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分子生物学细胞。2001年5月；12(5): 1303–1314.
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PMID：11359923

Hsp70分子伴侣促进内质网囊性纤维化的网状相关蛋白降解酵母中的跨膜电导调节器

张一茂,* 加比·尼克布鲁克,† 马拉·L·沙利文,† 阿迪丝·麦克拉肯,§ 西蒙·沃特金斯,‡ 苏珊·迈克利斯,†和杰弗里·布罗茨基*‖
帕梅拉·西尔弗，监控编辑器
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摘要

内质网中的膜和分泌蛋白折叠（ER）和错误折叠的蛋白质可能被保留并靶向ER相关蛋白降解（ERAD）。通过以下方式阐明其机制我们研究了内质网中一个完整的膜蛋白被降解囊性纤维化跨膜电导调节因子的命运酵母中的（CFTR）酿酒酵母.我们的数据表明CFTR存在于ER中并在菌株中稳定蛋白酶体活性缺陷或泛素结合酶Ubc6p和Ubc7p，从而证明CFTR是酵母中真正的ERAD底物。我们还发现了热量休克蛋白70（Hsp70），尽管对需要可溶性内腔ERAD基质以促进CFTR人事变更率。相反，calnexin和结合蛋白（BiP）在酵母和哺乳动物对CFTR的降解是不可或缺的，这表明至少一些可溶和整体的处置机制酵母中的膜ERAD底物。

简介

内质网（ER）是膜和分泌蛋白质折叠，通常只有正确折叠的蛋白质存在ER。不完全折叠的蛋白质可能保留在ER中，如果折叠无法实现，它们可能形成聚集体或成为目标ER相关蛋白降解（ERAD）（最近由博纳法奇诺和韦斯曼，1998年；Brodsky和McCracken，1999年；普伦珀和沃尔夫，1999；Römisch，1999年). 来自酵母和哺乳动物的研究细胞，ERAD的分子机制最近开始出现。ERAD基板的选择非常特殊，因为错误折叠蛋白质必须与正确折叠和折叠相容蛋白。分子伴侣可能参与选择过程，因为它们有助于蛋白质折叠和内质网管腔和胞质分子之间的长期联系一些ERAD中观察到伴侣蛋白和错误折叠蛋白基板(杨等。, 1993；发出砰的声响等。, 1994；针织机等。, 1995；施密茨等。,1995；萨瓦等。, 1996；德维吉利奥et（等）等。, 1999). 此外，一些ER管腔伴侣的突变防止酵母中的ERAD(McCracken和Brodsky，1996年；Plemper公司et（等）等。, 1997；布罗德斯基等。, 1999；吉勒塞et（等）等。, 1999).

体内和体外数据均表明ERAD底物针对蛋白酶体(比德勒等。, 1996；汉普顿等。, 1996；希勒等。, 1996；曲等。, 1996；沃纳等。, 1996；维尔茨等。, 1996)是一种多催化、蛋白水解细胞质中的复合物（由Voges公司等。, 1999).对于ERAD来说，绝大多数人都有必要放弃(延森et（等）等。, 1995；病房等。, 1995；希勒等。,1996；比德勒等。, 1997；汉普顿和巴克塔，1997年；洛艾萨等。, 1998；周等。, 1998)但不是所有基板(麦基等。, 1996；沃纳et（等）等。, 1996；于等。, 1997). 因为蛋白酶体存在于细胞质中，可溶性ERAD底物必须从ER逆向转移，以及Sec61p转座子是降解可溶性蛋白质所必需的(皮隆等。, 1997；普伦珀等。, 1997).对于膜蛋白的蛋白水解，Sec61p的作用也已被提议(维尔茨等。, 1996；贝伯克et（等）等。, 1998；普伦珀等。, 1998). 膜蛋白可能在被蛋白酶体或其胞质部分可以被“剃掉”或被蛋白酶体、管腔环和跨膜结构域可以由蛋白酶体或通过一种未定义的蛋白酶。确实，有实验证据支持参与多种ERAD途径。明确地，双信号肽酶(马林（Mullins）等。, 1995)和半胱氨酸丝氨酸蛋白酶与一些内质网的降解有关蛋白质(威尔曼等。, 1991；威克斯特罗姆和洛迪什，1992年；加德纳等。, 1993；森山等。, 1998；法亚达等。, 2000以及其中的参考文献）。

ERAD途径在细胞生理学中的重要性是一些与疾病相关的分子ERAD基板（审查人Brodsky和McCracken，1999年). 一个例子是囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）突变导致囊性纤维化的蛋白质(里尔丹等。, 1989). CFTR是一种质膜氯离子通道由两个跨膜域（MSD）组成，每个跨膜域有六个跨膜段，两个核苷酸结合域（NBD1和NBD2）和中央调控（“R”）结构域。CFTR折叠和内质网成熟是一个低效、温度敏感的过程，如事实所示，约80%的野生型CFTR通过以下途径退化ERAD公司(程等。, 1990；丹尼等。, 1992；卢卡奇等。, 1994；延森等。, 1995；病房等。, 1995).

分子伴侣被认为有助于CFTR的成熟。细胞溶质伴侣热休克蛋白70（Hsp70）(杨et（等）等。, 1993)，Hdj-2型(米查姆等。, 1999)和Hsp90(卢等。, 1998)和ER管腔伴侣calnexin(发出砰的声响等。, 1994)与CFTR在ER，其解离与CFTR成熟相一致。已净化Hsp70在体外抑制NBD1的聚集(斯特里克兰等。, 1997)并与Hdj-2协同作用结束(米查姆等。, 1999). 最近，它被演示通过使用Hsp90相互作用化合物加速CFTR降解(卢et（等）等。, 1998)表明如果Hsp90不能折叠CFTR，则CFTR为而是针对退化。

因为分泌途径和ERAD机制在酵母和哺乳动物细胞，因为酵母具有强大的基因工具，我们在该生物体中表达野生型CFTR，开始解剖整合膜ERAD底物靶向的途径用于蛋白质水解。

材料和方法

应变与转化

酿酒酵母使用的菌株如下：战略安全分析1温度敏感应变JB67(Matα，his3-11,15，leu2-312，ura3-52，trp1Δ1、lys2、ssa1-45、ssa2-1、ssa3-1、ssa4-2)和等基因野生型JN516(Matα，他的3-11,15，leu2-3112、ura3-52、trp1Δ1、lys2、SSA1、ssa2-1、ssa3-1、，ssa4-2) (贝克尔等。, 1996);Δcne1(垫子一，ade2-1，can1-100，ura3-1，leu2-3112，trp1-1，his3-11,15，cne1：：LEU2)和等基因野生型W301-1a(垫子一，ade2-1，can1-100，ura3-1，leu2-312，trp1-1，希3-11,15) (帕拉蒂等。, 1995); 蛋白酶体突变体WCG4/2型[垫子一，leu2-3112，他的3-11,15，ura3Δ5，罐，pre1-1，pre2-2]和等基因野生型菌株WCG4(垫子一，leu2-3112，他的3-11,15，尿酸3Δ5) (海涅梅尔等。, 1991);泛素结合突变体MHY552(材料α，his3-Δ200，ura3-52，leu2-3112，lys2-801，trp1-1，ubc6-Δ1:：HIS3，ubc7:：LEU2)和等基因野生型MHY501(材料α，his3-Δ200，ura3-52，leu2-3112，lys2-801，trp1-1)(陈等。, 1993); BiP突变株MS1111(垫子一、ura3-52、leu2-3112、ade2-101、kar2-1)，MS193号(垫子一，ura3-52，leu2-3112，ade2-102，卡尔2-133)和等基因野生型RSY801(垫子一,ura3-52、leu2-3112、ade2-101) (布罗德斯基等。, 1999);液泡蛋白酶缺乏菌株BJ5461(垫子一,ura3-52，trp1，lys2-801，leu2Δ1，his3Δ200，pep4:：HIS3，prb1Δ1.6R，can1)和相关野生型BJ5242(垫子一、ura3-52、trp1、，leu2-Δ1，his3-Δ200) (琼斯，1991年);人力资源部突变体RHY1952(Matα，lys2-801，his3Δ200，ura3-52，trp1-1，leu2-3112，hrd1:：LEU2)和RHY1903(材料α，lys2-801、his3Δ200、ura3-52、trp1-1、leu2-3112、，hrd3:：LEU2)和等基因野生型(Matα，lys2-801，his3Δ200，ura3-52，trp1-1，leu2-3112) (威尔霍夫斯基等。, 2000).

