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公共科学图书馆一号。2012; 7（9）：e46307。
2012年9月27日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0046307
预防性维修识别码：下午345908
PMID：23029472

排斥导向分子（RGM）家族蛋白显示骨形态发生蛋白（BMPs）的差异结合动力学

吴启芳, Chia Chi Sun先生, 赫伯特·Y·林,和朱迪·巴比特*
Efthimios M.C.Skoulakis，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

骨形态发生蛋白（BMP）是转化生长因子β超家族的成员，通过I型和II型丝氨酸苏氨酸激酶受体和SMAD细胞内信号通路发挥作用，调节多种生物过程。最近，我们发现排斥导向分子（RGM）家族，包括RGMA、RGMB和RGMC/血球蛋白（HJV），作为共同受体发挥作用，增强细胞对BMP配体的反应。在这里，我们使用表面等离子体共振定量RGM蛋白与BMP配体的结合动力学。我们发现，在RGM中，HJV对BMP6、BMP5和BMP7与K的亲和力最高D类分别为8.1、17和20 nM，而RGMB为28、33和166 nM，RGMA为55、83和63 nM。相反，RGMB优先结合BMP4和BMP2与KD类HJV分别为2.6和5.5 nM，RGMA分别为4.5和9.4 nM，而RGMA对大多数BMP的结合亲和力最低。在BMP配体中，RGM对BMP4的相对亲和力最高，对BMP7的相对亲和力最低，而没有RGM与BMP9结合。因此，RGM对BMP配体的不同亚群表现出优先结合。HJV对BMP6的优先结合与HJV和BMP6在调节系统铁稳态中的功能作用一致。我们的数据可能有助于解释BMP通过有限数量的I型和II型受体发挥细胞-基质特异性作用的机制。

介绍

骨形态发生蛋白（BMP）是由40多个成员组成的转化生长因子β（TGF-β）超家族的一个亚家族[1]虽然由于BMP/TGF-β信号通路成分的功能丧失导致频繁的胚胎死亡或主要器官畸形，其在发育过程中的作用最为突出，但BMP/TGFβ超家族信号在出生后的生活中的作用越来越被人们认识[2].

BMP/TGF-β超家族成员通过与两种I型和II型丝氨酸苏氨酸激酶受体的复合物结合，刺激细胞内SMAD蛋白的磷酸化，从而发挥其作用，SMAD蛋白与共同介导物SMAD4复合并转位到细胞核以调节基因转录[1]–[2]到目前为止，已经描述了7种I型受体（4种为BMP亚家族）和5种II型受体（3种为BMP-亚家族）。一般来说，BMP通过SMAD蛋白的一个子集（SMAD1、SMAD5和SMAD8）发出信号，而TGF-β配体通过另一个子集发出信号（SMAD2和SMAD3）[1]–[2]其他非经典信号级联也可以被激活，但其分子机制还不太清楚[1]–[2]该领域的一个重要问题是，BMP/TGF-β超家族如何通过有限数量的I型和II型受体以及细胞内SMAD蛋白发挥细胞间特异性效应。

最近，我们发现了一个新的蛋白质家族，即排斥导向分子（RGM）家族，该家族作为BMP信号通路的共同受体发挥作用[3]–[5]该家族由3个成员组成，RGMA、RGMB和RGMC（也称为血球蛋白，以下简称HJV），它们具有50-60%的氨基酸特性和类似的结构特征，包括N末端信号肽、蛋白水解裂解位点、部分血管性血友病因子D型结构域和糖磷脂酰肌醇（GPI）锚定[6]–[11]我们之前已经证明，所有RGM都与BMP配体和BMP I型和II型受体结合，以增强细胞内SMAD磷酸化和BMP-SMAD靶基因转录，从而对BMP配子作出反应[3]–[5]已经假设RGM蛋白的表达使细胞能够选择性地响应低水平的BMP配体[3]–[5]至少RGM家族的一些成员也被证明以可溶性形式从细胞中释放出来（缺少GPI锚定）[8]–[9],[12]–[17]和可溶性RGM蛋白可以通过隔离BMP配体作为BMP信号通路的抑制剂[3],[18]–[19].

RGM家族成员在广泛的组织中有不同的表达，并被认为具有不同的生物学作用，包括排斥性轴突引导（产生家族名称）、神经管闭合、神经元分化、细胞存活、损伤后轴突再生、免疫、炎症、，和铁稳态调节[2]–[11],[20]–[33]其中一些生物作用取决于RGM家族成员的BMP信号功能[5],[7],[18]–[21],[32]–[33]而其他似乎独立于RGM的BMP信号功能[23]–[24],[26]–[30].

