏bFGF的无条件培养基（在整个手稿中称为UM）以启动分化。UM处理的第5-7天观察到了主要的形态学变化，此时将培养基切换到内皮细胞（EC）培养基：添加20 ng/mL bFGF和1%血小板缺乏血浆衍生牛血清的人内皮无血清培养基（Invitrogen）32（PDS；生物医学技术公司）。在EC培养基处理1-2天后，用dispase（2 mg/mL；Invitrogen）分离细胞，并将其置于12孔组织培养聚苯乙烯板或1.12 cm2Transwell-Clear®渗透性插入物（孔径0.4μm）涂有IV型胶原（400μg/mL；Sigma）和纤维连接蛋白（100μg/mL）的混合物。将培养板与涂层在37℃下孵育至少30 min，而插入物在37℃孵育最少4 h。从标准的6孔组织培养板（9.6 cm）中分化出一孔hPSC2)可用于接种胶原/纤连蛋白包被的12孔板（11.4cm2)或四个胶原蛋白/纤维连接蛋白涂层嵌件（4.48厘米2). 然后在EC培养基中培养细胞，直到它们汇合（通常1-2天）。在数十次分化和纯化实验的过程中，多批PDS（5批）、敲除血清替代物（至少3批）、Matrigel（至少3批次）、IV型胶原蛋白（每2-3个月新一批）和纤维连接蛋白（每隔2-3个月换一批）对分化效率或BMEC屏障保真度没有明显影响。此外，值得注意的是，上述材料均未通过鉴定或预筛选，以证明其促进有效分化的能力。
hPSC衍生的BMEC共培养实验
在共培养实验中，如前所述分离原代星形胶质细胞52简单地说，从P6新生Sprague-Dawley大鼠（Harlan）中分离出皮层，并在Hank’s平衡盐溶液（HBSS；Sigma）中切碎。该组织在37°C振动浴中在含有0.5 mg/mL胰蛋白酶的HBSS（Mediatech，Inc.）中消化25分钟，然后在37°C振动浴中，在含有114 U/mL DNase I（Worthington生化）的HBSS中消化5分钟。研磨和过滤后，细胞在胶原蛋白-I涂层烧瓶（100μg/mL；Sigma）上培养DMEM中含有10%合格的热灭活胎牛血清（FBS；Invitrogen）、10%热灭活马血清（Sigma）、2 mM L-谷氨酰胺和1%抗菌剂（Invitrogen）。将人胚胎肾293细胞（HEK细胞；ATCC）在补充有10%FBS、1mM丙酮酸钠（Sigma）、2g/L碳酸氢钠（Fisher Scientific）、30mM HEPES（Sigma）和1%抗生素抗真菌的DMEM中培养，并用作非神经细胞对照。hPSC衍生的BMEC与原代大鼠星形胶质细胞或HEK细胞在EC培养基（称为1%PDS培养基)或70:30（v/v）DMEM/F12（Sigma/Invitrogen）补充1%抗生抗真菌剂、2%B27（Invitrogen）和10%FBS52（称为10%FBS介质). 在共培养开始时，使用EVOM伏特计（世界精密仪器）测量跨内皮电阻（TEER），然后每24小时测量一次。电阻值（Ωxcm2)从每次测量中减去涂有胶原蛋白/纤维连接蛋白的空过滤器。确定Pe（电子）在放射性标记的配体中，化合物在运输缓冲液（蒸馏水和0.12 M NaCl，25 mM NaHCO）中稀释至0.4μCi三，3 mM KCl，2 mM MgSO4，2 mM氯化钙2，0.4毫微米K2高性能操作4将1 mM HEPES、0.1%牛血清白蛋白[BSA；Sigma]）和0.5 mL添加到上室。每隔15分钟从基底外侧室提取200μL等分样品，并用新鲜运输缓冲液替换。用放射性配体在基底外侧室1小时内的积累率计算Pe（电子）的值[14C] -蔗糖[三H] -菊粉[三H] -秋水仙碱[三H] -地西泮[三H] -哌唑嗪[14C] -葡萄糖，以及[三H] -长春新碱。[三H] -长春新碱购自美国放射性标记化学品公司，而所有其他放射性标记化合物购自PerkinElmer公司。所有化合物在37°C下进行培养，并在旋转器上进行放射性渗透试验。所有渗透性研究均使用三硅酸盐过滤器。
外流传输分析