酵母转化是通过醋酸锂程序进行的描述(伊藤等。, 1983).

质粒和抗体

CFTR在酵母中的表达是由组成成分驱动的含有2μ质粒的磷酸甘油酸激酶启动子URA3公司作为可选标记。质粒的构建用于表达未标记和三重血凝素（HA）标记（在羧基末端）酵母中CFTR的形式将在别处描述(张等。2001年). 含有2μ质粒的酵母第RS426页(克里斯蒂安松等。, 1992)使用了缺少的插件作为指示的控件。

本研究使用的抗体如下：单克隆抗HA小鼠（12CA5克隆，400μg/ml；罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，IN）、单克隆抗C小鼠（Genzyme，马萨诸塞州剑桥市）、，多克隆抗Sec61p兔(斯特林等。, 1992)、和多克隆抗结合蛋白（BiP）兔(Brodsky和Schekman，1993)抗体。在绵羊身上检测到一级抗体抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物或驴抗兔辣根过氧化物酶结合抗体（Amersham Pharmacia Biotech，新泽西州皮斯卡塔韦）和Amersham ECL Western印迹系统用于根据制造商的规范。对于定量分析，125用I蛋白A代替次级蛋白抗体，并使用富士荧光成像仪和使用MacBas软件（版本2.4）进行量化（富士胶片；KoshinGraphic Systems，斯坦福大学，CT）。

碳酸钠提取和浮选分析

酵母微粒体是从野生型菌株中制备的包含所述HA-CFTR表达质粒(布罗德斯基和Schekman，1993年). 然后，取10μl等分微粒体（～100μg总蛋白）与1 ml 100 mM混合纳2一氧化碳4（pH 11.5）和在冰上孵育30分钟(藤城等。, 1982). 之后在230000×g、4°C下离心1h溶于35μl 2×SDS-PAGE样品缓冲液中。蛋白质上清液在冰上培养30分钟沉淀将三氯乙酸（TCA）添加至最终浓度10%，然后在4°C、16060×g下离心10分钟。这个将颗粒重新悬浮在35μl的2×SDS-PAGE样品缓冲液中。将颗粒和上清液中的蛋白质SDS-PAGE和免疫印迹分析如上所述。

为了确认CFTR是膜包埋的，因此可以漂浮在蔗糖梯度，野生型和前1-1前2-2酵母用CFTR转换后的表达载体生长到对数中期（外径600=～0.5）在选择性介质中收获细胞，洗涤，然后重新悬浮在膜存储器中缓冲液/EDTA（MSB:50 mM HEPES pH 7.6，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1 mM添加苯甲基磺酰氟的二硫苏糖醇，根据制造商的规范）至最终浓度～10外径600/毫升。半月板上添加了玻璃珠悬浮液在涡流混合器上搅拌四次每次搅拌之间在冰上孵育30秒，孵育1分钟。这个取出提取物，用等量的MSB清洗珠子，合并的提取物以300×g离心两次持续2分钟，去除未破裂的细胞。总共100μl将上清液与300μl含有2.3M蔗糖的MSB混合，将该溶液分层于300μl MSB上，其中MSB含有2.3 M离心管中的蔗糖。MSB补充1.5 M蔗糖（600μl）和0.25 M蔗糖（500μl）依次分层到梯度和试管在Beckman SW55转子中离心100000×g，在4°C下持续5小时。150μl的等分样品为从梯度顶部移除并分析蛋白质剖面SDS-PAGE和免疫印迹法。

间接免疫荧光和电子显微镜

基本上进行了间接免疫荧光显微镜检查如前所述(普林格尔等。, 1989). 对数相细胞（外径600=～0.5–0.7）固定1小时在室温下，将甲醛添加到最终浓度3.7%. 用山梨醇缓冲液（50 mM）清洗酵母两次磷酸钾，pH 7.5，1.2 M山梨醇），并重新悬浮至浓度为106细胞/10μl山梨醇含有0.1%β-巯基乙醇和20μg/ml发酵糖酶20T的缓冲液（马萨诸塞州斯旺普斯科特美国生物公司）。37°C孵育后1h后，用山梨醇缓冲液清洗细胞两次并涂抹到poly-我-赖氨酸涂层玻片（20μl/孔），然后用3.7%甲醛固定5分钟磷酸盐缓冲盐水（PBS）（40 mMK（K）2高性能操作4，10毫微米千赫2人事军官4pH值7.5，0.15 M氯化钠）。最终浓度为50 mM NH4Cl是用于熄灭甲醛。细胞被渗透补充0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中的0.1%NP-40（PBS-0.1%BSA），然后与抗HA（1:250稀释）一起孵育，或PBS-0.1%BSA中的抗C（1:40稀释）和抗BiP（1:500）抗体在4°C的潮湿室内过夜。用PBS/BSA清洗三次后用PBS/BSA/NP-40清洗一次，检测一级抗体与抗兔IgG TRITC结合物（1:250稀释；Sigma，St.Louis，MO）和抗鼠IgG荧光素结合物（1:250稀释；罗氏分子生物化学，印第安纳州印第安纳波利斯），PBS-0.1%BSA。

含有或缺乏CFTR表达载体的酵母生长至中对数期并进行全细胞电子显微镜检查由发布Kaiser和Schekman（1990）.

CFTR降解试验

表达CFTR的细胞生长到中期（外径600=～0.5），在环己酰亚胺之前26°C添加到50μg/ml的最终浓度，并进行培养要么在26°C下，要么在移动到40°C之前摇晃在指定的时间点采集以制备细胞提取物。对于每个时间点，总计2.5 OD600个单元格（共个）收获后，用冷水清洗，并在1毫升的冷水中重新悬浮水。一份150μl新鲜制备的2 N NaOH/1.12 M添加β-巯基乙醇，使酵母重新悬浮并离开在冰上放置15分钟。然后，添加150μl 50%TCA将提取物在冰上再孵育20分钟16060×g离心5分钟，4°C，造粒蛋白质重新悬浮在TCA样品缓冲液中（80 mM Tris-Cl，pH 8.0，8 mM EDTA、120 mM二硫苏糖醇、3.5%十二烷基硫酸钠、0.29%甘油、0.08%三盐基，0.01%溴酚蓝），并在37°C下培养30分钟。通过SDS-PAGE分析总蛋白，然后免疫印迹分析或定量免疫印迹分析（见上文）。