HJV在RGM家族中具有最典型的生物学作用，这取决于其作为BMP共受体的功能。编码HJV的基因突变导致人类和小鼠的铁超载障碍性幼年血色素沉着症，这是肝脏BMP-SMAD信号受损和主要铁调节激素庚啶缺乏的直接结果[5],[7],[20]–[21]编码配体BMP6的基因突变进一步支持了BMP-SMAD途径在hepcidin调节和系统铁平衡中的中心作用[18],[34]、BMP I型受体ALK2和ALK3[35]，或通用指示器SMAD4[36]所有这些都会导致肝素缺乏和铁超载，类似于HJV公司突变。此外，BMP-SMAD信号通路的药理学调节剂调节正常小鼠的hepcidin表达和全身铁平衡[18]–[19],[37]，并在动物模型中改善由于铁调素缺乏引起的铁过载和由于铁调素过量引起的贫血[38]–[39].

有趣的是，使用缺乏GPI锚定的可溶性RGM蛋白融合到人类IgG（RGM.Fc）的Fc尾部进行的结合竞争和生物抑制试验的间接证据表明，RGM蛋白并没有以相同的亲和力与所有BMP配体结合[3]–[5],[18]–[19],[40]细胞培养系统中的生物检测也表明RGM优先利用一些BMP配体[4]–[5],[40]–[42]RGMs与BMP配体的差异结合可以深入了解其生物学功能，以及BMPs产生细胞特异性效应的机制。在这里，我们使用表面等离子体共振（SPR）定量RGM蛋白与广泛的BMP配体（包括BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7和BMP9）的结合动力学。

材料和方法

表面等离子体共振（SPR）

除BMP9外，所有SPR动力学实验均在Biacore T200（GE Healthcare）上进行，BMP9是在早期型号BiacoreT100（GE healthcares）上进行的。重组人BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9、RGMA、RGMB、HJV（RGMC）和ALK1-Fc是从R&D Systems获得的无载体形式。BMPs、RGMs和ALK1-Fc在无菌PBS中重建为1µg/µl储备溶液，但BMP6除外，BMP6是在研发系统的乙腈和TFA溶液中提供的，浓度为0.535µg/m l至0.788µg/ml，如制造商所示。

根据制造商的协议（GE Healthcare），将BMP2、BMP4、BMP5、BMP6和BMP9在pH 4.5的醋酸钠中稀释并通过胺偶联方法固定在CM5传感器芯片上。BMP7使用相同的协议固定在CM4传感器芯片上。流动细胞2至4用配体固定，流动细胞1被同等处理，但没有蛋白质作为对照。配体的固定化水平在50到300 RU之间，根据经验确定，以优化每个动力学相互作用并降低质量传输限制。使用低固定化水平以尽量减少可能的质量运输限制，每个测试的相互作用至少使用2种不同的固定化水平。在所有情况下，从不同固定水平获得的数据没有显著差异。分析物（RGMA、RGMB、HJV和ALK1-Fc）在运行缓冲液HBS-EP+（GE Healthcare）中以2 nM至1200 nM的浓度进行稀释，通常会有五次2倍的浓度升高，最高浓度约为K的10倍D类，根据需要偶尔变化以提高贴合度。分析物以30µl/min的流速通过所有通道注入，该流速是从质量传输限制试验中选择的，以最小化质量传输限制，高于该流速时，进一步增加对结合曲线没有显著影响。在每次多循环运行结束时，重复运行中浓度，以确认每次运行期间表面的稳定性。关联和分离时间通常为240秒和480秒，偶尔修改以优化每个交互作用。每次注射循环后，传感器表面都会再生，以允许表面和新鲜配体在下一个循环中相互作用。通过在50µl/min的流速下以甘油-HCl pH 2.2（GE Healthcare）进行30秒的再生考察，然后稳定30秒，优化再生条件。