P-糖蛋白、BCRP和MRP功能使用罗丹明123（西格玛）（P-糖蛋白的优选底物）进行评估，以及[14C] -阿霉素（PerkinElmer），所有上述外排转运体的底物。为了评估活性，将培养在聚苯乙烯上的hPSC衍生BMEC单层（无星形胶质细胞共培养）在37°C的旋转器上预先培养30分钟，分别加入或不加入5μM环孢菌素a（Sigma）、1μM Ko143（Sigma1）或10μM MK 571（Sigma-），它们是p-糖蛋白、BCRP或各种MRP的抑制剂。然后将BMEC与罗丹明123（10μM）或阿霉素（0.25μCi）在37°C的旋转器上孵育1小时，有或没有抑制剂。然后用冰镇PBS清洗细胞三次，并用5%Triton X-100（TX-100；Fisher）溶解。荧光（485 nm激发和530 nm发射）使用平板读取器测量，并归一化为使用血细胞仪获得的细胞计数，而放射性则使用液体闪烁计数器测量。为了量化顶端至基底外侧的转运，将Transwell滤膜上hPSC衍生的BMEC单层与星形胶质细胞共培养24小时，然后在有或无抑制剂的情况下预培养60分钟，然后向上腔添加罗丹明123或阿霉素。再过60分钟，从底部室中取出等分样品，并在平板阅读器或闪烁计数器上对其传输进行量化。为了量化基底侧至顶端的转运，将Transwell过滤器上hPSC衍生的BMEC单层与环孢菌素A或不与环孢霉素A预孵育60分钟，然后将罗丹明123添加到下室。3小时后，从上腔提取等分样品，并在平板阅读器上进行荧光定量。在没有抑制剂的情况下，所有累积和转运测量值均归一化为累积和转运。在10%FBS共培养基中进行罗丹明积累和转运研究，而在上述转运缓冲液中进行阿霉素研究。蔗糖渗透率和TEER测量用于确认抑制剂存在下的单层完整性。
成管和乙酰化低密度脂蛋白（LDL）摄取分析
在37°C下，用500μL Matrigel涂布24孔组织培养板1小时。使用胰蛋白酶分离胶原蛋白/纤维连接蛋白纯化的hPSC衍生的BMEC，在添加40 ng/mL VEGF（R&D系统）的EC培养基中将100000个细胞接种到每个Matrigel-coated孔中，并在12小时后成像。还使用了缺乏VEGF的细胞的对照样品。对于乙酰化LDL摄取，纯化的hPSC衍生的BMEC与10μg/mL乙酰化LDL-Alexa Fluor 488（Invitrogen）偶联物在37°C孵育4 h，用PBS洗涤两次，并立即用奥林巴斯表观荧光显微镜观察。使用MetaVue软件运行的诊断仪器摄像头拍摄图像。
免疫细胞化学/原位杂交
细胞用PBS清洗一次，然后在2%多聚甲醛或100%冰镇甲醇中固定15分钟。然后用40%山羊血清在PBS（40%PBSG）中封闭细胞。如果检测细胞内抗原，40%的PBSG中存在0.1%的TX-100。然后将细胞培养在含有初级抗体的40%PBSG（参见补充表3对于列表），在室温下保持1小时或在4°C下过夜。在PBS中清洗三次后，细胞在含有山羊抗兔德州红（1:500；Invitrogen）或山羊抗鼠Alexa Fluor 488（1:500，Invitrogen）的40%PBSG中在室温下培养1小时。用300 nM 4′，6-二氨基-2-苯并二氢氯化物（DAPI）标记细胞核10分钟。细胞在PBS中清洗三次并可视化。在结果文本中指定的时间点测试血管和BBB标记。UM处理6天后和EC培养基处理2天后，在IMR90-4衍生细胞或纯化的IMR90-4-衍生BMEC中检测基底上皮和上皮前体细胞的标记物特征，即细胞角蛋白K14和p63转录因子，但未检测到。单纯上皮细胞角蛋白K18在未分化的IMR90-4 iPSCs中表达，在UM治疗6天和EC治疗2天后，在混合分化人群的所有细胞中仍检测到其表达。现场杂交检测WNT7A型和WNT7B型转录本的操作与Planell-Saguer描述的方法类似等53简言之，用PBS洗涤细胞一次，并在2%多聚甲醛中固定10分钟，然后在含有0.1%TX-100的PBS中透化5分钟。用含有3%BSA和4×生理盐水柠檬酸钠缓冲液（SSC；Fisher）的水溶液进行预杂交，然后在室温下在4×SSC和10%硫酸右旋糖酐（Fisher）中进行1h杂交。地高辛（DIG）标记的锁定核酸探针购自Exiqon，DIG标记的锁定义探针用作阴性对照（在补充表4). 在4×SSC/0.1%吐温-20中洗涤三次、2×SSC中洗涤一次、1×SSC洗涤一次和PBS洗涤一次（所有洗涤均在50°C下进行）后，细胞在含有4%BSA的PBS中封闭20分钟，并在4°C下用单克隆抗地高辛抗体（Sigma）标记过夜。如上所述进行二级抗体和DAPI标记。
流式细胞术