ERAD的脉冲追踪分析

错误折叠形式羧肽酶Y的降解（CPY*；希勒等。, 1996)使用CPY的HA-epitope-tagged版本*(Ng公司等。, 2000). 在简而言之，用CPY*表达载体转化的细胞生长为含葡萄糖和α的选择性培养基中的对数相脉冲相位分析[35S] 蛋氨酸按说明执行(布罗德斯基等。, 1998). CPY*是从～5×10沉淀6的cpm35S-标记蛋白提取物，含10μg抗HA抗体（罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，IN）和蛋白质A-Sepharose（Amersham Pharmacia Biotech）。酵母使用抗BiP抗体和蛋白A-Sepharose沉淀BiP。

结果

CFTR是酵母中的ERAD底物

为了评估酵母中表达的CFTR的亚细胞定位，用生长的细胞进行间接免疫荧光显微镜检查仅在26°C下或在40°C下移动1小时。之所以选择40°C的温度，是因为CFTR在温度敏感酵母在40°C时变得最显著（参见（见下文）。含有CFTR表达质粒的酵母（含有或在C终端缺少HA标签，称为HA-CFTR或以下未标记的CFTR）分别受到间接免疫荧光显微镜。如图所示​图1，1野生型细胞中的、A和B、HA-CFTR（表示SSA1和之前)在26°C或在40°C下移动1小时，显示出强烈的核周点状模式和亚质膜驻留，并与BiP（内质网）共定位管腔热休克蛋白70。对于未标记的CFTR，一种针对C末端的抗体用α-HA代替α-HA，得到了相同的结果（我们的未发布的数据）。这些数据表明，CFTR表示为酵母主要存在于内质网中，其他人也认为(黄等。, 1996).

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CFTR与酵母中的BiP共定位并积累在40°C的蛋白酶体突变菌株中的一个或两个位点。CFTR-表达ssa1-45型（A） 和前1-1前2-2（B） 细胞和各自的等基因野生型细胞(SSA1型和之前)都长大了在26°C下，移动至40°C 1 h，然后进行抗HA间接免疫荧光显微镜（检测HA-CFTR）和抗BiP抗体。

外源蛋白在酵母中的表达，或内源性蛋白质可能导致细胞内形态改变(赖特等。1988年；Umebayashi村等。, 1997；贝克尔等。, 1999). 要确定CFTR同样影响酵母，对数生长细胞含有制备对照或HA-CFTR表达质粒用于材料和方法中所述的全细胞电子显微镜。如图所示​图2，2，细长管状并且仅在表达CFTR。这些结构在其他地方有更详细的描述（Kuehn、Nijbroek和Michaelis，未发表的数据），也源于突变型Ste6的表达一因素酵母中的交配信息素转运体。它们与那些不同当其他内质网膜蛋白在酵母中过表达时观察到(赖特等。1988年；Umebayashi村等。, 1997；贝克尔等。, 1999)或者当分泌途径在一个秒突变株(西川et（等）等。, 1994). 相反，我们没有观察到生长受损或表达CFTR的酵母分泌蛋白移位缺陷（我们未公布的结果）。因为ER膜可能会增殖来自ER中未折叠蛋白反应的诱导(考克斯等等。, 1997)，我们引入了未折叠蛋白反应（UPR）将报告质粒导入已经含有CFTR表达的酵母质粒或缺少插入物的质粒，但发现UPR为不由CFTR表达诱导。因此在表达CFTR的酵母中观察到的膜增殖是未知。

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细胞内膜在CFTR表达酵母。含有空酵母的野生型酵母对照载体（A）或CFTR表达质粒（B）通过根据凯撒和Schekman（1990）.巴，0.5μm。

为了验证酵母表达的CFTR插入ER膜，ER衍生微粒体(Brodsky和Schekman，1993年)是由HA-CFTR–表达细胞并用碳酸钠处理(藤城等。, 1982). 如图所示​图3A，三A、 HA-CFTR和Sec61p，ER易位通道只存在于膜颗粒中，而BiP，一种内质网内腔蛋白，主要（～66%）位于上清液。可能观察到BiP提取不完全从它与移位机械部件的相互作用(Brodsky和Schekman，1993年).

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CFTR是一种完整的膜蛋白。（A）ER衍生微粒体由CFTR表达细胞制备，用碳酸钠提取，然后离心。总蛋白质膜颗粒（P）和上清液（S）通过SDS-PAGE，并进行免疫印迹分析。BiP和Sec61p分别用作可溶性和膜蛋白对照。（B） 表达CFTR的野生型和前1-1前2-2准备好细胞，在底部分层离心管，并按照说明进行超速离心材料和方法。免疫印迹检测从顶部到底部的部分中显示的蛋白质坡度如图所示。单元格在渐变中的位置提取液也已装载。

为了确认CFTR整合到膜中制备CFTR表达细胞并与浓蔗糖混合溶液上覆盖着低密度的含蔗糖缓冲液，然后进行超速离心。如图所示​图3B，三B、 我们观察到CFTR在蔗糖梯度上浮动，与BiP一致。我们确实注意到一些BiP未能浮动，这表明它的一部分从小泡中解放出来，很可能是在细胞提取物的制备。这些联合免疫荧光生化数据表明CFTR被整合到ER中酵母膜。

接下来，我们讨论了野生型CFTR是否通过酵母中的泛素蛋白酶体途径，如哺乳动物细胞中的泛素蛋白酶体途径(延森等。, 1995；病房等。, 1995). 退化添加环己酰亚胺。各时间点的CFTR剩余金额为免疫印迹分析定量125I蛋白A。我们发现HA-CFTR是稳定在前1-1前2-2突变体（图​（图4），4)，一种具有消除～蛋白酶体活性的95%(海涅梅尔et（等）等。, 1993). HA-CFTR在ubc6、7已删除泛素结合酶的菌株Ubc6p和Ubc7p（图​（图4）。4). 我们在本实验和其他实验中注意到（参见以下）CFTR在独特野生型酵母中的降解程度菌株不同，表明有必要使用等基因菌株在体内测量ERAD。无论如何，我们的结果表明蛋白酶体和泛素结合促进CFTR的降解在酵母中。

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CFTR在酵母中的降解在蛋白酶体功能和泛素结合缺陷的菌株。CFTR表达细胞在26°C下生长，然后培养1小时在40°C的温度下，在添加环己酰亚胺，制备细胞提取物按照说明进行SDS-PAGE和免疫印迹分析材料和方法。定量结果免疫印迹分析显示。当时的CFTR金额0被设置为1。●、，PRE1PRE2前; ○,前1-1前2-2; ▪,UBC6UBC7号机组; □,ubc6ubc7型.

酵母中许多蛋白质的细胞内降解发生在空泡和错误折叠的分泌蛋白可以作为靶点细胞器(洪等。, 1996，以及其中的参考文献）。收件人证实CFTR的降解与液泡无关蛋白酶，我们检测了HA-CFTR在Δpep4大多数液泡蛋白酶的突变体被禁用(琼斯，1991年)，但发现CFTR降解未受影响的(张等。2001年).