从流式细胞1对照中减去流式细胞2、3和4的传感器图。动力学拟合采用Biacore T200评估软件，采用1∶1 Langmuir结合模型（A+B=AB）进行全局拟合。动力学数据计算为K在（关联率），K远离的（离解率）和KD类（K）D类 = K（K）远离的/K（K）在). 根据Biacore T200评估软件提供的几个统计测量值的建议范围（包括χ）对每次SPR运行进行评估2（测量模型与实验数据的拟合程度）；U值（表示参数是否唯一确定）；tc（质量运输限制措施）；和T值（类似于拟合参数值的信噪比）。所有实验重复4-9次。

荧光素酶测定

生成可溶性RGMA和HJV（缺少GPI锚）融合到人类IgG的Fc部分（RGMA.Fc和HJV.Fc）[4],[19]并净化[19]如前所述。用hepcidin启动子萤火虫荧光素酶构建物转染肝癌衍生的Hep3B细胞[5]和对照Renilla荧光素酶载体（pRLTK，Promega）。将转染的细胞单独与BMP配体（5 ng/ml BMP9、50 ng/ml BMP5或25 ng/ml BMP2、BMP4、BMP6或BMP7）孵育，或与BMP配体加0.2至50µg/ml RGMA孵育。Fc或HJV。Fc，然后通过双荧光素酶分析（Promega）测量相对荧光素素酶活性，如前所述[19].

统计

统计显著性通过单向方差分析（ANOVA）确定，采用Bonferroni或Dunnett的事后检验进行配对多重比较，如图所示。使用Prism 4.0（加州La Jolla）统计软件和P（P）<0.05被认为是显著的。

结果

与RGMA和RGMB相比，HJV表现出与BMP6/BMP5/BMP7亚家族的优先结合，与BMP6的亲和力最高

我们之前已经证明HJV与BMP6结合，并且Bmp6型敲除小鼠表现出与Hjv公司敲除小鼠表明BMP6是HJV在调节hepcidin表达和全身铁平衡中的重要内源性配体[18],[34]因此，我们使用表面等离子共振（SPR）定量了HJV与BMP6的结合动力学。结果与其他RGM家族成员（RGMA和RGMB）与BMP6的结合进行了比较。结果还与密切相关的BMP5和BMP7配体进行了比较，这些配体与BMP6在成熟区共有71-80%的氨基酸同源性，构成了BMP配体的一个亚家族[43].平均值KD类，K在、和K远离的每种相互作用的4-9个实验报告于图1和图2，而代表性的传感器图如所示图S1,图S2、和图S3.

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RGM蛋白与BMP配体的结合亲和力。

(A类)结合亲和力（KD类 = K（K）远离的/K（K）在)通过表面等离子共振测量每个BMP配体的每个RGM蛋白，并绘制为平均值±SD（每组4–9个）。平均KD类BMP2和BMP4的RGM蛋白的±SD也显示为插图，以更好地显示其较低的KD类值。平均值KD类以数字形式报告(B类). (A类)黑条：HJV；灰色条：RGMB；白色条：RGMA。通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验（post-hoc test）确定3种RGM蛋白与每个BMP配体结合的统计显著性（*所有比较均显著(P（P）<0.05)). 为了比较5种BMP配体与每个RGM蛋白的结合情况，使用了Bonferroni事后检验的单向方差分析（#所有比较都是显著的(P（P）<0.05); $ 并非所有的比较都是显著的：对于HJV，BMP配体之间的所有配对比较都是重要的，BMP2除外对骨形态发生蛋白6；对于RGMB，除了BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP4和BMP5对BMP6；对于RGMA，除了BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP4、BMP5对BMP7和BMP6对BMP7。

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关联率(

K（K）在 )和离解率(K（K）远离的 )RGM蛋白和BMP配体之间。关联率（K在,A类)，和离解率（K远离的,B类)通过SPR测量每个RGM蛋白和每个BMP配体之间的差异，并绘制为平均值±SD（每组4–9个）。黑条：HJV；灰色条：RGMB；白色条：RGMA。统计显著性的确定如图1对于每个BMP配体的3个RGM蛋白之间的比较：*所有比较都是显著的(P（P）<0.05); & 如下所述，并非所有比较都是显著的；NS所有比较均不显著(P（P）>0.05). 对于每个RGM蛋白的5个BMP配体之间的比较：#所有比较都是显著的(P（P）<0.05); $ 如下所述，并非所有比较都是显著的。(A类)$：对于HJV，除BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP6、BMP5对BMP6和BMP5对骨形态发生蛋白7；对于RGMB，除了BMP5外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对骨形态发生蛋白6；对于RGMA，除了BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP5.&：对于BMP7，除HJV与RGMA外，所有两两比较均显著(B类)$：对于HJV，除BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都很重要对BMP5、BMP4对BMP5、BMP4对BMP6和BMP5对骨形态发生蛋白6；对于RGMB，除了BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP7和BMP5对BMP6；对于RGMA，除了BMP2外，BMP配体之间的所有成对比较都是显著的对BMP4、BMP2对BMP7、BMP4对BMP7和BMP6对BMP7.&：对于BMP7，除RGMB外，所有成对比较均显著对RGMA；对于BMP2，除RGMA外，所有两两比较均显著对RGMB；对于BMP4，除RGMB外，所有两两比较均显著对HJV。