细胞通过Accutase（Invitrogen）培养2-3分钟获得，在100%冰镇甲醇中固定20分钟，并在室温下用40%PBSG封闭20分钟。初级抗体标记(补充表3)在室温下，在10%PBSG中进行1h。使用相同浓度的IgG对照。在用PBS中5%的FBS洗涤后，在室温下将10%PBSG中的二级抗体（山羊抗兔Alexa Fluor 488和山羊抗鼠Alexa Fluor 647；1:200）添加到每个样品中30分钟。在PBS中用5%的FBS进行两次洗涤后，用FACScaliber流式细胞仪对样品进行分析。为了量化目的，PECAM-1+使用PECAM-1/前向散射点图（参考兔IgG对照）对事件进行量化。显示GLUT-1表达升高的事件（GLUT-1+)使用GLUT-1/前向散射点图对缺乏BMEC的4D UM培养物进行量化，以解释分化培养物中GLUT-1的低基础表达。在这两个阳性闸门中发现的事件被归类为PECAM-1+/GLUT-1型+细胞。PECAM-1型+具有基础GLUT-1表达的事件称为PECAM-1+/GLUT-1型−为了抑制BMEC分化，10μM XAV-939（Sigma）54从UM治疗的第2天开始，在IMR90-4 iPSC中添加或等效的DMSO载体对照，并如上所述评估PECAM-1/GLUT-1的表达。为了便于查看，数据以带有颜色代码的二维点图表示。使用双色流式细胞术分别对兔和小鼠IgG对照组的βIII微管蛋白和巢蛋白表达进行定量。
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、定量RT-PCR和凝胶电泳
如前所述分化细胞。为了抑制Wnt信号，用250 ng/mL小鼠分泌的卷曲相关蛋白2（SFRP2；R&D Systems）处理细胞55在UM中放置4天，然后在UM内放置750 ng/mL SFRP2，再放置3天，或者从UM处理的第2天开始使用10μM XAV或同等体积的DMSO载体对照。对于RNA收集，细胞用PBS清洗一次，然后用胰蛋白酶或accutase解离。根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）提取总RNA。使用Omniscript逆转录酶（Qiagen）和寡核苷酸引物（Invitrogen）从1μg RNA中生成cDNA。然后在iCycler（Bio-Rad）上使用1μL cDNA和iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行定量PCR（qPCR）。使用GoTaq Green Master Mix（Promega）进行RT-PCR。底漆序列见补充表4使用比较周期阈值（CT型)方法，归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)表达式。折差计算为x-ΔΔCT型，其中x表示根据LinRegPCR 12.3版计算的引物效率（参考。56). 通过qPCR或RT-PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳分析转录扩增。
冷冻断裂电子显微镜
与大鼠星形胶质细胞共培养24小时后，IMR90-4-衍生的BMEC用PBS清洗一次，在1.5%戊二醛（Sigma）中固定60分钟，用PBS洗涤多次，用甘油（30%）冷冻保护，从过滤器中刮取，装入金样品载体（Bal-Tec零件号LZ 02125 VN）中，并浸入液体乙烷中。将冷冻样品转移到Balzers 301冷冻断裂仪中进行断裂，并在−110°C下升华1分钟。用铂在45°下复制蚀刻的断裂表面，铂由90°沉积的碳支撑。使用商用家用漂白剂清洁复制品1小时，然后用双蒸馏水冲洗。使用400目裸铜网收集清洁的复制品。使用配备Gatan 894型2kX2k CCD相机的JEOL 1230 TEM获取图像。
致谢
这项工作的部分资金来自国家卫生研究院拨款NS056249（E.V.S.）、AA020476（E.V.S）、EB007534（S.P.P）和国家科学基金会拨款EFRI-0735903（S.P.P.P）。E.S.L是美国国立卫生化学研究院生物界面培训项目（T32 GM008505）的接受者，S.M.a.是美国国家科学基金会研究生奖学金的接受器。作者感谢WiCell研究所提供的研究支持，感谢William M.Pardridge博士赠送GLUT-1抗血清。
脚注
作者贡献
