NF-κB/Rel家族的转录因子是免疫和炎症反应的中枢调节器三.它们还促进肿瘤发生三NF-κB（活化B细胞的核因子-κ-光链增强因子）在这些过程中的最佳记录功能是上调编码炎症介质、免疫调节器和凋亡抑制剂的转录程序，以及刺激细胞迁移和分化的生长因子和因子三.
免疫和肿瘤发生也涉及快速的细胞分裂。这带来了大量的生物能量和生物合成挑战，细胞通过增加葡萄糖代谢来应对这些挑战。在有氧条件下对葡萄糖的依赖（癌症中的一种现象称为Warburg效应2)使分裂细胞能够促进糖酵解和磷酸戊糖途径，以生成NADPH、大分子和ATP，从而使生物量加倍1,2因此，葡萄糖是癌症和正常增殖细胞的必需营养素1然而，当葡萄糖稀缺时，AMP活化蛋白激酶（AMPK）的能量传感会阻止合成代谢途径，代谢会转向脂肪酸氧化和氧化磷酸化（OXPHOS），从而利用可用资源最大限度地提高能源效率1,5,6然而，线粒体缺陷，部分原因是线粒体因子（例如细胞色素）的表达和/或功能改变c（c）氧化酶（COX）复合蛋白7,8以及致癌突变可能导致葡萄糖成瘾1,2,5,8,9然而，细胞增殖所需的代谢重编程是否由NF-κB控制尚不清楚。
引人注目的是，主要NF-κB反式激活亚单位RelA的敲除三在正常培养条件下，显著提高小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的葡萄糖消耗和乳酸生成()从而重现了Warburg效应。使用早期传代淘汰MEF获得了类似的结果(补充图S1a、b). RelA缺乏的细胞也表现出ATP水平升高和耗氧量降低(和补充图S1c). 因此，基础NF-κB活性抑制有氧糖酵解的重编程。
NF-κB对抗有氧糖酵解的重新编程，并促进代谢适应营养饥饿。(a–d)葡萄糖消耗(一，左），乳酸生成(b条)，ATP浓度(c（c）)和氧气消耗(d日)在表达非特异性（ns）或RelA公司-正常培养条件下的特定shRNAs。(一)是的，有细胞的蛋白质斑点一–d日，显示了RelA（敲除效率）、c-Rel和β-actin（敲除特异性）的水平。(e（电子）)左，表达非特异性或RelA公司葡萄糖饥饿（GS）后的shRNAs。中间，代表性细胞的图像。对，非特异性和RelA公司shRNA细胞。使用两个额外的非特异性shRNAs（ns2，shc003v）和两个额外RelA公司-特定shRNAs和电子GFP-特异性、荧光素酶特异性、层粘连A/C特异性和亲环素B特异性shRNAs。(（f）–小时)乳酸生产(（f）)，耗氧量(克)和ATP浓度(小时)在被视为e（电子）.乳酸值（f）第4天之后应谨慎解释，因为RelA公司-shRNA细胞。(我,j)细胞存活率e（电子）在4天的葡萄糖饥饿后，单独（GS）或同时伴有血清剥夺（GS+SD）；我)或雷帕霉素（GS Rapa；j，左）。(j)右，代表性图像。在一–j这些值表示平均值±标准误差。n个= 3 (一–c（c）,e（电子）,（f）,小时–j);n个= 4 (d日);n个= 10 (克). 在小时, *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. ±比例尺：50μm。
为了确定这种糖酵解开关是否代表了对增殖增加的稳态反应，我们检测了RelA缺陷细胞在葡萄糖饥饿时转化为OXPHOS提供能量的能力。值得注意的是，RelA抑制损害了对葡萄糖饥饿的适应，导致细胞死亡(和补充图S1d). 相比之下，野生型细胞的生存能力几乎不受影响。NF-κB诱导激酶抑制剂IκB激酶（IKK）β(补充图S1f，g). 缺乏RelA的细胞仍然依赖糖酵解来产生能量，即使在葡萄糖缺乏的情况下，其乳酸生成量高，耗氧量降低(还有补充图S1h). 这导致葡萄糖饥饿的RelA缺乏细胞中ATP水平显著降低，但饥饿的野生型细胞中没有(和补充图S1e). 缺乏RelA不会影响葡萄糖饥饿后的增殖抑制(补充图S2a，b)从而排除了葡萄糖缺乏诱导的细胞周期检查点的缺陷1作为突变细胞死亡的原因。因此，NF-κB抑制通过损害OXPHOS阻碍细胞在葡萄糖饥饿期间满足代谢需求的能力，从而导致代谢危机和细胞死亡。因此，降低代谢需求2,5通过mTOR抑制剂雷帕霉素的血清剥夺或阻断蛋白质生物合成1,6从葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡中拯救RelA缺陷细胞(和补充图S2c).