如所示图1HJV与BMP6结合，亲和力高（KD类8.1毫微米）。相比之下，RGMB和RGMA与BMP6结合的亲和力大约低3.5倍和5倍（KD类分别为28 nM和55 nM）(图1). HJV对BMP6的高亲和力是由于与其他RGM蛋白相比，HJV的结合速度更快，解离速度较慢(图2).

HJV与BMP5结合，亲和力约低2倍（KD类17 nM）比BMP6(图1). 这种低亲和力主要是由于HJV与BMP5的结合率比BMP6慢(图2). 与BMP6的结果类似，RGMB和RGMA与BMP5结合的亲和力约低2倍和5倍（KD类分别为33 nM和83 nM），与HJV相比(图1). RGMB与BMP5的结合类似于BMP6，而RGMA与BMP6的亲和力较低，主要是因为其解离速度更快(图2).

与BMP6或BMP5相比，所有RGM蛋白对BMP7的亲和力都较低或相当(图1). 这主要是由于较慢的缔合速率，尽管RGM，特别是HJV，也倾向于BMP7的离解速率较慢(图2). 这些较慢的动力学和对更高浓度分析物的需要导致BMP7-RGM相互作用在CM5传感器芯片上的拟合较差，因此必须使用CM4传感器芯片进行这些相互作用，从而得到合理的拟合。作为对照，我们在CM4传感器芯片上获得了与CM5传感器芯片类似的BMP6-HJV相互作用结果（数据未显示）。在RGM中，HJV对BMP7的亲和力最高（KD类20 nM），其次是RGMA和RGMB（KD类分别为63 nM和166 nM）(图1). 这主要是由于BMP7的HJV解离速度非常慢(图2).

与HJV和RGMA相比，RGMB表现出与BMP2/BMP4亚家族的优先结合，与BMP4的亲和力最高

接下来，我们测试了另一个BMP配体主要亚家族BMP2和BMP4的RGM蛋白结合动力学，它们彼此具有86%的氨基酸同源性，但在成熟区域仅与BMP6/BMP5/BMP7亚家族具有54–60%的同源性[43].平均值KD类，K在、和K远离的每种相互作用的4-9个实验报告于图1和图2，而代表性的传感器图如所示图S4和图S5.

如所示图1在RGM（KD类5.5毫微米）。这比RGMB对BMP6/BMP5/BMP7亚家族的亲和力高约5-30倍(图1)，主要是因为更快的关联率(图2). HJV在RGM家族（KD类9.4 nM），比RGMB低1.6倍，比RGMA高2.5倍(图1). 与RGMB相比，HJV对BMP2的亲和力与HJV与BMP6的结合亲和力几乎相同(图1). 与大多数其他测试的BMP相似，RGMA对BMP2（KD类22毫微米，图1)，主要是因为与其他RGM相比关联率较慢(图2). RGMA与RGMB相似，与BMP6/BMP5/BMP7亚家族相比，RGMA优先结合BMP2，约高2-4倍(图1). 这是因为与BMP6/BMP5/BMP7亚家族相比，RGMA对BMP2的分离速度较慢，关联速度更快(图2).

RGM家族成员对BMP4的相对亲和力与BMP2非常相似(图1). RGMB对BMP4（KD类2.6 nM），约为HJV（K）的2倍D类4.5 nM），比RGMA（K）高5-6倍D类14毫微米）(图1). 有趣的是，与其他测试的BMP相比，BMP4对所有RGM蛋白的亲和力最高(图1)主要是由于更快的关联率，以及在较小程度上，较慢的分离率(图2). 所有RGM对BMP4的亲和力约为BMP2的2倍（尽管RGMA或RGMB的这种差异在统计学上并不显著）。与BMP2的结果类似，与BMP6/BMP5/BMP7亚家族相比，RGMB对BMP4表现出强烈的优先结合，约为其10到64倍(图1)，主要是因为更快的关联率(图2). 与BMP6/BMP5/BMP7亚家族相比，RGMA对BMP4表现出中间优先结合，约为4-6倍(图1)由于更快的关联率和较慢的分离率的结合(图2). HJV与BMP4结合的亲和力仅为BMP6/BMP5/BMP7亚家族的2-4倍(图1)，主要是由于更快的关联率(图2).