E.S.L.、S.M.A.、S.P.P.和E.V.S.构思了hPSC衍生的BMEC策略，设计了所有实验，分析了所有数据，并撰写了论文。E.S.L.和S.M.A.完成了大多数实验。J.E.K.进行了RT-PCR实验，R.A.N.进行了冷冻断裂显微镜检查并对其进行了解释，H.K.W.进行了荧光分析就地杂交实验和A.A.对BMEC的表征做出了贡献。
竞争性金融利益
作者声明没有竞争性的经济利益。
工具书类
1Butt AM，Jones HC，新泽西州雅培。麻醉大鼠血脑屏障电阻：一项发育研究。生理学杂志。1990年；429:47–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2帕德里奇WM。血脑屏障药物靶向：脑药发展的未来。分子干预。2003;三:90–105. 151[公共医学][谷歌学者] 三。Weiss N、Miller F、Cazaubon S、Couraud PO。脑内稳态和神经疾病中的血脑屏障。生物化学与生物物理学报。2009;1788:842–857.[公共医学][谷歌学者] 4Deli MA、Abraham CS、Kataoka Y、Niwa M。体外血脑屏障模型的渗透性研究：生理学、病理学和药理学。细胞和分子神经生物学。2005;25:59–127.[公共医学][谷歌学者] 5Syvanen S等。三种正电子发射断层显像放射配体血脑屏障转运的物种差异，重点是P-糖蛋白转运。药物代谢和处置：化学品的生物命运。2009;37:635–643.[公共医学][谷歌学者] 6Warren MS等。包括人类在内的五种物种脑微血管内皮细胞和大脑中ABC转运体基因表达谱的比较。药物研究。2009;59:404–413.[公共医学][谷歌学者] 7Cecchelli R等人，药物发现和开发中血脑屏障的建模。Nat Rev药物发现。2007;6:650–661.[公共医学][谷歌学者] 8Weksler BB等人。人类成年脑内皮细胞系的血脑屏障特异性特性。法赛布·J。2005;19:1872–1874.[公共医学][谷歌学者] 9Forster C等。氢化可的松和TNFalpha对人血脑屏障体外模型中紧密连接蛋白的差异作用。生理学杂志。2008年；586:1937–1949. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Man S等人。人脑微血管内皮细胞和脐静脉内皮细胞不同地促进白细胞募集并利用趋化因子进行T细胞迁移。临床与发育免疫学。2008年；2008:384982. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Thomson JA等人。来源于人类囊胚的胚胎干细胞系。科学（纽约州纽约市）。1998;282:1145–1147.[公共医学][谷歌学者] 12Takahashi K等。通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131:861–872.[公共医学][谷歌学者] 13于杰，等。从人体体细胞诱导多能干细胞系。科学（纽约州纽约市）。2007;318：1917年至1920年。[公共医学][谷歌学者] 14Goldman O等人。BMP4的增强加速了人类胚胎干细胞向内皮细胞谱系的转化。干细胞（俄亥俄州代顿）2009;27:1750–1759.[公共医学][谷歌学者] 15James D等。通过TGF-β抑制人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的扩张和维持依赖于Id1。自然生物技术。28:161–166. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Levenberg S、Golub JS、Amit M、Itskovitz-Eldor J、Langer R.源自人类胚胎干细胞的内皮细胞。美国国家科学院院刊。2002;99:4391–4396. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Nakahara M等人。无需细胞分选技术，从无饲料人类胚胎干细胞高效生产可继代培养的血管内皮细胞。克隆和干细胞。2009;11:509–522.[公共医学][谷歌学者] 18王磊，等。人胚胎干细胞的内皮细胞和造血细胞命运来源于具有血管母细胞特性的原始内皮细胞。免疫。