可溶性蛋白和膜蛋白的ERAD需要独特的伴侣

需要ER管腔伴侣calnexin和BiP可溶性ERAD底物的高效降解(勒等。,1994；针织机等。, 1995；施密茨等。,1995；McCracken和Brodsky，1996年；曲等。, 1996；普伦珀等。, 1997；布罗德斯基等。, 1999)和两个ER管腔（例如calnexin）和细胞溶质伴侣（例如Hsp70和Hsp90）与哺乳动物细胞CFTR相关(杨等。,1993；发出砰的声响等。, 1994；卢等。, 1998；米查姆等。, 1999).酿酒酵母有两个细胞溶质Hsp70类，由安全保障局和安全气囊系统基因(布尔斯坦等。, 1994). 虽然Ssb蛋白参与蛋白质翻译(Pfund基金等等。, 1998)，Ssa蛋白更类似于哺乳动物的Hsp70并且是各种依赖伴侣的活动所必需的(苗族等。, 1997). 有四种Ssa蛋白，Ssa1-4p其中至少有一种表达对生存能力至关重要(沃纳-沃什本等。, 1987). 因此，要探索无论CFTR降解是否需要Hsp70，我们使用了一株菌株包含SSA1型温度敏感等位基因，ssa1-45型，其中ssa2-4已被禁用(贝克尔等。, 1996). 等基因“野生型”菌株包含SSA1型同样缺乏功能性ssa2-4型。我们发现CFTR在26在野生型细胞中为40°C（图​（图5A）；5A） ；～90%后，60%的CFTR降级在野生型细胞中为min，而不考虑进行了实验。相反，在ssa1-45型突变体菌种，CFTR在26°C下降解熟练，但蛋白质在40°C下显著稳定。当未标记的退化CFTR是用抗C末端抗体检测的蛋白，CFTR也在ssa1-45型应变40°C（我们未公布的结果）。我们得出结论，Hsp70需要促进CFTR在酵母中的降解，尽管对于体内外两种可溶性蛋白质的ERAD(布罗德斯基等。, 1999).

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CFTR仅在ssa1-45型40°C下的应变。生长的CFTR表达细胞仅在26°C下或转移到40°C下1小时后收获在添加环己酰亚胺和电池后的指定时间制备提取物并进行免疫印迹分析。（A） 定量免疫印迹结果绘制分析图，相应的磷光成像仪分析如下展示。在时间零点的CFTR的数量被设置为1。●、，SSA1型26°C下表达CFTR的细胞；○,战略安全分析1-在26°C下表达CFTR；▪,SSA1型-在40°C下表达CFTR；□,ssa1-45型40°C下表达CFTR的细胞。Sec61p发球作为加载控件。（B） HA-CFTR的降解在野生型（●），卡尔2-1（○），或卡尔2-133A中描述的（φ）酵母，以及结果进行了分析和量化。（C） HA-CFTR降解在野生型（●）或Δ中国1号机组（○）酵母。

因为Ydj1p耳蜗酮刺激Ssa1p的ATP酶活性(Cyr公司等。, 1992)和YDJ1型和SSA1型遗传相互作用(贝克尔等。, 1996)，Ydj1p也可以促进CFTR降级。此外ydj1-151型突变株对泛素依赖性降解一些细胞质底物(李等。, 1996). 我们发现，然而，CFTR在编号1-151酵母（我们未发表的结果）。

确定BiP和calnexin是否在CFTR，我们在卡尔2-1,卡尔2-133、和Δcne1菌株，其中可溶性ERAD底物蛋白原α因子的降解在体外被削弱(McCracken和Brodsky，1996年；布罗德斯基et（等）等。, 1999). 含有卡尔2-1或卡尔2-133突变也有缺陷体内可溶性底物A1PiZ(布罗德斯基等。, 1999).如图所示​图5，5B和C，我们观察到CFTR的比率蛋白质水解在卡尔2和中国1号机组突变株及其相应的等基因野生型菌株。总的来说，这些结果表明，不同类型的伴侣需要降解几种膜和可溶性蛋白质，并建议各自的ERAD途径是不同的。

为了确认可溶性ERAD底物的降解在卡尔2-1和卡尔2-133菌株，我们研究了CPY*在野生型和卡尔2在细胞中加入环己酰亚胺后，通过chase分析突变体。CPY*的ERAD由Wolf和同事建立(希勒等。, 1996)，并使用卡尔2突变体，Plemper公司等。(1997)发现降解和将CPY*从ER要求的BiP中逆向转移。当我们测量野生型CPY*的蛋白水解卡尔2突变体在本研究中，观察到CPY*在卡尔2应变（图​（图6）。6). 偶数在30°C的半许可温度下追逐45分钟后剩余CPY*数量占初始水平的百分比为野生型菌株和卡尔2-1和卡尔2-133突变体。

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CPY*降解减弱卡尔2-1和卡尔2-133突变菌株。这个野生型CPY*蛋白水解，卡尔2-1、和卡尔2-133含有HA-tagged CPY*表达的细胞之后，在30°C下通过脉冲相位分析检查矢量材料和方法中所述的环己酰亚胺添加。这个时间零点的CPY*相对量设置为1。野生型(KAR2标准)，●；卡尔2-1, ○;卡尔2-133图中还显示了原始凝胶作为负荷控制，检查BiP在每个菌株中的命运。时间在每条车道下方显示追逐的（min）。

ERAD不需要两种HRD基因产物CFTR的

汉普顿及其同事（1996年）已经分离出许多突变体对HMG-CoA还原酶的调节降解有缺陷在酵母中。由相应基因编码的两种蛋白质，Hrd1/Der3p和Hrd3p形成一个化学计量复合物，并在ERAD公司(加德纳等。, 2000). 虽然hrd1型和hrd3型突变体在降解两个集成膜ERAD基板(威尔霍夫斯基等。,2000)，其他ERAD基板在hrd1/der3突变体(博达尔洛等。, 1998；普伦珀等。, 1998). 确定CFTR退化是否受hrd1型和hrd3型突变，我们将CFTR表达质粒引入这些突变体中等基因野生型菌株，并随着时间的推移测量CFTR水平如上所述。如图所示​图7，7，我们在CFTR的总体比率上没有观察到显著差异野生型退化，hrd1型、和小时3酵母。因此，CFTR与UP*一样(威尔霍夫斯基等。, 2000)是UBC6/7型-依赖但人力资源1-独立。

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删除的细胞中CFTR降解不受影响HRD1/DER3和HRD3基因。CFTR在野生型中的降解（○）和hrd1型（●）和hrd3型(▵)按照材料和方法中的描述检查突变细胞。展示是两个独立数据集的平均值。SDs在意味着。

蛋白酶体突变细胞中的CFTR浓缩物

深入了解如何选择CFTR并将其作为目标蛋白酶体，我们在以下条件下检测了CFTR定位CFTR退化受阻。间接免疫荧光显微镜使用执行前1-1前2-2和ssa1-45型表达CFTR的突变株和等基因野生型细胞。作为如上所示，在野生型细胞中，CFTR以强点状出现模式并与BiP共存（图​（图1A）。1A） ●●●●。在ssa1-45型电池，温度为26和40°C（图​（图1A），1A） ，类似的结果是观察。然而，当蛋白酶体功能减弱，细胞转移到40°C，CFTR可以集中到一个或两个“点”一些细胞；电池的代表性部分如图所示​图1B：。1B.我们不认为这些斑点代表“可恶”哺乳动物核周部位聚集的提取CFTR当CFTR过度表达或细胞生长时蛋白酶体抑制剂(约翰斯顿等。, 1998)，用于以下原因。首先，CFTR和管腔伴侣BiP共定位在这些图像中。其次，无论无论是来源于野生型还是蛋白酶体突变株（图​（图3B）三B） 其中降解减弱（图​（图4A）。4A） ●●●●。事实这还不是全部之前表达CFTR的细胞显示一个或两个点（图​（图1B）1B） 可能代表CFTR表达的异质性水平。事实上，我们已经注意到这种模式出现在表达最大数量的CFTR（我们未公布的结果），表明较低水平的CFTR可能由剩余ERAD活动“处理”，或其他蛋白酶。然而，这些结果表明当CFTR的蛋白水解受到不同程度的影响时被Hsp70或蛋白酶体缺陷所消除。