RGM家族成员不绑定BMP9

BMP9与BMP2、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7具有50-55%的氨基酸同源性[44]，并且已经证明可以刺激培养的肝源性细胞中hepcidin的表达[19]因此，我们使用SPR测试了HJV和其他RGM家族成员对BMP9的结合动力学。与其他测试的BMP配体相比，BMP9没有与任何RGM家族的成员结合(图S6A–C）。作为阳性对照，BMP9能够与BMP I型受体ALK1的可溶性部分结合，与人类IgG（ALK1-Fc，图S6D)如前所述[45].

可溶性RGM蛋白与人IgG（RGM.Fc）Fc部分融合选择性抑制BMP配体的生物活性

为了通过SPR测量RGM家族成员对BMP配体的相对结合亲和力，我们测试了可溶性RGMA的能力。Fc融合蛋白在细胞培养系统中抑制BMP配体的生物活性。HJV的类似数据此前已发布。Fc和RGMB。Fc公司[18]–[19]。这些RGM的机制。Fc融合蛋白通过结合和螯合BMP来阻止它们与细胞表面BMP受体相互作用，从而抑制BMP的生物活性[19]我们研究的骨形态发生蛋白配体的生物活性是通过双荧光素酶测定在肝癌衍生的Hep3B细胞中诱导hepcidin启动子活性的能力，我们之前已经对其进行了很好的表征[19].

RGMA公司。Fc对BMP4和BMP2的生物活性抑制最为强烈，对BMP5、BMP6和BMP7的抑制作用较小，而对BMP9无抑制作用(图3A). 在面对面的比较中，HJV。Fc比RGMA更有效。Fc抑制BMP6的生物活性(图3B). 细胞培养系统中的这些功能数据支持SPR测量的相对结合常数(图1).

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可溶性RGMA。Fc选择性抑制BMP诱导铁调素启动子萤光素酶活性。

(A类)用hepcidin启动子萤火虫荧光素酶构建物和对照Renilla pRL-TK载体转染Hep3B细胞。转染细胞与5 ng/ml BMP9、50 ng/ml BMP5或25 ng/ml的BMP2、BMP4、BMP6或BMP7配体单独孵育，或与BMP配体加0.2至50µg/ml RGMA孵育。Fc如图所示，然后测量相对荧光素酶活性。(B类)Hep3B细胞转染如面板所示A类。转染细胞与25 ng/ml BMP6配体或25 ng/ml BMP6配体加0.2至50µg/ml RGMA单独孵育。Fc或HJV。Fc，随后测量相对荧光素酶活性。(A–B)结果报告为BMP配体与RGMA联合处理的细胞相对荧光素酶活性下降百分比的平均值±SD。Fc或HJV。Fc与仅用BMP配体处理的细胞进行比较（每组3-4个）。

讨论

在这里，我们使用SPR对BMP共受体RGM家族和BMP配体之间的结合相互作用进行了首次全面的定量比较。我们证明，RGM蛋白对BMP2、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7配体表现出广泛的结合亲和力，范围从2.6 nM到166 nM，并且没有RGM与BMP9结合。所有RGM蛋白共有的一个特征是与各种BMP配体的优先结合顺序。所有RGM对BMP4的结合亲和力最高，其次是BMP2、BMP6、BMP5和BMP7，而没有一个RGM与BMP9结合。然而，RGM蛋白之间的一个显著差异是HJV对BMP6/BMP5/BMP7亚家族的结合亲和力显著高于RGMB和RGMA，并且非常接近HJV与BMP4和BMP2的结合亲和力。相反，与BMP4/BMP2亚家族和HJV相比，RGMB和RGMA与BMP6/BMP5/BMP7亚家族的结合较弱。