营养缺乏后的生存取决于大量自噬，这是一种产生能量的自动消化过程5,10事实上，沉默Beclin1或ATG7这两种重要的宏自噬效应器10或用大分子自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和氯喹治疗10，在葡萄糖缺乏的野生型MEF中诱导的毒性与RelA失活的程度相似(补充图S3a–c). 然而，大自噬效应物LC3的诱导（参考文献。10)也不会形成大量自噬小泡10，在葡萄糖饥饿期间因RelA抑制而受损(补充图S3d，e). 相反，这种抑制基本上诱导了自噬通量，未经处理的自噬体的形成和降解速度加快RelA公司小发夹RNA（shRNA）细胞相对于对照细胞(补充图S3d–f，0小时; 见LC3和eGFP–LC3点状染色水平增加，自噬货物蛋白p62水平降低RelA公司-shRNA细胞未暴露于巴非霉素A1，抑制溶酶体空泡ATP酶）。因此，有缺陷的宏自噬并不是导致缺乏葡萄糖的RelA细胞死亡的原因。类似地，RelA缺陷细胞和对照细胞在葡萄糖饥饿诱导的caspase激活方面没有明显差异(补充图S4a)，并使用caspase-8特异性shRNAs或泛酶抑制剂z-VAD阻断凋亡fmk公司(10)代谢激发后，未能将RelA缺陷细胞从程序性细胞死亡（PCD）中拯救出来（参考。补充图S4b–d). 值得注意的是，在缺乏葡萄糖的情况下，RelA失活保留了毒性Bax公司−/−/贝克−/−MEF，对凋亡不敏感10(补充图S4e，f). 饥饿的RelA敲除细胞也显示出坏死的形态学特征，缺乏核小体碎片，这是凋亡的标志，并且其培养基中含有较高水平的坏死标记HMGB1（参考文献。10;补充图S4g; 数据未显示）。因此，在葡萄糖饥饿期间NF-κB提供的保护包括抑制坏死死亡途径。
能量传感器AMPK协调对低血糖可用性的适应，AMPK抑制合成代谢途径并诱导细胞周期阻滞，从而抑制ATP消耗1,5,6然而，RelA缺乏对葡萄糖饥饿诱导的Akt和mTOR通路的激活没有影响，促进了大分子生物合成1,5，或AMPK本身(补充图S5a). 然而，这种缺陷在未受挑战和缺乏葡萄糖的细胞中都导致p53表达显著下调().
p53介导NF-κB依赖性保护抵抗葡萄糖饥饿。(一)非特异性（ns）和RelA公司-葡萄糖饥饿（GS）后shRNA-表达永生化MEF。exp，暴露。(b条)qRT-PCR与RelA公司-或第53页-表达shRNAs的永生化MEF的特异性引物和RNA。(c（c）,d日)带有抗RelA抗体的染色质免疫沉淀，qPCR引物特异性用于第53页和IκBα启动子或控制基因组区域（对照1–3）和未经处理（UT）、TNFα处理或缺乏葡萄糖的永生野生型提取物(c（c）,d日)和RelA公司−/−(RelA公司淘汰赛；d日)MEF公司。(e（电子）,（f）)早期传代存活RelA公司−/−(e（电子）)和第53页−/−(第53页淘汰赛；（f）)葡萄糖饥饿前后表达外源性eGFP、小鼠（m）p53或人（h）RelA的MEFs（左）。用来自相同细胞的RNA进行qRT-PCR（0小时；右侧）。(克,小时)乳酸产量和耗氧量RelA公司−/−在正常培养基（NM）和葡萄糖饥饿（GS）条件下表达外源性eGFP或小鼠p53的MEF。在b条–小时这些值表示平均值±标准误差。n个=3 (b条–克);n个15 = (小时). 斑点的未裁剪图像如所示补充图S8.