讨论

此处描述的工作将CFTR确立为酵母酿酒酵母。我们发现CFTR在酵母是保留在内质网中的完整膜蛋白蛋白酶体活性和泛素结合系统对于最大降解。此外，我们发现细胞质Hsp70Ssa1p，但既不是管腔Hsp70 BiP也不是管腔伴侣calnexin是CFTR蛋白水解所必需的。这与监护人相反可溶性ERAD基质降解要求：ER需要管腔蛋白calnexin和BiP，但细胞质伴侣Ssa1p不是(McCracken和Brodsky，1996年；普伦珀et（等）等。, 1997；布罗德斯基等。, 1999; 图​图6）。6). 一起，这些结果为at的质量控制提供了独特的机制至少有一些完整的膜和可溶性ER蛋白。

我们的结果与其他实验室的工作一致研究药物降解的伴侣需求酵母ER中的整合膜蛋白。首先，Plemper公司et（等）等。(1998)观察到BiP功能对于降解Pdr5p*，一种集成膜ERAD基质。第二，当这份手稿还在准备中时，希尔和库珀（2000）据报道，Ssa1p是Vph1p降解所必需的成为ERAD的液泡ATP酶的完整膜亚单位基板，当VMA22型基因产物缺失，而中的突变KAR2标准对Vph1p的降解没有影响。第三，我们发现Ssa1p是必需的，而BiP对于破坏含有ER的突变型Ste6p（“Ste6p*”），整体膜一-酵母中的因子转运体与CFTR同源（Harper、Brodsky和Michaelis，未发表数据）。

因为细胞液是由ssa1-45型突变株移动到非许可温度支持可溶性ERAD底物(布罗德斯基等。, 1999)，缺陷在CFTR退化中ssa1-45型突变体不能由蛋白酶体失活引起。相反，我们倾向于在Ssa1p在蛋白酶可获得的构象，一种至关重要的活性如果蛋白酶体或其他蛋白酶最初将其刮除或剪断域。我们之前发现，大约等量的Ssa1p与ER衍生微粒体相关，在酵母中“游离”细胞溶质(布罗德斯基等。, 1999)，暗示了这其中的大部分伴侣可以定位为与ERAD底物结合。几个其他观察结果也支持这个模型。首先，每个积分需要Ssa1p的膜ERAD底物（即Vph1p、CFTR、Ste6p*）降解活性包含大的细胞质域。如果是这样模型是正确的，可以预期Ssa1p会阻止蛋白质聚集并促进蛋白质折叠。事实上，我们发现之前，细胞质是由ssa1-45型突变体在体外不能再折叠热变性的萤火虫荧光素酶，而由等基因野生型菌株制备的胞浆重折叠荧光素酶(布罗德斯基等。, 1999). 其次，其他人观察到哺乳动物Hsp70体外抑制CFTR NBD1的聚集(斯特里克兰等。, 1997；米查姆等。, 1999).第三，如果Ssa1p以可访问的构象“持有”CFTR蛋白酶体或未识别的蛋白酶，则可能开始裂解在大的、细胞团排列的NBD和/或R结构域内。的确，我们注意到，在过度暴露用于检测降解的凝胶后分子量约为80–120000的CFTR降解中间体（我们的未公布的结果），尺寸与NBD内的解理一致和R域。该分子量的CFTR降解中间体当CFTR生物发生在哺乳动物细胞(卢卡奇等。, 1994；范·欧尼et（等）等。, 2000). 第四，Ssa1p可能对整体膜ERAD基板降解较少显著的细胞质结构域。事实上，对当在这个ssa1-45型菌株（S.Nishikawa、S.Fewell、Y.Kato、J。Brodsky，T.Endo，未公布数据）。

解释在可溶物降解过程中对BiP的要求不是完整的膜ERAD底物，我们建议管腔域必须保持在无聚集状态，BiP是已知展览（评审人格兴，1997年). 相反，管腔完整膜蛋白的跨膜结构域可能被移除不依赖于BiP，可能通过蛋白酶体直接提取(迈耶等。, 1998；熊等。, 1999).最后，可能需要BiP“解锁”允许ERAD底物逆行转运的转运通道完全导入ER后(普伦珀等。,1999). 该模型来源于Johnson和同事们认为BiP可能会堵塞哺乳动物的易位孔急诊室(哈曼等。, 1998).

这些模型中固有的，并且由于CFTR的不同观察到的免疫荧光染色模式ssa1-45型和前1-1前2-2应变（图​（图1），1)，我们建议CFTR酵母降解是一个多步骤的过程。仅当蛋白酶体40°C时功能减弱，我们是否观察到CFTR定位ER中的一个或两个位点。在表达Ste6p*的酵母被称为ER相关体（ERABs）。作为此处显示的CFTR，Ste6p*诱导的ERAB形成不涉及UPR的诱导，以及详细的免疫荧光和电子对ERAB的形态进行了微观分析将在其他地方描述（Kuehn、Nijbroek和Michaelis，未发布的数据）。独特的本地化模式战略安全分析1和之前如果Ssa1p作用于CFTR降解途径中的蛋白酶体：我们在蛋白酶体突变株可能代表最终的分期点在CFTR蛋白水解之前，而CFTR向这些位点的传递被停止当Hsp70失活时。因为CFTR专注于这些根据浮选分析，斑点与膜相关（图​（图3B），三B） ，我们的结果还表明蛋白酶体需要降解或提取CFTR酵母ER膜。蛋白酶体的这种作用也由迈耶等。(1998)当混合ER退化时在缺乏功能的菌株中检测膜蛋白蛋白酶体。

因为CFTR在蛋白水解我们认为CFTR不存在于酵母中令人愤怒的。相反，表达CFTR的哺乳动物中会形成攻击性物质细胞过度表达或蛋白酶体活性被阻断时(约翰斯顿等。, 1998；威格利等。, 1999).因此，可能有独特的机制来处理累积和酵母和哺乳动物中未降解的CFTR。事实上，有人建议这种攻击性的形成可能是特定于细胞类型的，因为攻击性并没有在每个表达CFTR的哺乳动物细胞系中观察到当蛋白酶体功能减弱时(陈等。, 2000).最后，攻击性编队可能需要高水平在酵母中不能产生的CFTR。

尽管哺乳动物细胞中约20%的野生型CFTR逃逸酵母菌中出现CFTR降解并转移到质膜主要居住在ER中。然而，我们不能排除酵母中一部分CFTR逃逸ERAD并迁移的可能性通过分泌途径。与这个假设相关的是，我们经常发现一部分CFTR能够抵抗降解（参见示例，图​图5C），5C） CFTR的一小部分（～10%）与质膜蛋白Pma1p在速度-蔗糖梯度上的表达分析（我们未公布的结果）。

最后，本文中提供的数据可能与哺乳动物内质网膜蛋白降解的研究根据我们的结果，费希尔等。(1997)报告称ApoB100在HepG2细胞中的降解大约增加了两倍当细胞质Hsp70过表达时，表明伴侣促进ERAD。细胞质Hsp70和Hsc70的作用哺乳动物细胞CFTR生物发生过程中的分子伴侣通过使用伴侣活性调节剂发现。第一，鲁宾斯坦和泽特林（2000）表明苯丁酸钠减少哺乳动物细胞中Hsc70-ΔF508 CFTR复合物的数量ΔF508突变表型有伴随的拯救作用；然而，在这些条件下，Hsp70水平增加（P.Zeitlin，个人通信）。第二，江等。(1998)发现ΔF508 CFTR表达细胞经Hsp70/Hsc70-相互作用的药物脱氧番石榴素表现出部分恢复cAMP刺激的氯离子通道活性。这些研究人员假设，改变伴CFTR可能促进成熟，尽管这是可能的DSG刺激Hsp70，从而增强CFTR折叠并增加“有效”ΔF508-CFTR的产量。解释结论从这些不同的研究中可以看出哺乳动物Hsp70已被证明有助于泛素结合到几种体外蛋白质底物(贝科维奇等。,1997). 显然，将指导进一步的工作，以更好地了解Hsp70/Hsc70在真核生物蛋白质周转中的作用。