BMP2与所有RGM家族成员之间的相互作用以及BMP4与RGMA的结合亲和力在之前的4项研究中都有报道[3],[40],[46]–[47]其中3项研究的一个重要限制是RGM的使用。Fc融合蛋白，形成二聚体[3],[40],[46]，而我们使用单体蛋白质，因为HJV被预测为单体[47]因此，这些先前研究的结果可能会被亲和力效应所混淆。先前的一项研究通过SPR测量了单体HJV与BMP2的结合亲和力[47]并报告了15倍的低亲和力（KD类140 nM）。然而，杨等。使用基于平衡的结合分析[47]而不是我们研究中的结合动力学，在他们的研究中可能没有实现真正的平衡。

本研究中通过SPR测量的相对结合常数与先前关于RGM蛋白与BMP配体的结合以及RGM和RGM的生物活性的研究基本一致。细胞培养系统中的Fc融合蛋白[3]–[5],[18]–[19],[40]–[42].无细胞碘化蛋白相互作用和下拉分析先前已证明所有RGM与BMP2和BMP4结合，HJV与BMP6结合[3]–[5],[18]对于所有RGM，过冷的BMP7无法竞争与BMP2和BMP4的结合，这表明RGM与BMM2和BMP4的结合优先于BMP7[3]–[5]，与本研究结果一致。

先前的研究也表明，在细胞培养系统中，编码每个RGM的cDNA转染增加了BMP2和BMP4信号，但不增加BMP7信号[3]–[5],[40]–[42]此外，编码HJV（而非RGMA或RGMB）的cDNA转染在细胞培养系统中介导BMP6信号传导，该系统表达高水平内源性BMP6[40]–[42]因此，所有RGM都可以介导BMP2和BMP4信号传导，HJV可以在细胞培养系统中介导BMP6信号传导，这与本研究中SPR测得的这些相互作用的最高结合亲和力一致。

使用可溶性RGM对肝癌衍生细胞培养物进行生物抑制分析。Fc融合蛋白能抑制BMP配体介导的庚肽启动子荧光素酶活性，此前已证明HJV。Fc对BMP4、BMP2、BMP6和BMP5的抑制作用最强，对BMP7的抑制作用较小，对BMP9没有抑制作用[19]，而RGMB。Fc对BMP4和BMP2的抑制作用最强，对BMP6、BMP5和BMP7的抑制作用较小，而对BMP9无抑制作用[18]在面对面的比较中，HJV。Fc对BMP6的抑制作用强于RGMB。Fc公司[18]。以及使用RGMA的生物抑制数据。Fc此处(图3)，这些数据总体支持本研究中SPR测量的相对结合亲和力(图1). 这些数据还进一步揭示了外源性RGM的潜在治疗作用。Fc蛋白作为选择性BMP信号通路抑制剂。例如，HJV。以前已经证明Fc可以抑制BMP介导的hepcidin表达并提高铁的利用率体内 [18]–[19],[39]这些数据也可能揭示内源性可溶性RGM蛋白作为选择性BMP途径抑制剂的功能作用，尤其是HJV，HJV在循环中的可测量水平[12],[48]–[50].

有趣的是，在当前的研究中，所有RGM都被证明通过SPR与BMP7结合，而在碘化蛋白相互作用研究中，BMP7无法与BMP2和BMP4竞争RGM结合[3]–[5]，RGM在细胞培养系统中未被证明增加BMP7信号[40]–[42]和RGM。在hepcidin启动子荧光素酶细胞培养检测中，Fc蛋白仅显示出有限的抑制BMP7生物活性的能力(图3)[18]–[19]这对于HJV尤其显著，其中HJV-BMP7相互作用的总亲和力仅比SPR的HJV-BMP6相互作用的亲和力低约2.5倍，而HJV。在hepcidin启动子荧光素酶分析中，Fc对BMP7的抑制作用远不如BMP6[19]对这些差异的一种解释是RGM-BMP7相互作用的缓慢动力学。SPR测定的HJV-BMP7相互作用总亲和力相对较高的原因是分离速度非常慢。然而，所有RGM-BMP7相互作用的结合率都非常缓慢，这种缓慢的结合率可能是限制RGM-BMP 7相互作用在结合竞争和细胞培养分析中任何明显生物活性的因素。其次，使用二聚RGM可能会产生亲和力效应。Fc融合蛋白用于生物抑制试验，而RGM单体用于SPR。此外，生物试验中RGM与溶液中BMP配体的结合特性可能与与SPR中传感器芯片共价结合的BMP配体不同。最后，BMP7不能竞争BMP2和BMP4结合也可以用RGM上BMP7和BMP2/BMP4的结合位点不重叠来解释。未来的研究将需要描述RGM上精确的BMP结合域，以及通过SPR测量RGM结合BMP7的能力是否与任何生物活性相关。