2004;21:31–41.[公共医学][谷歌学者] 19Choi KD等。人诱导多能干细胞的造血和内皮分化。干细胞（俄亥俄州代顿）2009;27:559–567. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20沃迪亚尼克MA、博克JA、汤姆森JA、斯拉克文II。人类胚胎干细胞衍生CD34+细胞：与OP9基质细胞共培养的高效生产和淋巴造血潜能分析。鲜血。2005;105：617–626。[公共医学][谷歌学者] 21Cleaver O，Melton DA。发育过程中的内皮信号传导。自然医学。2003;9:661–668.[公共医学][谷歌学者] 22Bauer H等人。小鼠端脑中红细胞型葡萄糖转运蛋白（Glut 1）的成瘤表达：与血脑屏障的收紧相关。大脑研究开发大脑研究。1995;86:317–325.[公共医学][谷歌学者] 23Bauer HC等。胚胎小鼠中枢神经系统中血脑屏障的新生血管化和形态学特征的出现。大脑研究开发大脑研究。1993;75:269–278.[公共医学][谷歌学者] 24Daneman R，Zhou L，Kebede AA，Barres BA。周细胞是胚胎发育过程中血脑屏障完整性所必需的。自然。468:562–566. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Stewart PA，Hayakawa K。大鼠胚胎血脑屏障血管的早期超微结构变化。大脑研究开发大脑研究。1994;78:25–34.[公共医学][谷歌学者] 26Daneman R等。中枢神经系统血管生成需要Wnt/beta-catenin信号，而非非中枢神经系统。美国国家科学院院刊。2009;106:641–646. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Stenman JM等。典型Wnt信号调节中枢神经系统血管的组织特异性组装和分化。科学（纽约，纽约。2008年；322:1247–1250.[公共医学][谷歌学者] 28Ying QL，Stavridis M，Griffiths D，Li M，Smith A.在贴壁单细胞培养中胚胎干细胞转化为神经外胚层前体。自然生物技术。2003;21:183–186.[公共医学][谷歌学者] 29Kane NM等。通过定向分化从人类胚胎干细胞衍生内皮细胞：体内外微RNA和血管生成分析。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。30:1389–1397.[公共医学][谷歌学者] 30王振中等。人胚胎干细胞来源的内皮细胞在体内形成持久的血管。自然生物技术。2007;25:317–318.[公共医学][谷歌学者] 31Daneman R等。小鼠血脑屏障转录组：了解脑内皮细胞发育和功能的新资源。请给我一个。5：e13741。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Calabria AR、Weidenfeller C、Jones AR、de Vries HE、Shusta EV。纯化大鼠脑微血管内皮细胞培养物在糖皮质激素诱导下表现出更好的屏障特性。神经化学杂志。2006;97:922–933.[公共医学][谷歌学者] 33Yu J，等。无载体和转基因序列的人诱导多能干细胞。科学（纽约州纽约市）。2009;324:797–801. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Liebner S等。Wnt/β-catenin信号传导控制血脑屏障的发育。细胞生物学杂志。2008年；183:409–417. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Xu Q，等。视网膜和内耳的血管发育：由Norrin和Frizzled-4（高亲和力配体-受体对）控制。单元格。2004;116:883–895.[公共医学][谷歌学者] 36Ye X等人。内皮细胞中的Norrin、frizzled-4和Lrp5信号控制视网膜血管形成的遗传程序。单元格。2009;139：285–298。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Robitaille J等。