鸣谢

我们感谢Raymond Frizzell博士和Robert Bridges博士提供的试剂，他们的宝贵支持，以及许多有益的讨论。Gergely Lukacs批判性阅读手稿。我们也感谢Elizabeth Craig博士、Dieter Wolf、Mark Hochstrasser、Caroline Slayman、，Elizabeth Jones、Peter Walter、Randy Hampton和Davis Ng慷慨提供试剂，汤姆·哈珀帮助成像技术。这项工作得到了来自囊性纤维化基金会的研究开发项目匹兹堡大学（转J.L.B.），作者：Grant MCB-9722889美国国家科学基金会（J.L.B.和A.A.M.）和Grants国家卫生研究院（发给S.M.）的GM-51508和DK-58029。

参考文献

  • Adams A、Gottschling DE、Kaiser CA、Stearns T。酵母遗传学方法。冷泉港实验室课程手册。纽约州冷泉港：冷泉港实验室；1997[谷歌学者]
  • Bebök Z、Mazzochi C、King SA、Hong JS、Sorscher EJ。囊性纤维化跨膜电导调节因子从内质网转运到蛋白酶体的机制包括Sec61β和胞质脱糖基化中介物。生物化学杂志。1998;273:29873–29878.[公共医学][谷歌学者]
  • Becker F，Block Alper L，Nakamura G，Harada J，Wittrup KD，Meyer DI。180-kD核糖体受体的表达诱导酵母细胞膜增殖并增加分泌活性。细胞生物学杂志。1999;146:273–284. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Becker J、Walter W、Yan W、Craig EA。细胞溶质hsp70和DnaJ相关蛋白Ydj1p在体内蛋白质移位中的功能相互作用。分子细胞生物学。1996;16:4378–4386. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bercovich B、Stancovski I、Mayer A、Blumenfeld N、Laszlo A、Schwartz AL、Ciechanover A。体外某些蛋白质底物的泛素依赖性降解需要分子伴侣Hsc70。生物化学杂志。1997;272:9002–9010.[公共医学][谷歌学者]
  • Biederer T，Volkwein C，Sommer T。泛素蛋白酶体途径降解内质网膜不可分割成分Sec61p复合物的亚单位。EMBO J。1996;15:2069–2076. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Biederer T，Volkwein C，Sommer T。Cue1p在内质网表面泛素化和降解中的作用。科学。1997;278:1806–1809.[公共医学][谷歌学者]
  • Bonafacino JS，Weissman AM。泛素与分泌和内吞室中蛋白质命运的控制。年收入细胞开发生物。1998;14:19–57. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Boorstein WR，Ziegelhoffer T，Craig CA。HSP70多基因家族的分子进化。分子进化杂志。1994;38:1–17.[公共医学][谷歌学者]
  • Bordallo J、Plemper RK、Finger A、Wolf DH。Der3p-Hrd1p是内质网相关降解错误折叠的管腔和完整膜蛋白所必需的。分子生物学细胞。1998;9:209–222. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brodsky JL、Lawrence JG、Caplan AJ。细胞溶质DnaJ同源物YDJ1的突变延迟并损害酵母中异源蛋白的有效翻译。生物化学。1998;37:18045–18055.[公共医学][谷歌学者]
  • Brodsky JL，McCracken AA.ER蛋白质量控制和蛋白酶体介导的蛋白降解。精液细胞开发生物学。1999;10:507–513.[公共医学][谷歌学者]
  • Brodsky JL，Schekman R.来自酵母的Sec63p-BiP复合物是重组蛋白脂质体中蛋白质移位所必需的。细胞生物学杂志。1993;123:1355–1363. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brodsky JL、Werner ED、Dubas ED、Goeckeler JL、Kruse KB、McCracken AA。内质网相关蛋白降解过程中对分子伴侣的需求。表明蛋白质的输出和输入在机械上是不同的。生物化学杂志。1999;274:3453–3460.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen EYJ，Bartlett MC，Clarke DM。囊性纤维化跨膜电导调节器在其成熟受到抑制时结构发生改变。生物化学。2000;39:3797–3803.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen P、Johnson P、Sommer T、Jentsch S、Hochstrasser M。多种泛素结合酶参与酵母MATα2阻遏物的体内降解。单元格。1993;74:357–369.[公共医学][谷歌学者]
  • Cheng SH、Gregory RJ、Marshall J、Paul S、Souza DW、White GA、O'Riordan CR、Smith AE。CFTR的细胞内运输和处理缺陷是大多数囊性纤维化的分子基础。单元格。1990;63:827–834.[公共医学][谷歌学者]
  • Christianson TW、Sikorski RS、Dante M、Shero JH、Hieter P.多功能酵母高拷贝数穿梭载体。基因。1992;110:119–122.[公共医学][谷歌学者]
  • Cox JS、Chapman RE、Walter P.未折叠蛋白反应协调内质网蛋白和内质网膜的生成。分子生物学细胞。1997;8:1805–1814. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cyr DM，Lu X，Douglas MG.真核生物DnaJ同源物对Hsp70功能的调节。生物化学杂志。1992;267:20927–20931.[公共医学][谷歌学者]
  • Denning GM、Anderson MP、Amara JF、Marshall J、Smith AE、Welsh MJ。突变体囊性纤维化trnasmembrane电导调节器的处理对温度敏感。自然。1992;358:761–764.[公共医学][谷歌学者]
  • de Virgilio M、Kitzmuller C、Schwaiger E、Klein M、Kreibich G、Ivessa NE。内质网内腔短寿命糖蛋白的降解：N-连接聚糖的作用和未折叠蛋白反应。分子生物学细胞。1999;10:4059–4073. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fayadat L、Siffroi-Fernandez S、Lanet J、Franc JL。根据蛋白质的折叠状态，内质网中人甲状腺过氧化物酶的降解涉及两条不同的途径。生物化学杂志。2000;275:15948–15954.[公共医学][谷歌学者]
  • Fisher EA，Zhou M，Mitchell DM，Wu X，Omura S，Wang H，Goldberg AL，Ginsberg HN。载脂蛋白B100的降解由泛素蛋白酶体途径介导，涉及热休克蛋白70。生物化学杂志。1997;272:20427–20434.[公共医学][谷歌学者]
  • Fujiki Y、Hubbard AL、Fowler S、Lazarow PB。通过碳酸钠处理分离细胞膜：应用于内质网。细胞生物学杂志。1982;93:97–102. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gardner AM，Aviel S，Argon Y。未组装免疫球蛋白轻链的快速降解由丝氨酸蛋白酶介导，发生在高尔基体前区。生物化学杂志。1993;268:25940–25947.[公共医学][谷歌学者]
  • Gardner RG、Swarbrick GM、Bays NW、Cronin SR、Wilhovsky S、Seelig L、Kim C、Hampton RY。内质网降解需要内腔到胞浆信号：Hrd3p对Hrd1p的跨膜控制。细胞生物学杂志。2000;151:69–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gething MJ公司。哺乳动物BiP。收录：Gething MJ，编辑。分子伴侣和蛋白质折叠催化剂指南。英国牛津：牛津大学出版社；1997[谷歌学者]
  • Gillece P，Luz JM，Lennarz W J，de la Cruz F J，Römisch K。内质网无半胱氨酸错误折叠分泌蛋白的出口降解需要与蛋白二硫异构酶相互作用。细胞生物学杂志。1999;147:1443–1456. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hamman BD，Hendershot LM，Johnson AE.BiP通过在移位之前和早期封闭移位孔的腔端来维持ER膜的通透性屏障。单元格。1998;92:747–758.[公共医学][谷歌学者]