在RGM中，HJV对BMP6的结合亲和力最高，为8.1 nM。这与显示可溶性HJV的生物抑制试验的数据一致。Fc融合蛋白比RGMB更强烈地抑制BMP6对铁调素启动子萤光素酶活性的诱导。Fc公司[19]和RGMA。Fc公司(图3). 这也与已知的HJV和BMP6的生理作用相一致体内调节肝脏hepcidin表达和全身铁平衡[5],[7],[18]–[21],[34]事实上，HJV的表达对于BMP6介导的hepcidin诱导对铁的反应至关重要，因为其亲和力相对较低（KD类已证明参与该过程的BMP I型和II型受体的BMP6（1.6至39µM）[41],[51]我们假设肝细胞中HJV的表达能使这些细胞对低水平的BMP6产生特异性反应，而BMP6是肝脏对铁刺激肝细胞表达的反应。RGMB和RGMA对BMP6的亲和力显著降低，这可能有助于解释为什么这些蛋白不能补偿HJV在调节庚肽表达和系统铁平衡方面的损失。值得注意的是，HJV与BMP2和BMP4的结合亲和力比BMP6高2倍或2倍。此外，与RGMB和RGMA相比，HJV还表现出与BMP5和BMP7的优先结合。这些数据增加了HJV也可能通过与一个或多个其他BMP配体结合来调节信号传导的可能性。有趣的是，BMP2最近被推测在多发性骨髓瘤中上调hepcidin表达中起作用[52].

RGMB基因敲除小鼠表现出出生后早期死亡，证实了RGMB的重要生物学功能，但这种过早死亡的原因尚不清楚[32]RGMB也与损伤后轴突再生有关[33]，免疫细胞中炎症细胞因子表达的调节[32]肾小管紧密连接形成和跨上皮阻力[42]，所有这些似乎都由RGMB的BMP信号功能介导[32]–[33],[42]值得注意的是，BMP4和BMP2配体参与了这些过程[32]–[33],[42]与HJV、RGMA和其他BMP配体相比，RGMB对BMP4和BMP2具有优先亲和力。

RGMA已被证明能介导排斥性轴突导向（产生家族名称）、神经管闭合、神经元分化、细胞存活、炎症和免疫细胞功能[2],[6],[9],[22]–[31]许多这些作用取决于与新生素的相互作用，新生素是结肠癌中缺失的netrin受体的同源物[23]–[24],[26]–[30]而RGMA的BMP信号功能与其所观察到的生物作用没有明确联系。值得注意的是，相对于其他RGM家族成员，RGMA对大多数测试的BMP配体表现出最低的亲和力，除了与RGMB相比对BMP7的亲和力略高（这是测量到的2种最低的亲和力相互作用）。因此，与其他RGM蛋白相比，RGMA作为BMP共受体的作用可能不太显著。然而，RGMA与BMP4/BMP2亚家族的结合亲和力仍低至14nM至23nM，这为RGMA的BMP信号功能提供了可能的生理作用。

总之，BMP共受体RGM家族的成员对不同的BMP配体亚群表现出优先结合。与其他RGM相比，HJV与BMP6结合的亲和力最高，这与HJV介导的BMP6信号在调节铁稳态中的重要生理作用一致。这些数据为BMP信号精细调节以发挥细胞特异性效应的机制提供了重要见解。

支持信息

图S1

利用SPR进行BMP6和RGM蛋白之间动力学实验的代表性传感器图。（A）HJV蛋白在流动缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（6.25、12.5、25、50和100 nM），并通过密度为87.5 RU的BMP6固定的CM5芯片注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（18.75、37.5、75、150和300 nM），并通过BMP6固定的CM5芯片以287.3 RU的密度注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（30、75、150、300和600 nM），并通过BMP6固定的CM5芯片以150 RU的密度注入。（A–C）颜色线表示根据1∶1朗缪尔结合模型绘制的拟合曲线，黑色线表示实验曲线。动力学数据（KD类，K在、和K远离的)和质量控制参数（χ2，U，T（K在)和T（K远离的))如各传感器图下表所示。