基础p53活性降低糖酵解水平并增加OXPHOS水平，从而对抗Warburg效应1,5,7,11因此，我们研究了p53是否介导NF-κB的任何代谢活动。值得注意的是，RelA抑制下调了第53页，以及NF-κB靶点A20型与MEF中的低基础NF-κB活性一致(和补充图S4f和S5c系列; 也补充图S1g和5美元未经治疗的MEF中磷酸化I B和IKKα/β）。RelA抑制也受损第53页TNFα对mRNA的诱导作用(补充图S5b). 相反，p53失活对RelA公司成绩单(和补充图S4f). 染色质免疫沉淀显示NF-κB/RelA复合物与近端已知的κB元件结合第53页启动子区12即使在基本条件下(). 这种结合是特异性的，因为在对照基因组区域或RelA公司−/−单元格(). RelA绑定到第53页在TNFα刺激或葡萄糖饥饿后，启动子增加，从而诱导NF-κB（参考。三;补充图S5d)，并且在该启动子上比在我κB类α、 NF-κB的另一个靶点（参考。三;). 因此，基础和诱导的p53表达受到NF-κB依赖的直接转录控制。相反，NF-κB不影响总或Ser15-磷酸化p53的相对葡萄糖缺乏依赖性诱导()，由AMPK控制（参考6,13)也不影响p53蛋白的稳定性11(补充图S5e，f).
这些数据表明，除了AMPK外，NF-κB还需要参与p53通路以指导细胞对代谢应激的反应。一贯地，p53沉默概括了RelA失活的许多代谢效应，包括基础乳酸生成、葡萄糖消耗和ATP水平的增加，以及氧利用水平的降低7,13,14(补充图S6a–d还有、和补充图S1a–c，e，RelA缺乏细胞；补充图S6e永生MEF中的功能性p53状态）。它还显著增加了葡萄糖饥饿诱导的PCD(补充图S6f，g还有补充图S4e)，以前建立6，其大小和动力学类似于RelA失活(和补充图S1d和S4e系列). 与RelA缺乏一样，p53失活并不影响细胞周期阻滞1在所用的葡萄糖饥饿条件下(补充图S2a)，如前所述6并且通过血清剥夺挽救了葡萄糖饥饿诱导的p53缺陷细胞的细胞死亡(补充图S2d)表明这些细胞可能会经历与RelA缺陷细胞相同的代谢危机。值得注意的是，p53的表达使RelA缺陷细胞免于葡萄糖饥饿诱导的坏死()而RelA表达对缺乏葡萄糖的p53缺陷细胞没有保护作用(). p53重组还降低了乳酸生成水平，增加了小鼠的耗氧量RelA公司−/−从而恢复RelA丢失的代谢效应，无论是在基础上还是在葡萄糖饥饿期间(). 因此，在控制代谢应激适应的生物能量途径中，p53是NF-κB的重要下游介体。
强化了NF-κB缺陷细胞中葡萄糖成瘾是由p53信号受损引起的这一概念，RelA失活上调了p53再表达基因的基础表达，包括编码葡萄糖转运蛋白GLUT1、GLUT3和GLUT4的基因（参考文献14–16)和糖酵解酶磷酸甘油酸变位酶2（PGM2；参考文献。17;). 它还下调了p53靶点SCO2()是COX的组成部分，是氧气利用的主要细胞场所4,7.由p53以物种和/或组织特异性方式控制的代谢酶水平13,18,19反而不受NF-κB的影响().
SCO2介导NF-κB依赖性保护，对抗葡萄糖饥饿诱导的PCD。(一)非特异（ns）RNA的qRT-PCR或RelA公司-shRNA-在基础条件下表达永生化MEF。本文中提到但未指定的p53代谢靶点：TP53诱导的糖酵解和凋亡调节器18(TIGAR公司)，胍基乙酸甲基转移酶13(GAMT公司)，谷氨酰胺酶2(GLS2级;参考19). (b条)顶部，早期传代存活RelA公司−/−葡萄糖饥饿（GS）后表达外源性eGFP或小鼠（m）-SCO2的MEF。(c（c）)左图，表达所示shRNAs的永生化MEF在葡萄糖饥饿后的存活率。(b条)底部和(c（c）)右，qRT-PCR显示相对范围2和RelA公司在相同细胞中表达（0h）。在一–c（c）这些值表示平均值±s.e.m(n个= 3).