  • Hampton RY，Bhakta H.泛素介导的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶调节。美国国家科学院程序。1997;94:12944–12948. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hampton RY、Gardner RG、Rine J.26S蛋白酶体和人力资源部3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶（一种完整的内质网膜蛋白）降解中的基因。分子生物学细胞。1996;7:2029–2044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Heinemeyer W、Gruhler A、Mohrle V、Mahe Y、Wolf DH。PRE2与人类主要组织相容性复合体连接的RING10基因高度同源，编码白细胞蛋白酶活性和泛素化蛋白降解所需的酵母蛋白酶体亚基。生物化学杂志。1993;268:5115–5120.[公共医学][谷歌学者]
  • Heinemeyer W、Kleinschmidt JA、Saidowsky J、Escher C、Wolf DH。蛋白酶yscE。，酵母蛋白酶体/多催化多功能蛋白酶：突变体揭示其在应激诱导蛋白水解中的功能，并揭示其对细胞生存的必要性。EMBO J。1991年；10:555–562. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hill K，Cooper AA。未组装Vph1p的降解揭示了酵母ER质量控制系统的新方面。EMBO J。2000;19:550–561. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hiller MM、Finger A、Schweiger M、Wolf DH。细胞溶质泛素蛋白酶体途径对错误折叠的管腔蛋白的内质网降解。科学。1996;273:1725–1728.[公共医学][谷歌学者]
  • Hong E，Davidson AR，Kaiser CA。将可溶性错误折叠蛋白靶向酵母液泡的途径。细胞生物学杂志。1996;135:623–633. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huang P，Stroffekova K，Cuppoletti J，Mahanty SK，Scarborough GA。酵母中囊性纤维化跨膜电导调节器的功能表达。生物化学生物物理学报。1996;1281:80–90.[公共医学][谷歌学者]
  • Ito H，Fukuda Y，Murata K，Kimura A.用碱性阳离子处理的完整酵母细胞的转化。细菌杂志。1983;153:163–168. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jensen TJ、Loo MA、Pind S、Williams DB、Goldberg AL、Riordan JR。多种蛋白水解酶系统，包括蛋白酶体，有助于CFTR处理。单元格。1995年；83:129–135.[公共医学][谷歌学者]
  • Jiang C，Fang SL，Xiao YF，O'Connor SP，Nadler SG，Lee DW，Jefferson DM，Kaplan JM，Smith AE，Cheng SE。用脱氧半胱氨酸部分恢复DeltaF508细胞中cAMP刺激的CFTR氯离子通道活性。美国生理学杂志。1998;275：C171–C178。[公共医学][谷歌学者]
  • Johnston AJ、Ward CL、Kopito RR。聚合：错误折叠蛋白质的细胞反应。细胞生物学杂志。1998;143:1883–1898. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 琼斯EW。解决中的蛋白酶问题酿酒酵母。 方法酶制剂。1991年；194:428–454.[公共医学][谷歌学者]
  • Kaiser CA，Schekman R.分泌途径早期，不同组SEC基因控制运输囊泡的形成和融合。单元格。1990;18:723–733.[公共医学][谷歌学者]
  • Knittler MR、Dirks S、Haas IG。参与内质网中蛋白质降解的分子伴侣：热休克同源蛋白BiP与内质网中降解的部分折叠免疫球蛋白轻链的定量相互作用。美国国家科学院程序。1995年；92:1764–1768. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Le A、Steiner JL、Ferrell GA、Shaker JC、Sifers RN。calnexin与人α1-抗胰蛋白酶分泌不全变体之间的关联。生物化学杂志。1994;268:7514–7519.[公共医学][谷歌学者]
  • Lee DH，Sherman MY，Goldberg AL.分子伴侣Ydj1参与泛素依赖性的短命和异常蛋白质降解酿酒酵母.分子细胞生物学。1996;16:4773–4781. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Loayza D，Tam A，Schmidt WK，Michaelis S.Ste6p突变体从内质网（ER）退出缺陷揭示了内质网质量控制途径在酿酒酵母.分子生物学细胞。1998;9:2767–2784. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Loo MA、Jensen TJ、Cui L、Hou Y、Chang XB、Riordan JR。Hsp90与新生CFTR相互作用的扰动阻止其成熟，并通过蛋白酶体加速其降解。EMBO J。1998;17:6879–6887. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lukacs GL、Mohamed A、Kartner N、Chang XB、Riordan JR、Grinstein S。CFTR的构象成熟，但不是其突变对应物（ΔF508）发生在内质网中，需要ATP。EMBO J。1994;13：6076–6086。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mayer TU，Braun T，Jentsch S.蛋白酶体在短寿命内质网跨膜蛋白膜提取中的作用。EMBO J。1998;17:3251–3257. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McCracken AA，Brodsky JL。体外组装ER相关蛋白降解：对胞浆、钙连蛋白和ATP的依赖性。细胞生物学杂志。1996;132:291–298. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McGee TP，Cheng HH，Kumagai H，Omura S，Simoni RD。内质网膜中3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的降解因蛋白质水解敏感性增加而加快。生物化学杂志。1996;271:25630–25638.[公共医学][谷歌学者]
  • Meacham GC、Lu Z、King S、Sorscher E、Tousson A、Cyr DM。Hdj-2/Hsc70伴侣对促进CFTR生物发生的早期步骤。EMBO J。1999;18:1492–1505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Miao B、Davis J、Craig EA。Hsp70家族-概述。收录：Gething MJ，编辑。分子伴侣和蛋白质折叠催化剂指南。英国牛津：牛津大学出版社；1997年，第3-13页。[谷歌学者]
  • Moriyama T，Sather SK，McGee TP，Simoni RD。HMG-CoA还原酶的体外降解。膜结合半胱氨酸蛋白酶在膜域中的裂解。生物化学杂志。1998;273:22037–22043.[公共医学][谷歌学者]
  • Mullins C，Lu Y，Campbell A，Fang H，Green N。一种影响信号肽酶的突变抑制了酿酒酵母.生物化学杂志。1995年；270:17139–17147.[公共医学][谷歌学者]
  • Nishikawa S，Hirata A，Nakano A.抑制内质网（ER）到高尔基体的转运会导致内质网内结合蛋白（BiP）的重新定位，从而形成BiP小体。分子生物学细胞。1994;5:1129–1143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ng DTW，Spear ED，Walter P.未折叠蛋白反应调节分泌和膜蛋白生物生成以及内质网质量控制的多个方面。细胞生物学杂志。2000;150:77–88. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Parlati F、Dominguez M、Bergeron JJ、Thomas DY。酿酒酵母CNE1编码内质网（ER）膜蛋白，其序列与钙蛋白酶和钙网蛋白相似，并作为内质网质量控制装置的组成部分。生物化学杂志。1995年；270:244–253.[公共医学][谷歌学者]