（畅通节能法）

图S2

利用SPR进行BMP5和RGM蛋白之间动力学实验的代表性传感器图。（A）HJV蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（10、20、40、80和160 nM），并通过BMP5固定的CM5芯片以287.4RU的密度注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（12.5、25、50、100和200 nM），并通过BMP5固定的CM5芯片以527.5 RU的密度注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（50、100、200、400和800 nM），并通过BMP5固定的CM5芯片以436.1 RU的密度注入。（A–C）颜色线表示根据1∶1朗缪尔结合模型绘制的拟合曲线，黑色线表示实验曲线。动力学数据（KD类，K在、和K远离的)和质量控制参数（χ2、U、T（K在)和T（K远离的))如各传感器图下表所示。

（畅通节能法）

图S3

利用SPR进行BMP7和RGM蛋白之间动力学实验的代表性传感器图。（A）HJV蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（50、100、200、400和800 nM），并通过BMP7固定的CM4芯片以284.9RU的密度注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（18.75、37.5、75、150和300 nM），并通过BMP7固定的CM4芯片以365.6 RU的密度注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（75、150、300、600和1200 nM），并通过密度为286.9 RU的BMP7固定的CM4芯片注入。（A–C）颜色线表示根据1∶1朗缪尔结合模型绘制的拟合曲线，黑色线表示实验曲线。动力学数据（KD类，K在、和K远离的)和质量控制参数（χ2、U、T（K在)和T（K远离的))如各传感器图下表所示。

（畅通节能法）

图S4

利用SPR进行BMP2和RGM蛋白之间动力学实验的代表性传感器图。（A）HJV蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（6.25、12.5、25、50和100 nM），并通过BMP2固定的CM5芯片以118 RU的密度注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（2、4、8、15和30 nM），并通过BMP2固定的CM5芯片以198.5 RU的密度注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（10、20、40、80和160 nM），并通过BMP2固定的CM5芯片以198.5 RU的密度注入。（A–C）颜色线表示根据1∶1朗缪尔结合模型绘制的拟合曲线，黑色线表示实验曲线。动力学数据（KD类，K在、和K远离的)和质量控制参数（χ2、U、T（K在)和T（K远离的))如各传感器图下表所示。

（畅通节能法）

图S5

利用SPR进行BMP4和RGM蛋白之间动力学实验的代表性传感器图。（A）HJV蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（5、10、20、40和80 nM），并通过BMP4固定的CM5芯片以40.2 RU的密度注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（2、4、8、16和32 nM），并通过密度为96.1 RU的BMP4固定的CM5芯片注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（10、20、40、80和160 nM），并通过BMP4固定的CM5芯片以95.2 RU的密度注入。（A–C）彩色线表示1∶1 Langmuir结合模型绘制的拟合曲线，黑线表示实验曲线。动力学数据（KD类，K在、和K远离的)和质量控制参数（χ2、U、T（K在)和T（K远离的))如各传感器图下表所示。

（畅通节能法）

图S6

BMP9和RGM蛋白之间的动力学实验的代表性传感器图，以及通过SPR与ALK1-Fc结合的BMP9。（A）HJV蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（10、25、50、100和200 nM），并通过BMP9固定的CM5芯片以139.1 RU的密度注入。（B）RGMB蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（2、4、8、15和30 nM），并通过BMP9固定的CM5芯片以160.7 RU的密度注入。（C）RGMA蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释成一系列浓度（6、12、25、50和100 nM），并通过BMP9固定的CM5芯片以160.7 RU的密度注入。（A–C）未检测到明显的结合，且无法计算动力学数据。（D）ALK1-Fc蛋白在运行缓冲液HBS-EP+中稀释至100 nM，并通过BMP9固定的CM5芯片以160.7 RU的密度注入。

（畅通节能法）

致谢

我们感谢马萨诸塞州总医院生物统计中心的Hang Lee博士提供的统计建议。

资金筹措表

这项工作得到了美国国立卫生研究院（拨款编号：K08-DK075846、RO1-DK087727（发给J.L.B.）、RO1 DK-069533和RO1 DK071837（发给H.Y.L.））的部分支持，并获得了马萨诸塞州总医院颁发的克拉夫林杰出学者奖（发给J.LB.）。这项工作得到了哈佛催化剂/哈佛临床和转化科学中心（国家研究资源中心和国家卫生研究院转化科学促进中心）的支持[奖#UL1 RR 025758]以及哈佛大学及其附属学术卫生保健中心的财政捐款）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