敲除GLUT1、GLUT3或PGM2未能保护RelA-缺陷细胞抵抗葡萄糖缺乏诱导的PCD(补充图S7a)这表明编码这些蛋白质的基因的上调不能解释这些细胞中的葡萄糖成瘾。沉默它们也会促进缺乏葡萄糖的野生型细胞的坏死。因此，如前所述20糖酵解通量的增加增强了而不是削弱了细胞对低葡萄糖可用性的耐受性。值得注意的是，通过SCO2重组，NF-κB缺陷细胞的这种耐受性得以恢复()与这些细胞对葡萄糖代谢的依赖性降低一致(补充图S7b–d). 相反，SCO2下调至RelA缺陷细胞中的水平()在葡萄糖缺乏的野生型细胞中诱导PCD，其程度与RelA失活相当(). SCO2沉默还增加了未经处理的野生型细胞的葡萄糖消耗、乳酸分泌和基础ATP生成水平，并在葡萄糖饥饿期间减少了这一生成7(补充图S7e–g). 它还导致p53表达的糖酵解基因mRNA水平的代偿性增加5在缺乏RelA的细胞中，但在野生型细胞中没有(补充图S7h)，表明涉及p53依赖机制。尽管SCO2下调也增加了RelA水平(),范围2-shRNA细胞仍然死于葡萄糖饥饿。因此，SCO2概括了NF-κB对能量平衡、代谢适应和糖酵解基因表达的许多影响。这些数据确定SCO2是NF-κB–p53生物能量途径的下游效应器，并强调其在代谢应激期间NF-κ的保护活性中的重要性。
RelA或p53破坏可诱导Warburg效应，线粒体蛋白（例如COX成分）和其他代谢因子的失调在癌症中很常见1,2,5,7–9,19,20因此，我们推断由RelA缺乏引起的代谢重组可以克服恶性转化中对肿瘤抑制突变的需求11的确，关于致癌H-Ras（V12）的表达（参考。21)，早期通过RelA公司−/−MEF获得转化细胞的形态特征()并保持了与未转化的同类产品相当的扩散速度(). 与预期一样，经过类似处理的野生型细胞反而经历了生长停滞和衰老(). 最重要的是，与野生型细胞不同，H-Ras（V12）表达RelA公司−/−MEF表现出非固定增长()，转变的标志14这些数据表明，即使存在野生型p53，RelA缺陷细胞也有能力绕过癌基因诱导的衰老，从而导致转化。
RelA通过调节能量代谢抑制致癌转化。(一)代表性早期作品的图像RelA公司−/−,第页53−/−和用pWPT–eGFP或pWPT–H-Ras（V12）感染的野生型MEFs，在突变细胞中显示出转化特征（即更高密度、多刺形态），但在野生型细胞中没有。(b条)培养48小时后，表达H-Ras（V12）的MEFs中细胞数量相对于各自表达eGFP的对照的倍数变化。(c（c）)顶部，H-Ras（V12）转化细胞相对于H-Ras感染细胞的菌落数量变化百分比第53页−/−MEF公司。底部，代表性殖民地的图像。(d日,e（电子）)H-Ras（V12）转化早期传代的菌落数百分比变化RelA公司−/−表达eGFP的MEF、小鼠（m）-p53或m-SCO2和H-Ras（V12）转化的早期传代野生型MEF，表达eGFP-相对于表达eGFPRelA公司−/−MEF公司(d日)和H-Ras（V12）转化的早期传代野生型MEF表达非特异性（ns），RelA公司,第53页或范围2shRNAs相对于RelA公司-shRNA-表示MEF(e（电子）). (（f）,克)乳酸生成百分比变化(（f）)和葡萄糖消耗(克)在H-Ras（V12）中，相对于各自表达eGFP的对照物转化的MEF（另请参见补充图S1a、b，无H-Ras时的绝对水平（V12））。中的数据b条,c（c）,（f）和克来自中的单元格一.英寸b条–克这些值表示平均值±标准误差。n个=3 (b条,（f）,克);n个= 4 (c（c）,e（电子）). 比例尺：50μm。
SCO2或p53的异位表达逆转了RelA缺失对H-Ras（V12）诱导的转化的影响(). 相反，SCO2沉默与RelA或p53沉默对转化的促进作用相同(). 与糖酵解在增殖和转化中的作用一致，H-Ras（V12）的表达进一步上调了RelA公司−/−与未转化细胞相比，衰老野生型细胞中的MEF进一步降低(). 这些数据定位了RelA下游p53/SCO2依赖的代谢途径，以抑制肿瘤诱导的转化（另见补充图S5g，表达H-Ras（V12）的MEF中的p53水平）。他们支持一种模型，即RelA通过上调SCO2介导的机制部分抑制转化，SCO2可增加呼吸速率并抑制糖酵解速率，从而限制Warburg效应。因此，SCO2抑制诱导p53-和RelA-缺陷细胞表现出相同的糖酵解重编程7(补充图S7e–g)，而SCO2重组在RelA公司−/−MEF公司(补充图S7b–d).