突变frizzled-4干扰家族性渗出性玻璃体视网膜病的视网膜血管生成。自然遗传学。2002;32:326–330.[公共医学][谷歌学者] 38Kawaguchi R等。视黄醇结合蛋白的膜受体介导细胞摄取维生素A。科学（纽约州纽约市）。2007;315:820–825.[公共医学][谷歌学者] 39Szeto W等。维甲酸反应基因Stra6在人类癌症中的过度表达及其由Wnt-1和维甲酸协同诱导。癌症研究。2001;61:4197–4205.[公共医学][谷歌学者] 40Shimomura Y等人APCDD1是一种新的Wnt抑制剂，在遗传性单纯性多毛症中突变。自然。464:1043–1047. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Anderson KD等。神经组织中的血管新生需要Gpr124，一种G蛋白偶联受体。美国国家科学院院刊。108:2807–2812. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Cullen M等，GPR124是一种孤儿G蛋白偶联受体，是CNS特异性血管形成和血脑屏障建立所必需的。美国国家科学院院刊。108:5759–5764. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Kuhnert F等。孤儿G蛋白偶联受体GPR124对中枢神经系统血管生成的基本调节。科学（纽约州纽约市）。330:985–989. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Vittet D等。胚胎干细胞通过连续的成熟步骤在体外分化为内皮细胞。鲜血。1996;88:3424–3431.[公共医学][谷歌学者] 46Liebner S，Kniesel U，Kalbacher H，Wolburg H。血脑屏障内皮细胞紧密连接形态与紧密连接蛋白表达的相关性。欧洲细胞生物学杂志。2000;79:707–717.[公共医学][谷歌学者] 47Roberts LM等。血脑屏障中甲状腺激素转运体单羧酸转运体-8（SLC16A2）和有机离子转运体-14（SLCO1C1）的表达。内分泌学。2008年；149:6251–6261.[公共医学][谷歌学者] 48Uchida Y等。人类血脑屏障转运体和受体的定量靶向绝对蛋白质组学。神经化学杂志。117:333–345.[公共医学][谷歌学者] 49Perriere N等。用于外排转运体分子分析的大鼠血脑屏障体外功能模型。大脑研究。2007;1150:1–13.[公共医学][谷歌学者] 50Cohen-Kashi Malina K，Cooper I，Teichberg VI。缩小体内和体外血脑屏障紧密性之间的差距。大脑研究。2009;1284:12–21.[公共医学][谷歌学者] 51Ludwig TE等。人类胚胎干细胞的饲养者依赖培养。自然方法。2006;三:637–646.[公共医学][谷歌学者] 52Weidenfeller C，Svendsen CN，Shusta EV.分化胚胎神经祖细胞诱导血脑屏障特性。神经化学杂志。2007;101:555–565. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53de Planell-Saguer M，Rodicio MC，Mouralatos Z.未经蛋白酶处理的细胞和福尔马林固定石蜡包埋组织切片中非编码RNA和蛋白质的快速原位共检测。自然协议。5:1061–1073.[公共医学][谷歌学者] 54Huang SM等。Tankyrase抑制稳定axin并拮抗Wnt信号。自然。2009;461:614–620.[公共医学][谷歌学者] 55Dravid G等。定义Wnt/β-catenin信号在人类胚胎干细胞存活、增殖和自我更新中的作用。干细胞（俄亥俄州代顿）2005;23:1489–1501.[公共医学][谷歌学者] 56Tuomi JM、Voorbraak F、Jones DL、Ruijter JM。基于水解探针的定量PCR观察到的Cq值偏差可以用估计的PCR效率值进行纠正。方法（加州圣地亚哥。50:313–322.[公共医学][谷歌学者] 