  • Pfund C、Lopez-Hoyo N、Ziegelhover T、Schilke BA、Lopez Buesa P、Walter WA、Wiedmann M、Craig EA。分子伴侣Ssb来自酿酒酵母是核糖体上升链复合物的组成部分。EMBO J。1998;17:3981–3989. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pilon M，Schekman R，Römisch K.Sec61p调节错误折叠的分泌蛋白从内质网向胞浆的输出以进行降解。EMBO J。1997;16:4540–4548. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ping S、Riordan JR、Williams DB。内质网伴侣calnexin（p88，IP90）参与囊性纤维化跨膜电导调节器的生物发生。生物化学杂志。1994;269:12784–12788.[公共医学][谷歌学者]
  • Plemper RK、Bohmler S、Bordallo J、Sommer T、Wolf DH。突变分析将易位子和BiP与ER降解的蛋白质逆行转运联系起来。自然。1997;388：891–895。[公共医学][谷歌学者]
  • Plemper RK、Daek PM、Otto RT、Wolf DH。从内质网内腔侧重新注入转座子。突变羧肽酶yscY物种的研究。FEBS信函。1999;443:241–245.[公共医学][谷歌学者]
  • Plemper RK、Egner R、Kuchler K、Wolf DH。突变的ATP-结合盒转运体Pdr5的内质网降解在Sec61和蛋白酶体的协同作用下进行。生物化学杂志。1998;273:32848–32856.[公共医学][谷歌学者]
  • Plemper RK，Wolf DH。逆行蛋白易位：健康和疾病中分泌蛋白的ERADiction。生物化学科学趋势。1999;24:266–270.[公共医学][谷歌学者]
  • Pringle JR、Preston RA、Adams AE、Stearns T、Drubin DG、Haarer BK、Jones EW。酵母荧光显微镜法。方法细胞生物学。1989;31:357–435.[公共医学][谷歌学者]
  • Qu D、Teckman JH、Omura S、Perlmutter DH。内质网中突变分泌蛋白α1-抗胰蛋白酶Z的降解需要蛋白酶体活性。生物化学杂志。1996;271:22791–22795.[公共医学][谷歌学者]
  • Riordan JR、Rommens JM、Kerem B、Alon N、Rozmahel R、Grzelczak Z、Zielinski J、Lok S、Plavsic N、Chou JL、Drumm ML、Iamuzzi MC、Collin FS、Tsui LC。囊性纤维化基因的鉴定：互补DNA的克隆和表征。科学。1989;245:1066–1073.[公共医学][谷歌学者]
  • Römisch K.浏览Sec61通道：穿过ER膜的双向蛋白质移位。细胞科学杂志。1999;112:4185–4191.[公共医学][谷歌学者]
  • Rubenstein RC，Zeitlin PL.4-苯基丁酸钠下调Hsc70：对ΔF508-CFTR细胞内转运的影响。美国生理学杂志《细胞生理学》。2000;278：C259–C267。[公共医学][谷歌学者]
  • Sawa T、Imamura T、Haruta T、Sasaoka T、Ishiki M、Takata Y、Morioka H、Ishihara H、Usui I、Kobayashi M.Hsp70家族分子伴侣和突变胰岛素受体：BiP的差异结合特异性。Hsp70/Hsc70决定胰岛素受体的积累或降解。生物化学与生物物理研究委员会。1996;218:449–453.[公共医学][谷歌学者]
  • Schmitz A，Maintz M，Kehle T，Herzog V。对错误折叠的胰岛素原进行体内碘化，可揭示BiP结合和ER降解的共定位信号。EMBO J。1995年；14:1091–1098. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stirling CJ、Rothblatt J、Hosobuchi M、Deshaies R、Schekman R。在将完整膜蛋白插入内质网时出现缺陷的蛋白质易位突变体。分子生物学细胞。1992;三:129–142. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Strickland E、Qu BH、Millen L、Thomas PJ。分子伴侣Hsc70协助囊性纤维化跨膜电导调节器N末端核苷酸结合域的体外折叠。生物化学杂志。1997;272:25421–25424.[公共医学][谷歌学者]
  • Umebayashi K、Hirata A、Fukuda R、Horiuchi H、Ohta A、Takagi M。错误折叠的蛋白质聚集体的积累导致酵母中形成罗素体样扩张内质网。酵母。1997;13:1009–1020.[公共医学][谷歌学者]
  • van Oene M，Lukacs GL，Rommens JM。囊性纤维化突变导致羧基末端片段，这突出了囊性纤维化跨膜传导调节因子的早期生物发生步骤。生物化学杂志。2000;275：19577年至19584年。[公共医学][谷歌学者]
  • Voges D，Zwickl P，Baumeister W.26S蛋白酶体：用于控制蛋白质水解的分子机器。生物化学年度收益。1999;68:1015–1068.[公共医学][谷歌学者]
  • Ward CL、Omura S、Kopito RR。泛素蛋白酶体途径对CFTR的降解。单元格。1995年；83:121–127.[公共医学][谷歌学者]
  • Werner ED、Brodsky JL、McCracken AA。蛋白酶体依赖性内质网相关蛋白降解：一条通往熟悉命运的非传统途径。美国国家科学院程序。1996;93:13797–13801. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Werner-Washburne M、Stone DE、Craig EA。hsp70基因基本亚家族成员之间的复杂相互作用酿酒酵母.分子细胞生物学。1987;7:2568–2577. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wiertz EJ、Tortorella D、Bogyo M、Yu J、Mothes W、Jones TR、Rapoport TA、Ploegh HL。Sec61介导膜蛋白从内质网转移到蛋白酶体进行破坏。自然。1996;384:432–438.[公共医学][谷歌学者]
  • Wigley WC、Fabunmi RP、Lee MG、Marino CR、Muallem S、DeMartino GN、Thomas PJ。蛋白酶体机械与中心体的动态关联。细胞生物学杂志。1999;145:481–490. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wikstrom L，Lodish HF.体外去唾液酸糖蛋白受体亚单位的内质网降解。内质网的水泡运输是不必要的。生物化学杂志。1992;267:5–8.[公共医学][谷歌学者]
  • Wileman T，Kane LP，Terhorst C.半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制内质网中T细胞受体链的降解。Cell Regul公司。1991年；2:753–765. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wilhovsky S、Gardner R、Hampton R。人力资源部内质网相关降解的基因依赖性。分子生物学细胞。2000;11:1697–1708. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wright R，Basson M，D'Ari L，Rine J.增加HMG-CoA还原酶的量会诱发“karmellae”，即围绕酵母细胞核的堆叠膜对的增殖。细胞生物学杂志。1988;107：101–114。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xiong X、Chong E、Skach WR。有证据表明，内质网（ER）相关的囊性纤维化跨膜电导调节器降解与ER膜逆行移位有关。生物化学杂志。1999;274:2616–2624.[公共医学][谷歌学者]
  • Yang Y，Janich S，Cohn JA，Wilson JM。囊性纤维化跨膜电导调节器的常见变体被hsp70识别，并在高尔基体前非溶酶体室中降解。美国国家科学院程序。1993;90:9480–9484. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yu H，Kaung G，Kobayashi S，Kopito RR。蛋白酶体对T细胞受体α链的细胞溶胶降解。生物化学杂志。1997;272:20800–20804.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhang Y、Michaelis S、Brodsky JL。酵母中CFTR表达和ER相关降解。收录人：Skach WR，编辑。囊性纤维化的方法和方案，分子医学方法。新泽西州托托瓦：Humana出版社；2001年(出版中). [公共医学][谷歌学者]
  • 周M，费希尔EA，金斯伯格HN。载脂蛋白B100的调节共翻译泛素化。生物化学杂志。1998;273:24649–24653.[公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由提供美国细胞生物学学会