我们的数据表明，线粒体代谢中NF-κB依赖性增加是转化的障碍。然而，许多研究表明NF-κB可以促进肿瘤发生。因此，我们检测了结肠癌细胞中NF-κB代谢功能的相关性，在结肠癌细胞模型系统中，NFκB发挥促肿瘤作用22,23RelA沉默后，CT-26结肠癌细胞变得容易受到葡萄糖饥饿的代谢挑战，无论是单独使用还是与抑制线粒体复合物I的抗II型糖尿病药物二甲双胍联合使用（参考文献。24;). 此外，小鼠的数据表明，尽管NF-κB的抑制对基础肿瘤的生存和生长几乎没有影响，但它使CT-26衍生的肿瘤对线粒体应激高度敏感体内在不影响NF-κB专一性CT-26肿瘤的条件下。当肿瘤表达较高水平的RelA-靶向shRNAs和较低水平的范围2mRNA(). 这些发现表明，通过抑制NF-κB和二甲双胍来抑制某些已建立的癌细胞的线粒体代谢可以减少肿瘤的发生体内.
NF-κB促进癌症的代谢适应体内. (一)左，CT-26细胞表达非特异性（ns）或RelA公司葡萄糖饥饿（GS）前后的shRNAs。对，western blots显示RelA-击倒效率。(b条)细胞存活率一在用葡萄糖饥饿、二甲双胍（MET）或葡萄糖饥饿加二甲双胍治疗4天后。(c（c）)CT-26肿瘤的生长表现为非特异性或RelA公司二甲双胍或PBS治疗的裸鼠体内的shRNAs(d日)典型肿瘤的图像c（c）. (e（电子）)qRT-PCR显示相对RelA公司和范围2在第14天从两个代表性的二甲双胍治疗的小鼠中分离的肿瘤中的水平。在一–c（c）和e（电子）这些值表示平均值±标准误差。n个= 3 (一,b条,e（电子）);n个= 9 (c（c）); *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
我们已经确定NF-κB是线粒体呼吸的生理调节器，并且已经确定NFκB的这种功能可以抑制Warburg效应和致癌转化，并防止营养饥饿时的坏死。我们还确定了NF-κB在癌症代谢适应中的作用体内NF-κB的代谢功能涉及SCO2的p53依赖性上调，SCO2增加OXPHOS，从而降低糖酵解通量。我们的发现将NF-κB定位于一个节点检查点，将细胞激活和增殖与能量感应和代谢稳态联系在一起。
NF-κB–p53串扰在基因毒性应激和炎症期间曾被研究过，结果不同，取决于组织类型、诱导核活性水平和翻译后修饰的性质25然而，我们在这里表明，在基础条件下，以及在对某些刺激的反应中，NF-κB和p53合作指导细胞生物能量学。一贯地，RelA缺乏现象复制了p53失活的一些基本效应，包括培养物和小鼠中的缺陷DNA修复和基因组不稳定11,26,27虽然NF-κB被报道激活了第53页CAT/荧光素酶报告子分析中的启动子12NF-κB在氧化代谢和代谢适应调节中的基本作用尚未研究。值得注意的是，我们尚未公布的数据表明，NF-κB也可能通过p53依赖机制（C.M.、S.C.L.和G.F.，未公布的数据）控制新陈代谢，强调了它控制p53以外的全球能量代谢网络的概念。进一步的研究将确定NF-κB的这些p53依赖功能的重要性。然而，在这里我们确定NF-κB是能量稳态和代谢适应的中央调节器。
然而，NF-κB在Ras诱导的转化中的作用仍存在争议14,15,21,28,29最近的一项研究表明，RelA可以通过上调GLUT3（参考文献。14). 然而，在本研究和其他研究中，p53的状态是一个令人困惑的问题，因为所使用的系统要么是含有缺陷p53通路的永生化成纤维细胞，要么第53页−/−模型14,15,21,29通过使用早期传代的p53野生型MEFs，我们证明了NF-κB对葡萄糖代谢和转化的抑制是由内源性p53介导的，它似乎覆盖了NFκB的其他p53诱导的糖酵解相关活性。在某些组织中，NF-κB始终作为增殖抑制剂和肿瘤抑制剂发挥作用三,28,30.
尽管如此，NF-κB更经常促进癌症的进展和生存三,29,31在这方面，我们的数据表明，NF-κB通过在代谢应激期间促进肿瘤生长，可能允许适应缺氧和低血糖环境，在一定程度上发挥促肿瘤生成作用。这些发现与以前的研究一致，这些研究表明线粒体代谢是肿瘤发生所必需的32,33有趣的是，我们报道的NF-κB促肿瘤和抗肿瘤代谢活性的二分法在许多其他致癌基因和肿瘤抑制因子（包括p53）中已经被发现（参考文献1,11,19,24). 然而，NF-κB在癌症中经常上调，p53经常发生突变。然而，我们的数据并不排除在某些肿瘤中，NF-κB也可能通过突变的p53行使其代谢和促肿瘤功能。尽管还需要进一步的研究来解决这个问题，但我们的发现确立了NF-κB依赖性控制能量代谢对癌症代谢适应的生理意义体内，并且它们定义了一种生物能量途径，通过该途径，NF-κB可以促进肿瘤的进展和生存，而不依赖于细胞凋亡或炎症的调节。这些发现具有治疗意义，因为它们表明NF-κB抑制剂可以增强代谢药物的抗癌功效。
方法
抗体和试剂
用于免疫印迹的抗体为：抗RelA，（1:10000；分析设计）；抗caspase-8（1:1000；Alexis）；抗PARP1（1:100；钙生物化学）；抗p53（1:2000；癌基因）；抗beclin1（1:1000）、抗p21（1:11000；BD Biosciences）；抗HMGB1（1:500；Abcam）；抗LC3（1:100；抗体）；抗ATG7（1:200）、抗TSC2（1:1000）、抗P-TSC2（1:1000）、抗ACC（1:1000）、抗P-ACC（1:1000）、抗Akt（1:1000）、抗P-Akt（1:1000）、抗P-p53（Ser 15）（1:1000）、抗AMPKα（1:1000）、抗P-AMPKα（1:1000）、抗p70-S6K（1:1000）、抗P-p70-S6K（1:2000）、抗IKKβ（1:1000）、抗P-IKKα/β（1:1000）、抗aspase-3（1:1000），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（1:1000）、抗P-IκBα（1:1000；抗MDM2（1:1000）、抗β-肌动蛋白（1:3000；圣克鲁斯生物技术公司）；抗p62（1:1000；Sigma-Aldrich）；用于染色质免疫沉淀的抗RelA抗体（1:1000）和兔对照IgG抗体（1:100）来自Santa Cruz Biotechnology。用于细胞周期分析的抗-BrdU（1:20）来自eBioscience。使用的试剂为：小鼠TNFα（1000 U ml—1; Peprotech）；IKKβ抑制剂SC-514（20或100μM；钙生物化学）；z-VAD（z-VAD）fmk公司（50μM；亚历克西斯）；MG132（0.5或50μM）、3-甲基腺嘌呤（5 mM）、氯喹（5μM），二甲双胍（2 mM），巴非霉素A1（100 nM），柔红霉素（5μM），环己酰亚胺（0.1μg ml–1或10μg ml–1; Sigma-Aldrich）；雷帕霉素（100 nM；钙生物化学）；BrdU（罗氏）；7-AAD（BD生物科学）。用于线粒体耗氧量分析的抗霉素（1μM）和鱼藤酮（1μM）来自Sigma-Aldrich。
细胞培养与慢病毒感染
早期通过RelA公司−/−,RelA公司+/+,第53页−/−和第53页+/+使用标准方法从14天龄小鼠胚胎中获得MEF，并用于第（p）1代至第5代。不朽的野生型和RelA公司−/−先前描述了MEF34.不朽Bax公司−/−/贝克−/−MEF由C.B.Thompson提供。CT-26野生型小鼠结肠癌细胞系购自ATCC。细胞在补充有10%胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich）、抗生素（100μg ml−1青霉素和100μg ml−1链霉素）和1 mM谷氨酰胺。对于葡萄糖饥饿，早期传代MEF在不含葡萄糖（含谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）的DMEM中培养，补充10%透析的FBS（Sigma-Aldrich）、抗生素和2 mM丙酮酸纳。用永生MEF在相同的无葡萄糖DMEM中进行葡萄糖饥饿，补充10%FBS、抗生素和2 mM丙酮酸钠，在6 mM的存在下d日-葡萄糖，除非另有规定。用CT-26野生型细胞对永生化MEF进行葡萄糖饥饿，在14mM的存在下d日-葡萄糖。为了去除血清，细胞在不含葡萄糖的DMEM中培养，补充抗生素和2 mM丙酮酸钠，不含FBS。如前所述，在HEK293T细胞和慢病毒感染中生产高滴度慢病毒制剂34,35.
慢病毒载体
使用的靶向shRNAs列于补充表SI.编码特定于电子GFP萤火虫荧光素酶与小鼠RelA公司(RelA公司shRNA）、caspase-8、beclin1、，第7页,第53页(第53页shRNA，第53页-慢病毒载体pLentiLox3.7的BamHI和HpaI限制位点之间引入了2 shRNA）、laminA/C和亲环素B以及对照非特异性序列ns和ns2(参考35). 表达增强型红色荧光蛋白（eRFP）的pLentiLox3.7变异体（pLL–red）用于传递非特异性和RelA公司-针对永生化MEF的特定shRNAs补充图S3e小鼠特异性shRNAs的DNA编码序列葡萄糖转运蛋白1（也称为Slc2a1系列),谷氨酸3（也称为Slc2a3公司),第2页或范围2，以及其他RelA公司-特定序列，RelA公司-2 shRNA和RelA公司-pLKO.1慢病毒载体中的3 shRNA和对照序列shc003v购自Sigma-Aldrich。表达eGFP的pWPT慢病毒载体已在前面描述过36.人类全长互补DNAH-Ras（V12），人类RelA公司和鼠标第53页在pWPT的BamHI和SalI限制位点之间引入，以取代eGFP。小鼠的cDNA范围2和生命周期3分别购自Eurofins MWG Operon和从K.Ryan获得，然后在pWPT的相同限制性位点之间克隆。
葡萄糖、乳酸、ATP和氧气的测量
如前所述测量葡萄糖消耗、乳酸分泌和细胞内ATP水平13,14简单地说，将细胞接种到60mm的组织培养皿上，6小时后更换培养基，并在正常培养基（基础测定）或不含或低葡萄糖的培养基（葡萄糖饥饿）中培养48小时后进行检测。根据制造商的说明，分别使用葡萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒II（Biovision）测量培养基中的葡萄糖和乳酸浓度。通过从最初的25 mM葡萄糖浓度中减去培养基中测得的葡萄糖浓度来推断葡萄糖消耗量。根据制造商的说明，使用ATP生物发光体细胞分析试剂盒（Sigma-Aldrich）测定细胞裂解液中的细胞内ATP水平。使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪测量24孔板中的摄氧量9细胞接种于2–5×1048.3 g l中每孔的细胞数−1补充有200 mM谷氨酸Max-1、100 mM丙酮酸钠、32 mM氯化钠和40μM酚红的DMEM基培养基（pH 7.4），在25 mM（基础测定）或6 mM（葡萄糖饥饿）葡萄糖存在下，连续测量耗氧量，如前所述9用抗霉素（1μM）加鱼藤酮（1μM）处理后细胞中的剩余氧消耗减去线粒体耗氧率。所有值最终在每个单元的基础上进行归一化。
软黄菌落分析
使用标准方法评估软黄菌落形成14简而言之，早期传代的MEF感染了所示的病毒，6天后以2×10的密度倾倒4每个培养皿中的细胞与0.5%琼脂糖F12培养基一起放置在60mm组织培养皿中相同培养基中预先固化的0.5%琼脂酶底层上。3周后评估菌落形成。
细胞死亡和宏观自噬分析
如前所述，细胞活力和HMGB1细胞外释放分别通过台盼蓝排除试验和western印迹法进行评估34,37HMGB1评估在培养基和细胞组分中进行。为了进行宏观自噬分析，细胞被pWPT–eGFP–LC3感染，表达LC3的eGFP融合蛋白，如前所述监测eGFP-LC3易位38用倒置Leica SP5共聚焦显微镜对100个细胞进行计数，并对那些有间断性而非弥漫性eGFP–LC3荧光迹象的细胞进行阳性评分，从而对大自噬囊泡进行量化。
细胞周期分析
如前所述，使用BrdU和7-AAD标记进行细胞周期分析39简单地说，早期传代或永生化MEF以1×10的密度播种6在100 mm的组织培养皿中，每个培养皿中的细胞在24 h后要么未经处理，要么进一步遭受葡萄糖饥饿（分别为0 mm和6 mm葡萄糖）48 h。然后用BrdU（30μM）培养细胞3 h，胰酶化，固定在70%乙醇中，并用2N HCl和0.5%Triton X-100渗透，然后在0.1 M硼酸钠中中和。最后用FITC-标记的抗BrdU抗体和7-AAD对样品进行染色，并使用FACS Caliber（Beckman）采集荧光信号。
定量实时聚合酶链反应
使用Trizol提取总RNA，并使用PureLink RNA迷你试剂盒（Invitrogen）纯化总RNA。添加RNA（1μg）作为模板，以使用GeneAmp RNA PCR试剂盒（Applied Biosystems）进行反转录酶反应。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）对得到的cDNA进行三份定量实时PCR（qRT-PCR），引物列于补充表SII和ABI 7900实时PCR机器。将实验Ct值归一化为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT），并计算相对mRNA表达量与参考样品。
染色质免疫沉淀
如前所述进行染色质免疫沉淀40.短暂、无刺激、TNF治疗和葡萄糖缺乏永生RelA公司−/−野生型MEFs在室温下用1%甲醛处理10分钟，以交联蛋白质-DNA复合物；然后使用125mM甘氨酸猝灭反应。染色质提取物用生物破坏者声波仪（Diagenode）进行声波处理，蛋白质-DNA复合物用抗RelA或兔对照IgG抗体进行免疫沉淀。然后使用抗RelA和IgG沉淀物以及下列引物进行定量PCR（qPCR）分析补充表SII，包括第53页和IκBα启动子或控制基因组区域（对照1–3），以评估RelA DNA结合特异性。RelA特异性DNA结合是相对于对照IgG产生的背景信号进行计算的，并表示为折叠变化。
小鼠同种异体移植
早期传代CT-26野生型细胞表达非特异性或RelA公司收集shRNAs，用PBS洗涤两次，然后在PBS中以1×10的浓度重新悬浮6细胞ml−1在皮下接种到两侧之前（右侧的非特异性shRNA细胞，以及RelA公司-左侧shRNA细胞；1 × 105裸鼠（6周龄雌性；Charles River）。二甲双胍溶于PBS（50 mg ml−1)从肿瘤细胞注射后第3天开始每天腹腔注射（250mg×kg体重）。对照组接受PBS，使用相同的给药时间表和给药途径。肿瘤体积（mm三)每周在指定时间测量两次，并使用以下公式根据卡尺测量值进行估算：体积=A类×B类2/2（带A类直径较大，以及B类肿瘤直径较小）。实验由英国内政部管理局（英国剑桥；PPL 70/6874）进行。
统计分析
结果表示为图图例中所示适当数量样品的平均值±标准偏差。学生的t吨-检验用于确定统计显著性。
